Name: Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Scopri come isolare neutrofili dal sangue periferico umano per valutare l'attività della chinasi LRRK2 mediante la fosforilazione di Rab10. Questo metodo consente di identificare individui con elevata attività del pathway LRRK2 associato al morbo di Parkinson ereditario.

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Ringraziamo i volontari sani che hanno gentilmente donato sangue per il presente studio. Ringraziamo la Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) e la leadership dello studio Fox BioNet (FBN) per il loro sostegno e input verso il protocollo scritto e il video. Ringraziamo il professor Alexander simprich dell'Università di Vienna in Austria per aver testato il nostro protocollo e la nostra collaborazione. Apprezziamo i contributi di Paul Davies al progetto (direttore generale della PPU MRC). Riconosciamo anche l'eccellente supporto tecnico dei team MRC Protein Phosphorylation and Ubiquilation Unit (PPU), vale a dire Chemical Synthesis (Natalia Shpiro per la sintesi MLi-2), REagents and Services anticorpation (coordinato da Hilary McLauchlan e James Hastie). Ringraziamo Mhairi Towler e Fraser Murdoch di Vivomotion per il loro aiuto nella realizzazione di video e animazioni. Ringraziamo Steve Soave di 81 film per l'assistenza con le modifiche finali. Esther Sammler è sostenuta da una borsa di studio scozzese Senior Clinical Academic e ha ricevuto finanziamenti dal Parkinson nel Regno Unito (K-1706).

