Name: Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Impara il metodo pulse-chase radioattivo con 35S-metionina e cisteina per analizzare la biosintesi proteica in cellule viventi. Questa tecnica consente di studiare piegatura, trasporto e degradazione proteica con elevata sensibilità.

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Gli autori ringraziare tutti i membri del laboratorio Braakman, passato e presentano, per le loro discussioni fruttuose e aiutano a sviluppare i metodi presentati in questo articolo. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma quadro (FP7/2007-2013) N ° dell'Unione europea 235649 e i Paesi Bassi organizzazione della ricerca scientifica (NWO) sotto il programma ECHO-N ° 711.012.008.

Tutti i reagenti radioattivi ed erano gestite conformemente alle norme e regolamenti di radiazione locali Università di Utrecht.
1. pulse Chase
<ol><li>
Inseguimento di impulso per le cellule aderenti Nota: I volumi qui riportati sono basati su piastre di coltura cellulare di 60 mm. Per piatti di 100 mm o 35 mm, moltiplicare i volumi da 1/2 o 2, rispettivamente. Questo protocollo utilizza un tempo di impulso di 10 min e chase volte di 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Questi può essere variati a seconda le proteine specifiche in fase di studio (discusse sotto).<ol>
<li>Semi di cellule aderenti (ad es., HEK 293, HeLa, CHO) in sei piastre di coltura delle cellule di mm 60 affinché siano subconfluent (80% - 90%) il giorno della caccia impulso. Utilizzare almeno un piatto al punto di tempo e/o condizione.</li>
		<li>Se necessario, transfect le cellule con i reagenti di transfezione commercialmente disponibili secondo le istruzioni del produttore; in alternativa, viralmente trasdurre8 cellule 1 giorno prima la pulse-chase sperimentare con il costrutto appropriato per l'espressione.</li>
		<li>Lavare i piatti con 2 mL di tampone di lavaggio (Hank equilibrata soluzione salina [HBSS]), aggiungere 2 mL di terreno di inedia (normale mezzo di coltura privo di metionina e cisteina e siero bovino fetale [FB], come minimo mezzo essenziale [MEM] senza metionina e cisteina ma con 10 mM HEPES, pH 7.4) e mettere i piatti in un incubatore 37 ° C con 5% CO2 per 15 min.</li>
		<li>Trasferire i piatti per i rack in un bagno di acqua preriscaldata 37 ° C in modo che sono a contatto con acqua, ma non galleggiano. Avviare un timer.</li>
		<li>40 s, aspirare il mezzo di inedia, redigere 600 µ l di soluzione di impulso (media di inedia + 55 µ ci/35 mm piatto label, vedere la nota precedente punto 1.1.1) nella pipetta e aggiungerlo delicatamente al centro del piatto in esattamente 1 minuto Ripeti questo passaggio a intervalli di 1 min per t piatti rimanenti di lui. Iniziare con il campione di inseguimento più lungo per risparmiare tempo durante l'esperimento. Nota: Durante la manipolazione di materiale radioattivo, è essenziale seguire le precauzioni appropriate e regolamenti per prevenire l'esposizione accidentale e/o contaminazione locale.</li>
		<li>A esattamente 11 min e per tutti i seguenti piatti, fatta eccezione per il campione di chase 0 min, aggiungere 2 mL di terreno di caccia direttamente al piatto, aspirare esso e ancora una volta, aggiungere 2 mL di terreno di caccia. Ripetere questo passaggio a intervalli di 1 min per piatti rimanenti. Trasferire tutti i piatti in un incubatore a 37 ° C.</li>
		<li>A esattamente 16 min, aggiungere 2 mL di terreno di caccia (terreno di coltura normale + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5mm cisteina e metionina 5 mM) direttamente per il piatto di campione 0 min in cima il mezzo di impulso per interrompere etichettatura; quindi, aspirare immediatamente, trasferire il piatto su una lastra di alluminio raffreddato e aggiungere 2 mL di tampone di arresto ghiacciata (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]). Nota: Questo è l'esempio di chase 0 min. Per questo esempio, procedere direttamente al passaggio 1.1.9.</li>
