Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry
5 marzo 2019
Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4+ e CD8+ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di espandersi oltre il limite ottico della maggior parte dei citometri di flusso consentendo a un ricercatore di registrare cinque marcatori aggiuntivi per interrogare popolazioni cellulari complesse. Utilizzando questa tecnica, è possibile ottenere un immunofenotipizzazione profonda quando si lavora con uno strumento con un basso numero di rivelatori o campione con un numero limitato di cellule. Iniziare questa procedura trasferendo accuratamente il sangue prelevato in un tubo conico da 50 millilitri.
Diluire il sangue con una quantità uguale di PBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 15 millilitri di gradiente di densità medio al fondo di un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Sovrapporre con cura il sangue diluito sopra il mezzo gradiente di densità, evitando qualsiasi miscelazione tra il mezzo gradiente di densità e il sangue diluito.
Centrifuga a 400 volte g per 30 minuti a temperatura ambiente senza freno per evitare interruzioni dell'interfaccia. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per aspirare e scartare attentamente lo strato superiore, prestando attenzione a non rimuovere le cellule all'interfaccia tra il plasma e il mezzo gradiente di densità. Raccogliere il maggior numero possibile di cellule mononucleari del sangue periferico, o PBBC, dall'interfaccia senza toccare il pellet di globuli rossi nella parte inferiore del tubo conico da 50 millilitri e trasferirlo in un nuovo tubo.
Aggiungere PBS per portare il volume finale a 25 millilitri e invertire più volte per mescolare. Quindi, lavare i PBBC due volte come indicato nel testo. Dopo aver rimosso le piastrine e aver contato i PBPC come descritto nel testo, rimescolare le cellule in PBS, 0,1% di azide di sodio a una concentrazione di una volta 10 alla settima cellule per millilitro.
Per preparare i PBBC per la colorazione, trasferire 100 microlitri di ciascun campione su una piastra inferiore a V da 96 porri. Centrifugare la piastra a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
Ad ogni pozzo, aggiungere 100 microlitri di PBS contenenti un colorante fissabile vivo / morto che reagisce con ammina libera sulle proteine e risospendare attentamente la miscela PBMC. Successivamente, lasciare riposare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente per l'etichettatura delle cellule morte. Per ogni campione, preparare 30 microlitri di una miscela contenente tutti e sette gli anticorpi.
In questa fase, possono essere aggiunti anche anticorpi titorati contro diverse molecole bersaglio e in diversi fluorocromi. Centrifugare la piastra di 96 pozzi a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente e aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere il cocktail di anticorpi ad ogni pozzo e ripreziosare con attenzione senza generare bolle.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo 30 minuti, aggiungere 150 microlitri di tampone di colorazione ad ogni pozzo e centrifugare la piastra a 350 volte g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e rimescolare le cellule in 200 microlitri di PBS.
Le cellule sono ora pronte per l'analisi della citometria del flusso. Gli anticorpi anti-CD3, CD8, CD14, CD19 e TCR gamma delta sono titolazione con una curva dell'indice di colorazione massima. La titolazione degli anticorpi è il passaggio più critico di questo protocollo per identificare correttamente sette sottoinsiemi di cellule immunitarie usando due fluorocromi.
Per preparare una diluizione anticorpale duplice, riempire 10 pozzi di una piastra da 96 porri con 40 microlitri di tampone di colorazione per pozzo. Ai fini di questo video, verrà mostrata solo la titolazione di anti-CD8. Nel primo pozzo, aumentare il volume finale a 80 microlitri di tampone di colorazione e aggiungere anti-CD8 ad una concentrazione quattro volte superiore alla concentrazione suggerita dal produttore.
Mescolare bene e trasferire 40 microlitri al secondo pozzo. Mescolare bene e ripetere questo passaggio per tutti gli altri pozzi. Macchiare 10 campioni di PBBC o sangue intero con 30 microlitri delle 10 diverse diluizioni due volte dell'anti-CD8 seguendo il protocollo dimostrato in precedenza.
Acquisire dati con un citometro di flusso e tracciare il segnale da ogni diluizione. Dopo aver calcolato l'indice di macchia per ciascuna concentrazione di anticorpi come specificato nel testo, tracciare l'indice di macchia rispetto alla concentrazione di anticorpi espressa come frazione della diluizione dell'anticorpo e identificare la concentrazione di anticorpi con il valore massimo dell'indice di macchia. Per titolare gli anticorpi anti-CD4 e anti-CD56, iniziare con la duplice strategia di diluizione dimostrata in precedenza, aggiungendo ulteriori concentrazioni nel mezzo per identificare finemente l'intervallo di concentrazione che consentirà la separazione delle cellule T cd4-positive e delle cellule NK dalle altre popolazioni cellulari.