Secondo la normativa locale del Regno Unito, tutte le manipolazioni e il pipettaggio del sangue umano sono intrapresi in un armadietto di sicurezza biologica di categoria 2. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il comitato di revisione etica locale e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.
1. Preparazione
<ol><li>Preparare 0,1 mL di EDTA Stock Solution 1 contenente 100 mM EDTA in salina con buffer fosfato (PBS).</li>
	<li>Preparare 60 mL di EDTA Stock Solution 2 contenente 1 mM EDTA in PBS.</li>
	<li>Preparare il buffer di lisi contenente 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM, 5 mM di pirofafato di sodio, 0,27 M di saccarosio, 0,1% (v/v)-mercaptoetanolo, 1x cocktail inibitore della proteasi, 1g/mL microcystin-LR e 0,5 mM di fluorofosofato di diisopillo (DIFP). NOTA: Gli autori utilizzano abitualmente un prodotto privo di EDTA, ma dovrebbe funzionare anche un cocktail con inibitore della proteasi contenente EDTA. Il buffer di lisi può essere effettuato in anticipo senza il mercaptoetanolo, gli inibitori della proteasi, la microcistina-LR e la DIFP, e conservato a 4 gradi centigradi fino all'uso. Assicurarsi che gli inibitori di proteasi, la microcistina-LR e la DIFP vengano aggiunti solo immediatamente prima dell'uso. NPITA': DIFP è tossico e deve essere maneggiato con cura in una cappa di fumi a seguito della valutazione locale dei rischi per la salute e la sicurezza. DIFP può essere aggiunto al buffer di lisi e utilizzato immediatamente. In alternativa, il buffer di lisi completo contenente tutti gli altri componenti, incluso DIFP, può essere rivestito a -80 gradi centigradi per un uso successivo per almeno 4 settimane.</li>
</ol>2. Isolamento dei neutrofili dal sangue intero
<ol><li>Raccogliere 10 mL di sangue in un tubo di raccolta del sangue. Mescolare delicatamente invertendo i tubi 7-8x.</li>
	<li>Trasferire 10 mL di sangue in un tubo conico da 50 mL.</li>
	<li>Aggiungere al sangue 100 l di soluzione EDTA Stock Solution 1. Mescolare delicatamente.</li>
	<li>Aggiungete 500 l del cocktail di isolamento (50 l/mL) dal kit di isolamento dei neutrofili (Tabella dei materiali) all'intero campione di sangue.</li>
	<li>Vorticare le perle magnetiche dal kit di isolamento neutrofilo per 30 s prima dell'uso al fine di risospendere le perline magnetiche molto fini.</li>
	<li>Aggiungere 500 l di perline magnetiche al campione di sangue e mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.</li>
	<li>Riempire il tubo a 50 mL con EDTA Stock Solution 2. Mescolare con molto delicatamente pipetting su e giù 2-3x.</li>
	<li>Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione del tubo.</li>
	<li>Incubare per 10 min a RT.</li>
	<li>Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL. NOTA: Non toccare il lato del tubo che è in contatto con il magnete ed evitare la raccolta e la perturbazione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Lasciare circa 10 mL della sospensione del globulo rosso dietro nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Vorticare le perline magnetiche per 30 s prima dell'uso e aggiungere 0,5 mL delle perline magnetiche al tubo contenente i neutrofili arricchiti. Mescolare delicatamente invertendo il tubo.</li>
	<li>Incubare a RT per 5 min.</li>
	<li>Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare agitazioni successive.</li>
	<li>Incubare a RT per 5 min.</li>
	<li>Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL. NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Per garantire la completa rimozione delle perline magnetiche dalla miscela cellulare, posizionare il tubo contenente le cellule arricchite nel magnete.</li>
	<li>Incubare per 10 min a RT.</li>
	<li>Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che ora contiene neutrofili puri in un nuovo tubo conico 50 mL. NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Mescolare le celle isolate con 1 mM EDTA Stock Solution 2 ad un volume finale di circa 41 mL. Pipette su e giù per mescolare.</li>
	<li>Dividere la soluzione equamente in due tubi con circa 20 mL in ogni tubo.</li>
	<li>Centrifuga entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.</li>
	<li>Durante questa centrifuga estraendo il congelatore MLi-2 dell'inibitore (concentrazione di 200 m/1.000x) dal congelatore a -80 gradi centigradi e lasciare a RT per un uso successivo.</li>
	<li>Immediatamente dopo la fase di centrifugazione e senza agitazione dei tubi, versare il supernatante senza disturbare i pellet neutrofili. Risospendere ogni pellet cellulare in 10 mL di colture cellulari (Tabella dei materiali) a RT con il pipettaggio dolce delle cellule su e giù 4x.</li>
</ol>3. Trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2 dei neutrofili puri
<ol><li>Etichettare un tubo "DMSO" e l'altro tubo "MLi-2".</li>
	<li>Al tubo etichettato "DMSO", aggiungere 10 L di DMSO e mescolare delicatamente convogliando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL. Al tubo con etichetta "MLi-2", aggiungere 10 o L di 200 MLi-2 soluzione stock (concentrazione finale 200 nM) e mescolare delicatamente pipettando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL.</li>
	<li>Incubare i campioni per 30 min a RT. Mescolare delicatamente per inversione ogni 10 min durante l'incubazione.</li>
	<li>Durante il periodo di incubazione, rimuovere lo stock DIFP da 0,5 M dal congelatore -80 gradi e posizionarlo in una cappa di fumi sul ghiaccio. Rimuovere 1 soluzione di riserva di microcistina-LR mg/mL dal congelatore -80 gradi centigradi e lasciare scongelare rt. Togliere dal congelatore un'aliquota (0,25 mL) del buffer di lisi, lasciarlo scongelare a RT, quindi posizionarlo sul ghiaccio per un uso successivo.</li>
	<li>Preparare 1 mL di supporto di coltura cellulare contenente 1 OL di DMSO e chiamare questo buffer di sospensione DMSO. Preparare 1 mL di supporti RPMI contenenti 1 L L di 200 MLi-2 e chiamare questo buffer di sospensione MLi-2.</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione di 30 min, centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.</li>
	<li>Scartare con cura il supernatante in ogni tubo senza disturbare il pellet di neutrofilino.</li>
	<li>Per il campione etichettato DMSO resospendere delicatamente il pellet in 1 mL del buffer di sospensione DMSO e per il tubo etichettato MLi-2, risospendere il pellet in 1 mL del buffer di sospensione MLi-2.</li>
	<li>Trasferire i pellet cellulari risospesi nei corrispondenti tubi di centrifugazione etichettati "DMSO" e "MLi-2" e centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 3 min.</li>
	<li>Durante la fase di centrifugazione, preparare il buffer di lisi. Nel cofano del fume aggiungere con attenzione 0,25 l di 0,5 M di soluzione DIFP e 0,25 L di 1 mg/mL microcistina-LR al buffer di lisi da 0,25 mL. Mescolare e lasciare sul ghiaccio fino all'uso. NOTA: Aggiungere DIFP al buffer di lisi entro 15 min di lisi cellulare, perché DIFP è relativamente instabile in una soluzione acquosa.</li>
	<li>Subito dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione e completamente tutti i supernatali con una pipetta senza disturbare il pellet di neutrofilino e posizionare i tubi sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 100 l di tampone di lisi contenente DIFP e microcistina-LR ad ogni tubo. Utilizzando una pipetta da 100-200 gradi, sospendere i pellet cellulari conilando su e giù circa 5-10x.</li>
	<li>Liscile le cellule sul ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Centrifuga tubi a 20.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i detriti cellulari.</li>
	<li>Trasferire i supernatanti "DMSO" e "MLi-2" contenenti i lismi neutrofili in nuovi tubi di centrifugazione. Scartare il pellet di detriti. NOTA: I lisati neutrofili sono ora pronti per l'uso o possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi per analisi future.</li>
</ol>