		<li>Trasferire ogni piatto chase torna a bagnomaria 2 min prima ogni chase (ad es., 24 min per un inseguimento 15 min) e, al tempo esatto chase (ad es., 26 min per un inseguimento 15 min), aspirare i media chase (o trasferirlo su un tubo del microcentrifuge se seguito pr secrezione di stabilizzati) e trasferire il piatto su una lastra di alluminio raffreddato. Aggiungere 2 mL di tampone di arresto ghiacciata.</li>
		<li>Incubare tutti i piatti sul ghiaccio nel buffer di stop per ≥ 5 min; aspirare la soluzione di arresto, quindi lavarla con 2 mL di soluzione di arresto ghiacciata. Aspirare il lavaggio e lisare piatti con 600 µ l di tampone di lisi (tampone fosfato salino [PBS] + nondenaturing detergente [vedi Tabella materiali] + inibitori della proteasi + 20mm NEM). Utilizzare un raschietto di cella per garantire che i piatti vengono lisati quantitativamente.</li>
		<li>Trasferire il lisato una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 min a 15.000-20.000 x g e 4 ° C per appallottolare i nuclei.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pulse Chase per cellule in sospensione Nota: Per garantire etichettatura efficiente, dovrebbero essere pulsate cellule ad una concentrazione di 3 x 106 a 5 x 106 cellule/mL e chase volumi dovrebbero essere 4 volte il volume di impulso. Nell'esempio seguente, abbiamo pulsata 5 x 106 cellule in un volume di 1 mL per 10 min, a cedere cinque chase tempo punti (0, 15, 30, 60 e 120 min) da 1 mL, contenente 1 x 106 cellule per punto nel tempo. Tutte le soluzioni sono le stesse della sezione 1.1.<ol>
<li>Coltura le cellule in sospensione (ad es., 3T3, Jurkat) secondo un protocollo precedentemente pubblicato9 in modo che vi sia un numero sufficiente di cellule al momento dell'esperimento, almeno 1 x 106 cellule per tempo punto e/o condizionano.</li>
		<li>Se necessario, transfect cellule con reagenti di transfezione commercialmente disponibili secondo le istruzioni del produttore, o viralmente trasdurre8 cellule 1 giorno prima la pulse-chase sperimentare con il costrutto appropriato per l'espressione.</li>
		<li>A pellet di 5 x 106 cellule per condizione in una provetta da 50 mL per 5 min a 250 x g a temperatura ambiente, lavarli 1 x 5 ml di media di inedia, appallottolarli nuovamente e li risospendere in 1 mL di media di inedia.</li>
		<li>Trasferire le cellule a bagnomaria a 37 ° C ed incubare li per 10-25 min. Agitare i tubi ogni 10-15 minuti per impedire le cellule di depositarsi sul fondo.</li>
		<li>Avviare il timer. A esattamente 1 min, aggiungere 275 µ ci (55 µ ci/1 x 106 cellule) dell'etichetta non diluito direttamente nella provetta contenente cellule e per mescolare. Nota: Durante la manipolazione di materiale radioattivo, è essenziale seguire le precauzioni appropriate e regolamenti per prevenire l'esposizione accidentale e/o contaminazione locale.</li>
		<li>A esattamente 11 min, smettere di etichettatura con l'aggiunta di 4 mL di terreno di caccia. Mescolare il campione e immediatamente trasferire 1 mL in una provetta da 15 mL sul ghiaccio, contenente 9 mL di soluzione di arresto ghiacciata. Nota: Questo è l'esempio di chase 0 min.</li>
		<li>Ripetere questi passaggi per ogni punto di tempo successivi. Una volta sono raccolti tutti i punti di tempo, agglomerare le cellule per 5 min a 250 x g a 4 ° C. Aspirare il mezzo (o trasferirlo in una provetta da 15 mL nuovo se seguendo la secrezione della proteina). Lavare le cellule con 5 mL di soluzione di arresto e agglomerare le cellule per 5 min a 250 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirare la soluzione di arresto, completamente lisare le cellule con 300 µ l di tampone di lisi ghiacciata e li Incubare per 20 minuti sul ghiaccio per garantire una lisi completa. Trasferire il lisato una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 10 min a 15.000-20.000 x g a 4 ° C per appallottolare i nuclei.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. immunoprecipitazione