Titolare l'anticorpo anti-CD4 posizionando il segnale anti-CD4 tra il doppio segnale CD8-positivo, CD3-positivo e la singola popolazione positiva CD3. Titolare l'anticorpo anti-CD56 seguendo una strategia simile alla titolazione anticorpale anti-CD4, posizionando le cellule NK tra le popolazioni CD3-negative e CD3-positive. Per iniziare questa strategia di gating a due fluorocromi, a sette marcatori, selezionare il cancello dei linfociti e creare un grafico a punti con uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo su ciascun asse.
Gate su cellule T cd8-positive identificate come cellule doppie positive CD3 e CD8 nell'angolo in alto a destra del grafico a punti. Escludere la popolazione di CD8 fioca che potrebbe contenere celle NKT. Gate su cellule T positive cd4 identificate come la popolazione tra le cellule T cd8-positive e le singole popolazioni positive cd3.
Gate su cellule gamma delta T identificate come cellule CD3 alte. Suddividere le cellule gamma delta T in CD8 positivo e CD8 negativo. Gate sulle cellule NK identificate come la popolazione tra le cellule CD3-positive e CD3-negative.
Suddividere le celle NK in CD8 positivo e CD8 negativo. Gate su cellule B identificato come la popolazione CD3-negativa, CD19-positiva nell'angolo in basso a destra del grafico a punti. Selezionate il cancello del monocita e create un plottaggio a punti con uno dei due fluorocromi utilizzati in questo protocollo su ciascun asse.
Gate sulla popolazione CD3-negativa, CD14-positiva. Utilizzando questa strategia, i linfociti di un paziente con mieloma multiplo sono stati gated sulla base della loro dispersione in avanti e della dispersione laterale e del loro profilo citometrico del flusso. Sottopopolazioni di memoria cd8-positive e cellule T ingenua sono state identificate dall'espressione di CD45RA e CCR7.
L'espressione di HLA-DR e CD57 è stata usata per studiare l'attivazione delle cellule T in ingenuità CD8, memoria, memoria centrale, memoria effettore e memoria effettore CD45RA-positive. Allo stesso modo, sono state identificate le cellule T ingenue e di memoria positive del CD4. All'interno della popolazione di memoria, CCR4 e CCR6 sono stati utilizzati per identificare le sottopopolazioni di aiutanti T nelle cellule T positive del CD4.
Le sottopopolazioni delle cellule NK erano caratterizzate dall'espressione CD16 e CD57. Questa strategia è stata utilizzata per indagare la dinamica delle popolazioni immunitarie di campioni longitudinali di un donatore con mieloma multiplo che riceve un trapianto di cellule staminali. La caratterizzazione delle sottopopolazioni CD8 e CD4 nel tempo ha mostrato un'attivazione sostenuta di cellule T CD4-positive e CD8-positive e un'inclinazione dell'aiutante T a un fenotipo T-helper-one.
Ma al giorno 60, la percentuale di cellule B aumentò drasticamente, predicendo la ricaduta del paziente. Una corretta preparazione cellulare e la titolazione degli anticorpi sono passaggi critici per ottenere risultati affidabili utilizzando questa tecnica. Gli anticorpi mirati ad altri marcatori possono essere aggiunti per eseguire analisi citometriche a flusso più profondo e per creare pannelli citometrici a flusso modulare mirati a più lignaggi contemporaneamente.
Approcci simili volti ad ampliare il numero di marcatori registrabili potrebbero anche essere sviluppati utilizzando diversi gruppi di marcatori o per l'uso in diversi modelli animali. Non dimenticare che l'azide di sodio può causare ustioni alla pelle e agli occhi. Pertanto, un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti dovrebbero sempre essere indossati quando si maneggia questo reagente.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo di citometria a flusso per l'identificazione di diversi tipi di cellule immunitarie nel sangue periferico umano utilizzando soltanto due fluorocromi. Questo metodo consente la registrazione di altri cinque marcatori, migliorando l'analisi di popolazioni cellulari complesse.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Citometria a flusso
- Biologia cellulare
Sfondo
- La citometria a flusso è uno strumento potente per analizzare le popolazioni cellulari.
- I metodi tradizionali richiedono spesso più fluorocromi, limitando il numero di marcatori che possono essere analizzati contemporaneamente.
- Questo studio ha l'obiettivo di semplificare il processo ampliando al contempo le capacità analitiche.
- Comprendere le popolazioni di cellule immunitarie è fondamentale per numerose applicazioni nella ricerca biomedica.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo che permetta l'identificazione di più tipi di cellule immunitarie utilizzando un numero ridotto di fluorocromi.
- Facilitare un'immunofenotipizzazione più approfondita con risorse limitate.
- Migliorare l'efficienza dell'analisi citometrica a flusso in contesti di ricerca.
Metodi Utilizzati
- I campioni di sangue vengono diluiti con PBS e sovrapposti a un mezzo a gradiente di densità.