<ol><li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+Potent%2C+Selective%2C+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Therapies+for+Parkinson%27s+Disease%3A+From+Genetics+to+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
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<li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+kinase+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li>
<li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li>
<li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson%27s+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Parkinson%27s+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li>
<li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+3-%284-Pyrimidinyl%29+Indazole+%28MLi-2%29%2C+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li>
<li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+serine+proteases%3A+specific+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li>
<li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson%27s+disease+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li>
<li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+VPS35%5BD620N%5D+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li>
<li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li>
<li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32(2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Compelling evidenze cliniche, genetiche e biochimiche indicano un ruolo importante per LRRK2 e in particolare la sua funzione di chinasi nella malattia di Parkinson7. Gli inibitori della chinasi LRRK2 sono stati sviluppati e stanno entrando negli studi clinici2,4,12. Come tale, è necessario sfruttare LRRK2 come biomarcatore per l'impegno con il bersaglio e per la stratificazione del paziente. Il nostro pr...

I tentativi di rallentare o fermare il morbo di Parkinson (PD) sono finora falliti. La scoperta di mutazioni iperattive nella leucina ricca ripetizione chinasi 2 (LRRK2) che causano e/o aumentano il rischio di PD ha portato allo sviluppo di inibitori della chinasi LRRK21,2,3. Questi sono ora entrati negli studi clinici4. L'esatta funzione di LRRK2 non è chiara, ma un importante progresso è stata l'identificazione di un sottoinsieme di proteine Rab GTPase, tra cui Rab10, come il primo substrati fisiologici in buona fede della chinasi LRRK25,6,7. Le sfide chiave nell'era delle terapie che modificano la malattia sono i marcatori biochimici dello stato di attivazione della chinasi LRRK2 e l'impegno mirato degli inibitori della chinasi LRRK2.
Finora, il principale marcatore farmacocinetico per gli inibitori di LRRK2 in vivo è stato un gruppo di residui di serine costituiti da fosforesti di LRRK2, in particolare serine 935, che diventano deforfatiti in risposta a diversi inibitori di LRRK28,9. Tuttavia, la fosfororylazione serina 935 non è correlata all'attività intrinseca della china lRRK2 cellulare perché non è direttamente fosforilata da LRRK2 ed è ancora fosforilata in lRRK210. L'attività della chinasi LRRK2 si correla bene con l'autofosfororylazione della serina 1292, ma in termini pratici non è una lettura adatta per l'attività endogena della chinaltra LRRK2 mediante l'analisi immunoblot di estratti di cellule intere a causa dell'attuale mancanza di anticorpi affidabili e fosforici per questo sito10,11.
Abbiamo sviluppato un saggio robusto e facile per quantificare l'attività della vaginasi l'LRRK2 nelle cellule del sangue periferiche umane che misura l'fosfororylazione controllata da LRRK2 della sua proteina bersaglio fisiologica Rab10 alla trelina 7311. Il sangue periferico è facilmente accessibile tramite venesezione, che è un basso rischio e una procedura rapida che causa un disagio minimo. Ci concentriamo sui neutrofili del sangue periferici umani perché costituiscono un'abbondante popolazione di cellule bianche (37-80% di tutti i globuli bianchi) e una popolazione omogenea di cellule che esprime livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab1011. Inoltre, i neutrofili del sangue periferico possono essere isolati in modo rapido ed efficiente utilizzando un approccio immunomagnetico negativo. Per garantire che la successiva fosfororylazione Rab10 osservata sia mediata da LRRK2, ogni lotto di neutrofili viene incubato con o senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK2 (usiamo e raccomandiamo MLi-2)2,12. Questo è seguito da lisi cellulare in un buffer contenente l'inibitore della proteasi (DIisophofosfato) (DIFP), che è necessario per sopprimere l'attività intrinseca della proteasi serina che è nota per essere ad alta neutrofili13. Per l'analisi finale mediante immunoblotting quantitativa, si consiglia di utilizzare l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10 che rileva specificamente il Rab10 Thr73-phosphoepitope e non reagisce incrociatamente con altre proteine Rab fosforolate14. La selettività e la specificità di questo anticorpo è stata convalidata in modelli di sovraespressione di diverse proteine Rab e una linea cellulare Knock-out A549 Rab1014. Così, misuriamo la differenza nella fosforilazione Rab10 nei lismi neutrofili che sono stati trattati con e senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK22. In alternativa, i campioni potrebbero anche essere analizzati con altri metodi, come la spettrometria di massa quantitativa.
In conclusione, la fosfororylazione Rab10 controllata da LRRK2 è un marcatore superiore dell'attività della chinasi LRRK2 alla fosforolazione LRRK2 a serine 935 e i neutrofili ematici periferici umani sono una risorsa preziosa per la ricerca della PD in LRRK2. Il nostro protocollo fornisce un saggio robusto e facile per interrogare l'attività del percorso LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici e consente la stratificazione biochimica di individui con aumento dell'attività della chinasi LRRK215. È importante sottolineare che tali individui possono beneficiare del futuro trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2.