<ol><li>Combinare l'anticorpo (Vedi la discussione) e 50 µ l di immunoprecipitazione Perline (ad es., proteina un-Sepharose della) (10% sospensione [v/v] in tampone di lisi + 0,25% di sieroalbumina bovina [BSA]) in una microcentrifuga tube e li Incubare a 4 ° C per circa 30 min in uno shaker.</li>
	<li>A pellet le perline per 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente e aspirare il supernatante. Aggiungere 200 µ l di lisato alla miscela dell'anticorpo-perlina e incubare a 4 ° C in un agitatore per 1 h o testa-testa-se richiede l'immunoprecipitazione > 1 h.</li>
	<li>A pellet le perline per 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di immunoprecipitazione. Il campione viene posto in uno shaker a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Le perline il pellet come descritto al punto 2.3 e ripetere il lavaggio 1X. Quindi, aspirare il supernatante e risospendere le sfere in 20 µ l di buffer di TE, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortexare il campione.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di 2x buffer del campione senza l'agente riduttore, vortice, riscaldare per 5 minuti a 95 ° C e vortexare ancora. Nota: se solo preparazione campioni riducentesi, 2 µ l di 500 mM DTT deve essere aggiunto a questo punto. Quindi, procedere al punto 2.7.</li>
	<li>Pellet, le perle come descritto al punto 2.3. 19 µ l del surnatante nonreduced di trasferimento ad un tubo del microcentrifuge fresco contenente 1 µ l di 500 mM DTT, centrifugare il campione e vortice prima riscaldarla nuovamente per 5 min a 95 ° C.</li>
	<li>Rotazione verso il basso il campione per 1 min a 12.000 x g; si tratta di campione ridotto. Raffreddare fino a temperatura ambiente e aggiungere 1,1 µ l di 1 M NEM sia ridotto e l'esempio di nonreduced. Vortex e centrifugare i campioni.</li>
</ol>3. SDS-PAGE
<ol><li>In primo luogo, determinare l'appropriata percentuale di gel di risoluzione SDS-PAGE per la proteina di interesse. Ad esempio, gp120 di HIV-1, quando deglicosilata, corre a ~ 60 kDa ed è analizzato in un gel di 7,5%.</li>
	<li>Preparare la miscela di gel di risoluzione senza TEMED secondo le istruzioni del produttore (x % di acrilammide, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] 0,1% SDS [p/v] e 0.05% ammonio persolfato [APS] [p/v]) e degassare sotto vuoto per > 15 min. Mentre la miscela di gel è degasaggio, pulire le piastre di vetro di gel con etanolo al 70% e privo di lanugine tessuti e inserirli in un apparato di colata.</li>
	<li>Aggiungere TEMED per la miscela di gel di risoluzione (a una concentrazione finale di 0,005% [v/v]), mescolare accuratamente e pipettare tra lastre di vetro, lasciando uno spazio di ~1.5 cm per il gel d'impilamento. Attentamente il gel con deionizzata H2O o isopropanolo di sovrapposizione e lasciarlo a polimerizzare.</li>
	<li>Una volta che il gel di risoluzione ha polimerizzato, preparare la miscela di gel di impilamento (4% di acrilammide, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 0,1% SDS [p/v] e 0.025% APS [p/v]).</li>
	<li>Lavare la parte superiore del gel di risoluzione con deionizzata H2O e, successivamente, togliere tutta l'acqua. Nota: Utilizzare carta da filtro per rimuovere le ultime gocce.</li>
	<li>Aggiungere TEMED per la miscela di gel di impilamento (0,005% [v/v]), mescolare accuratamente e il gel di risoluzione con gel d'impilamento di sovrapposizione e inserire un pettine 15-pozzo. Una volta che il gel d'impilamento ha polimerizzato, trasferirlo in una camera di esecuzione e riempire le camere superiori e inferiori con tampone di corsa (25 mM Tris-HCl, glicina 192 mM [pH 8.3] e 0,1% SDS [p/v]).</li>