- Viene eseguita la citometria a flusso per identificare le popolazioni cellulari.
- Due fluorocromi vengono utilizzati per marcare le cellule.
- Vengono rilevati cinque marcatori aggiuntivi per migliorare l'analisi.
Risultati principali
- Il protocollo identifica con successo le cellule T CD4+ e CD8+, le cellule T γδ, le cellule B, le cellule NK e i monociti.
- È possibile analizzare altri cinque marcatori senza compromettere la qualità dei dati.
- Questo metodo dimostra la fattibilità di utilizzare un numero ridotto di fluorocromi nella citometria a flusso.
- I risultati indicano un'efficienza migliorata nell'analisi di popolazioni complesse di cellule immunitarie.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora l'analisi mediante citometria a flusso riducendo il numero di fluorocromi necessari.
- Questo approccio consente una comprensione più completa delle popolazioni di cellule immunitarie.
- Fornisce uno strumento prezioso per ricercatori con risorse o attrezzature limitate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo metodo consente un'immunofenotipizzazione approfondita dei sottogruppi di cellule immunitarie umane utilizzando soltanto due fluorocromi, ampliando la capacità analitica dei citofluorimetri a basso numero di parametri. Supporta la validazione degli bersagli e lo sviluppo di saggi nella ricerca esplorativa, permettendo l'analisi simultanea di sette marcatori di linea senza richiedere strumentazione avanzata. L'approccio è particolarmente utile per lo screening di campioni clinici limitati e consente un monitoraggio immunitario efficiente in termini di risorse negli studi preclinici e traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la validazione funzionale di sottopopolazioni di cellule immunitarie confermando combinazioni di marcatori specifici della linea cellulare, fondamentali per la riduzione del rischio sui bersagli.
- Valore operativo: Riduce la dipendenza da complessi pannelli multicolore, semplificando i test delle ipotesi nelle fasi iniziali di progetti scoperta incentrati sull'immunologia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita la standardizzazione dei saggi consentendo un rilevamento costante di cellule T CD4+, CD8+ e γδ, cellule B, cellule NK e monociti mediante un pannello fisso a due fluorocromi.
- Valore operativo: Aumenta la produttività in contesti con campioni limitati, permettendo di registrare altri cinque marcatori oltre il limite ottico dello strumento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente il monitoraggio longitudinale dell'immunità in modelli preclinici, permettendo la rilevazione di marcatori di attivazione (ad esempio, HLA-DR, CD57) e di modifiche nella distribuzione dei sottogruppi nel tempo.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità nei confronti tra studi fornendo una strategia standardizzata di gating per le principali popolazioni immunitarie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel flusso di lavoro della biologia della scoperta, consentendo un profilo immunitario precoce che orienta la selezione del bersaglio e la comprensione meccanicistica prima dell'identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta l'interrogazione basata su ipotesi della composizione delle cellule immunitarie e dei loro stati funzionali in sistemi rilevanti per la malattia.
- Screening: Permette la preparazione di campioni standardizzati di PBMC per saggi successivi di risposta ai farmaci, garantendo un'identificazione costante dei sottoinsiemi immunitari.
- Analisi: Genera letture quantitative e multiparametriche che consentono il confronto delle frequenze delle cellule immunitarie e degli stati di attivazione tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla validazione preclinica permettendo il monitoraggio del ripristino immunitario e della dinamica dei sottoinsiemi in campioni longitudinali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un modulo di immunofenotipizzazione riutilizzabile, applicabile in diversi progetti che studiano la modulazione immunitaria o l'infiammazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione di bersagli legati al sistema immunitario riducendo l'ambiguità nell'identificazione dei sottogruppi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità del saggio tra diversi siti dotati di capacità eterogenee di citometria a flusso.
- Valore strategico: Favorisce un'immunofenotipizzazione efficiente in termini di capitali estendendo l'utilizzo di strumenti esistenti con 2–10 fluorocromi.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni adeguatamente ponderate rispetto ai rischi nello sviluppo di immunoterapie, grazie a un monitoraggio immunitario affidabile su campioni preclinici e clinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella compensazione della citometria a flusso, nella strategia di gating e nella titolazione degli anticorpi per risolvere i segnali sovrapposti.
- È dipendente dall'accesso a un citometro a flusso in grado di rilevare due fluorocromi e di reagenti di marcatura adeguati (ad esempio, colorante per cellule vive/morte, PBS, azide).
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di titolazione degli anticorpi tra diversi utilizzatori per garantire una risoluzione costante dei sottoinsiemi.
- Richiede adattamenti quando si estende a specie non umane o a fonti tissutali diverse, a causa di potenziali differenze nell'espressione dei marcatori.
- È limitato nella risoluzione di sottoinsiemi strettamente correlati, come le cellule NKT, in assenza di marcatori aggiuntivi o di strumenti con un numero maggiore di parametri.