	<li>Caricare 10 µ l di campione per corsia in un minigel 15-lane. Evitare di caricare i campioni nella prima e l'ultima corsia sul gel e caricare il buffer del campione non riducente in tutte le corsie vuote per evitare la sorridente delle bande. Eseguire i gel al costante un 25 mA/gel, fino a quando la parte anteriore della tintura è nella parte inferiore del gel.</li>
	<li>Rimuovere il gel da lastre di vetro, macchia i gel con soluzione di macchiatura della proteina (acido acetico al 10% e 30% metanolo in H2O + 0,25% brillante blu R250 [p/v]) per 5 min con agitazione e quindi, decolorare per 30 min con soluzione (colorazione decolorante soluzione senza R250 blu brillante).</li>
	<li>Organizzare i gel a faccia in giù su una plastica avvolgono e, quindi, inserire carta di cromatografia di 0,4 mm in cima loro. Collocare il panino gel cromatografia su carta-lato giù su un gel di asciugatrice. Seguendo le istruzioni del produttore, asciugare il gel per 2 ore a 80 ° C.</li>
	<li>Trasferire i gel secchi su una videocassetta e le rivestirai con schermo pellicola o fosforo autoradiografia. Se si utilizza pellicola autoradiografia, questo passaggio deve essere eseguita in una stanza buia.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Impulso-insegua metodi sono stati essenziali per sviluppare la comprensione degli scienziati del ripiegamento proteico nella cellule intatte. Mentre abbiamo cercato di fornire un metodo che è più generale possibile, questo approccio ha il potenziale per variazioni quasi illimitate di studiare i vari processi che si verificano durante la piegatura, il trasporto e la vita delle proteine all'interno della cellula.
Quando si esegue un inseguimento di impulso utilizzando cellule aderenti nei piatti...

La piegatura delle anche relativamente semplice proteine coinvolge molti diversi enzimi pieghevoli, chaperoni molecolari e modificazioni covalenti1. Una ricostituzione completa di questi processi in vitro è praticamente impossibile, dato il vasto numero di differenti componenti coinvolti. È altamente auspicabile, pertanto, per studiare il folding delle proteine in vivo, in cellule vive. Impulso-insegua radioattivo tecniche rivelarsi uno strumento potente per studiare la sintesi, pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine nel loro ambiente naturale.
Il metabolica etichettatura delle proteine durante un breve impulso con 35S-labeled metionina/cisteina, seguita da un inseguimento in assenza di un'etichetta radioattiva, permette il rilevamento specifico di una popolazione di proteine appena sintetizzate nel più ampio ambiente cellulare. Quindi, proteine bersaglio possono essere isolato tramite immunoprecipitazione e analizzati tramite SDS-PAGE o altre tecniche. Per molte proteine, il loro viaggio attraverso la cella è segnata da modifiche che sono visibili su gel di SDS-PAGE. Ad esempio, il trasporto di proteine glicosilate dal reticolo endoplasmatico (ER) al complesso di Golgi è spesso accompagnato da modifiche dei glycans N-collegati o l'aggiunta di glicani O-collegata2,3. Queste modifiche causare grandi aumenti nella massa molecolare apparente, che può essere visto dai cambiamenti di mobilità in SDS-PAGE. Maturazione può anche essere contrassegnato da fenditure proteolitici, come fenditura del peptide di segnale o la rimozione di pro-peptidi, conseguente cambiamenti nella apparente massa molecolare che possono essere seguite facilmente su gel di SDS-PAGE4. Radioattività ha notevoli vantaggi rispetto alle tecniche comparabili come inseguimenti cicloesimmide, dove sintesi proteica romanzo è impedita, come trattamenti di lunga durata sono tossici per le cellule e non escludono la maggior parte delle proteine più vecchio, allo steady-state dalla analisi, come alcune proteine hanno emivite di giorni. Il confronto di proteine sotto entrambi non riducente e condizioni riducenti permette l'analisi della formazione di legami disolfuro, un passo importante nella piegatura di molte proteine secretorie4,5,6, 7.
Qui descriviamo un metodo generale per l'analisi del protein folding e trasporto in cellule intatte, utilizzando un approccio di impulso-insegua radioattivo. Mentre abbiamo l'obiettivo di fornire il metodo come dettagliato possibile, il protocollo ha un potenziale quasi illimitato per adattabilità e permetterà di ottimizzazione studiare le proteine specifiche di ogni lettore.
Sono disponibili due protocolli alternativi pulse-chase, uno per cellule aderenti (passo 1.1 del protocollo presentato qui) e uno per cellule in sospensione (punto 1.2 del protocollo presentato qui). Le condizioni di cui qui sono sufficienti per visualizzare una proteina espressa con livelli di medio-alta espressione. Se il lettore sta lavorando con proteine mal espresse o varie condizioni dopo trattamento, quali immunoprecipitati multiple, è necessario aumentare le dimensioni del piatto o numero di cellulare in modo appropriato.
Per chase di impulso di sospensione, i campioni di chase prelevati in ogni momento sono tutti presi da un singolo tubo di cellule. Le fasi di lavaggio dopo l'impulso vengono omessi; invece, ulteriore incorporazione di 35S è impedita da diluizione con un elevato eccesso di adenoida metionina e cisteina.
I protocolli presentati utilizzano radioattivo 35S-labeled cisteina e metionina per seguire processi di folding delle proteine cellulari. Tutte le operazioni con i reagenti radioattivi devono essere eseguite utilizzando adeguate misure di protezione per ridurre al minimo qualsiasi esposizione dell'operatore e dell'ambiente di radiazione radioattiva ed essere eseguite in un laboratorio designato. Come la pulse-chase etichettatura tecnica è relativamente inefficiente a volte di impulso corto (< 15 min), meno di 1% dell'importo iniziale di radioattività è incorporato nelle proteine recentemente sintetizzate. Dopo l'arricchimento della proteina tramite immunoprecipitazione destinazione, il campione per SDS-PAGE contiene meno dello 0.05% della quantità iniziale di radioattività.
Anche se il 35S metionina e cisteina etichettatura mix è stabilizzato, si verificherà alcune decomposizione, producendo composti radioattivi volatili. Per proteggere il ricercatore e l'apparato, dovrebbero essere prese alcune precauzioni. Il ricercatore deve sempre obbedire alle regole di sicurezza di radiazione locale e può indossare un carboncino maschera, oltre a un camice da laboratorio e guanti (doppie) di professione d'infermiera. Stock flaconcini con 35S metionina e cisteina devono sempre essere aperto in una cappa, o sotto un punto di aspirazione locale. Macchie di contaminazione noto laboratorio sono centrifughe, pipette, bagni d'acqua, incubatori e agitatori. La contaminazione di queste aree è ridotto mediante l'utilizzo di puntali per pipette con un filtro al carbone, positivo-seal per microcentrifuga (Vedi Tabella materiali), Acquario carbone spugne in acqua bagni, carbone filtri di carta incollati nei piatti pulse-chase, guardia del carbone di legna nel sistema di aspirazione e il posizionamento dei piatti che contiene granelli di carbone di legna in incubatrici e contenitori di stoccaggio.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga safeseal da 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>acido acetico glaciale</td></tr><tr><td>BAS Schermo al fosforo di stoccaggio 20x25 cm</td><td>GE Life Sciences</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Blu Bromofenolo</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Carestream Biomax Pellicole MR</td><td>Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di coltura cellulare</td><td>Vari</td><td>N/A</td><td>Terreni di coltura cellulare normali per specifiche linee cellulari utilizzate</td></tr><tr><td>Terreni di coltura cellulare, senza metionina/cisteina</td><td>Vari</td><td>N/A</td><td>Stessa formulazione dei terreni di coltura normali, ad esempio DMEM/MEM/RPMI, privi di metionina e cisteina</td></tr><tr><td>Carta da filtro al carbone</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette filtrati al carbone</td><td>Molecolare bioproducts</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>Antracite vacu-guard</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>per elettroforesi</td></tr><tr><td>Cisteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>Grado di biologia molecolare, Produci 500 mM di magazzino, conservare a -20&nbsp;</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S Miscela di etichettatura delle proteine</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>Sono disponibili lotti di etichette di altre dimensioni a seconda dell'uso</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Attrezzatura per l'essiccazione dei gel</td><td>Vari</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Carta</td></tr> per <tr><td>cromatografia di grado 3</td> di biologia molecolare <td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes salviette per attività delicate</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>Grado di biologia molecolare, Marca 250 mM di magazzino, conservare a -20</td></tr><tr><td>Attrezzature per la fusione/esecuzione di Minigel</td><td>Vari</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>Grado di biologia molecolare, Produci 1 milione di stock in etanolo al 100%, conservare a -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteina-A Sepharose di grado di biologia molecolare perle fastflow</td><td>GE health-care</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Base Trizma (Tris)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Tifone IP Imager biomolecolare</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire Rack per provette 20 mm per bagnomaria</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo pulse chase

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Impulso-insegua radioattivo etichettatura è un potente strumento per lo studio della maturazione conformazionale, il trasporto a loro posizione cellulare funzionale e la degradazione di proteine in cellule vive. Utilizzando radiolabeling tempi brevi (impulso) (< 30 min) e strettamente controllato chase volte, è possibile aggiungere etichette solo una piccola frazione della piscina della proteina totale e seguire sua pieghevole. Quando combinato con non riducente/riducendo l'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e immunoprecipitazione con anticorpi (conformazione-specifici), processi di piegatura può essere esaminato in dettaglio. Questo sistema è stato utilizzato per analizzare il ripiegamento di proteine con una variazione enorme in proprietà quali proteine solubili, proteine transmembrana singole e multi-pass, pesantemente N - e O-glicosil proteine e proteine con e senza bisolfuro di vasto incollaggio. Impulso-insegua metodi sono alla base di studi cinetici in una gamma di funzionalità aggiuntive, tra cui co - e modifiche di posttranslational, oligomerizzazione e polimerizzazione, essenzialmente che consente l'analisi di una proteina dalla nascita alla morte. Impulso-Insegua gli studi sul folding delle proteine sono complementari con altri metodi biochimici e biofisici per lo studio delle proteine in vitro , fornendo una maggiore risoluzione temporale e informazioni fisiologiche. I metodi come descritto all'interno di questa carta sono adattati facilmente per studiare la piegatura di quasi tutta la proteina che può essere espressa nei sistemi mammiferi o insetto-cella.

La piegatura e la secrezione di gp120 di HIV-1 da un inseguimento di impulso aderente è illustrato nella Figura 2. Il gel non riducente (cellule NR nella figura) viene illustrato il folding ossidativo di gp120. Immediatamente dopo l'impulso di etichettatura di gp120 5 min (0 min chase) appare come una banda diffusa superiore nel gel, e col progredire della chase, la band migra verso il basso il gel attraverso ancora più diffusa pieghevole intermedi (IT) fino ...

Qui descriviamo un protocollo per un metodo generale di pulse-chase che permette l'analisi cinetica di pieghevole, trasporto e degradazione delle proteine da seguire in cellule vive.

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

L'inseguimento di impulsi radioattivi utilizzando 35 methionine e cisteina etichettate con S è ancora l'unico modo biochimico per studiare la biosintesi proteica con il tempo nelle cellule vive. La biosintesi proteica copre sia la traduzione, la piegatura e l'assemblaggio, sia il traffico e il degrado. Combinare l'inseguimento dell'impulso radioattivo con l'analisi delle modifiche delle proteine co-e post-traslazione, come la formazione del legame disolfuro e l'acetilazione fornisce un saggio sensibile e quantitativo per indagare la fede della proteina con il tempo.Per questa procedura è necessaria una buona messa a fuoco e una manipolazione sperimentale. Una buona preparazione è fondamentale, come i buffer, lo spazio di lavoro radioattivo e una pianificazione chiara. Questo video fornisce una visione chiara sopra la spalla del protocollo di inseguimento a impulsi radioattivi.A dimostrare la procedura sarà Hui Ying Yeoh, un candidato pHd del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, seed transfect e cellule di coltura come delineato nel protocollo di testo. Prima dell'inseguimento a impulsi, ispezionare le cellule attraverso il microscopio.Quindi, lavare i piatti con due millilitri di tampone di lavaggio. E due millilitri di mezzo di fame per le cellule e mettere i piatti in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 15 minuti. Assicurati che la tua configurazione di inseguimento a impulsi sia in ordine.Trasferire i piatti alle rastrelliere nel bagno d'acqua, preri warmed a 37 gradi Celsius. Assicurarsi che i piatti siano a contatto con l'acqua, ma non galleggiare. Quindi, avvia un timer.A 40 secondi, aspirare il mezzo di fame. Utilizzando un micro pipet, disegnare 600 microlitri di soluzione di impulso. Esattamente un minuto, aggiungere delicatamente la soluzione di impulso al centro del piatto.Ripetere questo processo di rimozione del mezzo di fame e aggiungere la soluzione di impulso per i piatti rimanenti a intervalli di un minuto. Esattamente a 11 minuti e per tutti i piatti successivi, secondo lo schema di inseguimento a impulsi, ad eccezione del campione di inseguimento di zero minuti, aggiungere due millilitri di mezzo di inseguimento direttamente al piatto. Aspirare il mezzo di inseguimento e sostituirlo con due millilitri di mezzo di inseguimento fresco.Ripetere questo processo per tutti i piatti rimanenti a intervalli di un minuto. Quando il timer legge esattamente 16 minuti, aggiungi due militer di mezzo di inseguimento direttamente al piatto di inseguimento di zero minuti, sopra il mezzo di impulso, per interrompere l'etichettatura. Aspirare immediatamente il mezzo.Trasferire il piatto su una piastra di alluminio raffreddata e aggiungere due militers di tampone di arresto freddo ghiaccio. Trasferisci tutti gli altri piatti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Trasferisci ogni piatto di inseguimento dall'incubatrice al bagno d'acqua due minuti prima della fine di ogni tempo di inseguimento.All'esatto tempo di inseguimento per ogni piatto, aspira il mezzo di inseguimento e trasferisci il piatto su una piastra di alluminio raffreddata. Aggiungere due millilitri di tampone di arresto freddo ghiaccio. Lasciare tutti i piatti sul ghiaccio e fermare il buffer fino a quando non c'è tempo per lelizzare le cellule.Quindi aspirare la soluzione di arresto e lavare tutti i piatti. Tre contemporaneamente con due millilitri di soluzione di arresto del freddo ghiacciato. Aspirare completamente la soluzione di arresto e aggiungere 600 microlitri di tampone di lysis a due piatti alla volta.Utilizzando un raschietto per celle, raschiare accuratamente la superficie del piatto, ma delicatamente per mescolare il lisato. Trasferire il lysate da ogni piatto a un tubo di micro centrifuga fresco da 1,5 millilitri. Centrifuga a 15.000-20.000 G a quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare i nuclei.Per l'inseguimento a impulsi sulle celle di sospensione raccolta cinque milioni di celle per punto di tempo in un tubo da 50 millilitri. Eseguire la procedura di fame come descritto nel testo. Dopo la procedura di fame nel bagno d'acqua per 15 minuti, avviare il timer.Esattamente in un minuto, aggiungere 275 microcuries di etichetta non diluita direttamente al tubo contenente celle e ruotare per mescolare. Esattamente a 11 minuti, aggiungi quattro millilitri di mezzi di inseguimento per fermare l'etichettatura. E trasferire immediatamente un millilitro in un tubo da 15 millilitri su ghiaccio che contiene nove millilitri di soluzione di arresto freddo del ghiaccio per interrompere l'etichettatura.Ripetere questo processo di trasferimento di un millilitro di inseguimento in un tubo su ghiaccio contenente nove millilitri di soluzione di arresto per ogni successivo punto di inseguimento. Dopo l'immunoprecipitazione, aspirare completamente l'ultimo lavaggio. Sospendere di nuovo le perline in 20 microlitri di tampone e vortice TE.Aggiungere 20 microlitri di due X tampone campione senza l'agente riducente. Vortice i campioni e poi scaldarli a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Vortice i campioni di nuovo.Centrifuga a 12.000 volte G a temperatura ambiente per un minuto. Trasferire 19 microlitri del supernatante non ridotto in un tubo di microcentrifugo fresco che contiene un microlitro di DDT da 500 millimolare. Se necessario, centrifugare rapidamente il campione in modo che tutti i liquidi si trovano nella parte inferiore.E riscaldare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Lasciare raffreddare il campione ridotto e quindi vortice. Centrifugare entrambi i campioni ridotti e non ridotti a 12.000 volte G a temperatura ambiente per un minuto, quindi aggiungere 1,1 microlitri di un NEM molare a tutti i campioni.In questo studio, un approccio di inseguimento di impulsi radioattivi viene utilizzato per analizzare il ripiegamento delle proteine e il trasporto in cellule intatte. La piegatura e la secrezione dell'HIV un GP120 da un inseguimento a impulsi aderenti è mostrato qui. Il gel non riducente mostra la piegatura ossidativa di GP120.Immediatamente dopo l'etichettatura degli impulsi, appare come una banda diffusa più in alto nel gel. Man mano che l'inseguimento procede, la banda migra lungo il gel attraverso intermedi pieghevoli ancora più diffusi fino ad accumularsi nella banda stretta che rappresenta nativamente piegata alla GP120. Ciò si verifica quando la formazione di legami disolfuro aumenta la compattezza della proteina, facendola migrare più velocemente della proteina completamente ridotta.Sul gel riducente, i legami disolfuro e tutte le molecole sono stati ridotti e non influenzano la mobiilty. Come tale, le differenze nella mobilità sono solo il risultato di cambiamenti nella massa molecolare. Lo spostamento nel tempo dalla forma ridotta del peptide peptidico del segnale alla forma ridotta di scissione del peptide del segnale rappresenta la scissione peptidica del segnale post-traslazione di GP120.La mobilità aumenta a causa della perdita del peptide del segnale che aumenta durante l'inseguimento man mano che più proteine raggiungono la piega nativa e perdono il loro peptide di segnale. Sia sul gel non riducente che su quello riducente, il segnale inizia a diminuire da circa un'ora in poi a causa della secrezione di GP120. Questo può essere monitorato analizzando i media.Questo metodo è applicabile a qualsiasi linea cellulare, inclusi i modelli di cellule organoidi. Ma il successo dipende molto dal livello di espressione della proteina di interesse. Prima di iniziare questa procedura, contrassegnare i piatti e mantenere questo ordine per tutto l'esperimento.Assicurati che tutto sia preparato prima di aggiungere il mezzo di fame. Questo è l'inizio dell'esperimento. E il tuo tempo di laboratorio è tuo amico, ma può essere il tuo più grande nemico quando non sei preparato.L'inseguimento di Bill può essere combinato con una proteolisi limitata per indagare l'intera tenuta di proteine con il tempo. Inoltre, diversi metodi di congelatore eletti consentiranno l'analisi del risciacquo o del rigormorizzazione o delle differenze di carica. Per proteggere il ricercatore e l'apparato, tutte le norme locali sulla sicurezza delle radiazioni devono essere rispettate.E le misure di protezione dovrebbero essere prese secondo il protocollo. Si noti che l'acrilammide, utilizzata per la pagina STH, è neurotossica.

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