<table><tbody><tr><td>1 mL Puntali per pipette</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>1,5 mL Microprovette</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>10 mL Puntali per pipette&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025&nbsp;</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>10 &mu; L Puntali per pipette</td><td>Sarstedt</td><td>70.113</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente 15 mL provetta falcon</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente 200 &mu; L Puntali per pipette</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente 25 mL Puntali per pipette&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente provetta di falco da 50 mL</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Hemogard Chiusura Plastica K2-EDTA Tubo</td><td>BD&nbsp;</td><td>BD 367525</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuga</td><td>Beckman</td><td></td><td>o equivalente con rotatore a secchiello da nuoto per provette falcon da 15 mL e 50 mL a velocità 1000-1200 x g</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica di categoria 2.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cocktail di inibitori della proteasi cOmplete (senza EDTA)</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>DIFP (diisopropilfluorofosfato)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0879</td><td>Preparare la soluzione madre 0,5M in isopropanolo utilizzando precauzioni speciali.</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>6250</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio secco o azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14190094</td><td>o equivalente Magnete</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep</td><td>Stemcell</td><td>18002</td><td>per contenere 1 provetta conica da 50 ml</td></tr><tr><td>Kit di isolamento diretto dei neutrofili umani EasySep</td><td>Stemcell</td><td>19666</td><td>Questo contiene Soluzioni chiamate " Cocktail di isolamento" e " RapidSpheres perline magnetiche</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuga 5417R centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, in flacone</td><td></td><td></td><td></td>spray</tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (grado anidro)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &beta;-glicerofosfato, 5 mM pirofosfato di sodio, 0,27 M saccarosio, 0,1% (v/v) &beta;-mercaptoetanolo, 1x cocktail di inibitori della proteasi cOmplete (senza EDTA) (Roche), 1 &mu; g/ml di microcistina-LR, 0,5 mM di diisopropilfluorofosfato (DIFP).&nbsp;</td><td></td><td></td><td>in alternativa tampone di lisi congelato in aliquote senza Microcistina-LR, DIFP disponibile da MRC-PPU Reagenti (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td></tr><tr><td>Merck LRRK2 inibitore II (MLi-2)</td><td>Merck</td><td>438194-10MG</td><td>o equivalente (inibitore LRRK2 potente e selettivo)</td></tr><tr><td>Microcistina-LR</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-350-012-M001</td><td>1 mg/ml in DMSO e conservare a -80 oC.</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx scan Western Blot sistema di imaging</td><td>Odyssey</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennarello</td><td></td><td></td><td></td>indelebile</tr><tr><td>Dispositivi</td><td></td><td></td><td></td>di protezione individuale</tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td>o</td></tr><tr><td>pirofosfato di sodio</td> equivalente <td>Sigma</td><td>S22</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi consigliati per Western blotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RAB10 (fosfo T73) [MJF-R21]</td><td>abcam</td><td>ab230261</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&alfa;-tubulina</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5174</td><td>utilizzato a diluizione 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-topo di capra IRDye 680LT</td><td>LI-COR</td><td>926-68020</td><td>utilizzato a diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>Anti-topo di capra IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>utilizzato a diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td>utilizzato a diluizione 1:10.000</td></tr><tr><td>MJFF-totale Rab10 anticorpo di topo</td><td>generato da nanoTools (nanotools.de)</td><td>non applicabile*</td><td>utilizzato a 2 &mu; g/ml di concentrazione finale; * L'anticorpo MJFF-total Rab10 generato da nanoTools (www.nanotools.de) [11] sarà commercializzato dalla Michael J Fox Foundation nel 2018</td></tr><tr><td>Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>&nbsp; 75-253</td><td>usato a 1 &mu; g/ml di concentrazione finale</td></tr><tr><td>pS935-LRRK2</td><td>MRC PPU Reagenti e servizi</td><td>UDD2</td><td>utilizzato a 1 &mu; g/ml di concentrazione finale</td></tr></tbody></table>

isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di lrrk2 kinase associato al parkinson valutando rab10 phosphorylation

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

La leucina ricca di chinasi 2 (LRRK2) è il gene più frequentemente mutato nella malattia ereditaria del Parkinson (PD) e tutte le mutazioni patogene dell'LRRK2 provocano l'iperattivazione della sua funzione di chinasi. Qui, descriviamo un saggio facile e robusto per quantificare l'attività della via della chinasi LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici dell'uomo misurando la fosforolazione controllata da LRRK2 di uno dei suoi substrati fisiologici, Rab10 alla trenolina 73. L'analisi dell'immunoblotting descritta richiede un anticorpo completamente selettivo e fosfospecifico che riconosca l'epitopo Rab10 Thr73 fosforerilato da LRRK2, come l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10. Esso utilizza neutrofili del sangue periferici umani, perché il sangue periferico è facilmente accessibile e i neutrofili sono un costituente abbondante e omogeneo. È importante sottolineare che i neutrofili esprimono livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10. Un potenziale inconveniente dei neutrofili è la loro elevata attività intrinseca di proteasi serina, che richiede l'uso di inibitori della proteasi molto potenti come la diisopropylfluorofosfati (DIFP) organosa. Tuttavia, i neutrofili sono una risorsa preziosa per la ricerca sull'attività del percorso della chinasi LRRK2 in vivo e dovrebbero essere considerati per l'inclusione nelle collezioni di biorepository della PD.

Il nostro saggio permette di interrogare l'attivazione della chinasi LRRK2 associata alla PD nei neutrofili del sangue periferici umani con la fosforo laphorylazione Rab10 dipendente da LRRK2 come lettura. I neutrofili sono una popolazione omogenea e abbondante di globuli bianchi periferici che esprime alti livelli di proteine LRRK2 e Rab10 (Figura 1). L'unica altra popolazione cellulare tra le restanti cellule mononucleari del sangue periferiche (PBMC) con un alto numero di copie di entramb...

Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell'attività del percorso della chinasi LRRK2.

Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo per valutare l'attività endogena della LRRK2 chinasi nel sangue periferico umano. Ciò si ottiene monitorando la fosforilazione mediata da LRRK2 delle proteine rab, impiegando anticorpi monoclonali Rab specifici della Michael J.Fox Foundation. Qui, ci concentriamo sui neutrofili del sangue periferico umano come costituiti da popolazione omogenea del sito con alti livelli di espressione sia di Rab2 che di Rab10.L'isolamento neutrofilo si basa su una selezione negativa che entro 40 minuti dall'azione finita consente l'isolamento di neutrofili puri e vitali al 99% producendo allo stesso tempo un'elevata quantità di livelli proteici. Raccogliere 10 millilitri di sangue in un tubo di raccolta del sangue. Mescolare delicatamente invertendo i tubi da sette a otto volte.Trasferire 10 millilitri di sangue in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere al sangue 100 microlitri di soluzione stock EDTA 1, 0.1 molare EDTA PBS Soluzione, mescolare delicatamente. Aggiungere 500 microlitri di isolamento cocktail, 50 microlitri per millilitro dal kit di isolamento neutrofilo al campione di sangue intero.Vortice le perline magnetiche dal kit di isolamento neutrofilo per 30 secondi prima dell'uso al fine di rimodere perline magnetiche molto fini. Aggiungere 500 microlitri perline magnetiche al campione di sangue e mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Ricaricare il tubo fino a 50 millilitri con soluzione stock EDTA 2. Questa è una soluzione PBS EDTA millimolare. Mescolare con molto delicatamente pipettando su e giù da due a tre volte.Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione del tubo. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Sospensione cellulare arricchita con pipetta con cura che contiene neutrofili in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Non toccare il lato del tubo a contatto con il magnete ed evitare la raccolta e la perturbazione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Lasciare circa 10 millilitri della sospensione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Perline magnetiche vortice per 30 secondi prima dell'uso e aggiungere perline magnetiche da 0,5 millilitri al tubo contenente i neutrofili arricchiti.Mescolare delicatamente invertendo il tubo. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione.Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita che contiene neutrofili in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Non toccare il lato del tubo a contatto con il magnete.Lasciare circa cinque millilitri della sospensione nella parte inferiore del tubo. Per garantire la completa rimozione delle perline magnetiche dalla miscela cellulare, posizionare il tubo contenente celle arricchite nel magnete. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Pipettare con cura la sospensione cellulare arricchita che ora contiene neutrofili puri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Non toccare il lato del tubo a contatto con il magnete. Lasciare circa cinque millilitri di sospensione nella parte inferiore del tubo.Ricaricare le cellule isolate con una soluzione di stock di EDTA millimolare da 2 a un volume finale di circa 41 millilitri. Pipetta su e giù per mescolare. Dividere la soluzione equamente in due tubi con circa 20 millilitri in ogni tubo.Centrifuga entrambi i tubi a 335G per cinque minuti. Durante la fase di centrifugazione, prendere lo stock di inibitore MLi-2, 200 micromolare tagliare la concentrazione 1000X dal congelatore meno 80 gradi e lasciare a temperatura ambiente per l'uso successivo. Subito dopo la fase di centrifugazione e senza agitazione dei tubi, versare il supernatante senza disturbare i pellet neutrofili.rimospendare ogni pellet cellulare in 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare a temperatura ambiente tubazionando delicatamente le cellule su e giù quattro volte. Etichettare un tubo DMSO e l'altro tubo MLi-2. Al tubo etichettato DMSO aggiungere 10 microlitri di DMSO e aggiungere 10 microlitri di soluzione stock MLi-2 micromolare con pipettando delicatamente su e giù per mescolare.Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente per inversione ogni 10 minuti durante il periodo di incubazione. Durante il trattamento inibitore della chinasi LRRK2 di 30 minuti rimuovere la soluzione di stock di DIFP molare 0,5 dal congelatore meno 80 gradi e posizionare nella cappa dei fumi sul ghiaccio.Quindi, spostare un milligrammo per millilitro Microcystin-LR soluzione di magazzino dal congelatore meno 80 gradi e posizionarlo a temperatura ambiente per scongelare. Scongelare un'aliquota, 0,25 millilitro del tampone di lisi togliendola dal congelatore, lasciare scongelare a temperatura ambiente e quindi posizionare sul ghiaccio per un uso successivo. Preparare un millilitro di supporto RPMI contenente un microliter di DMSO chiamare questo dmso resuspension buffer.Preparare un millilitro di mezzo RPMI contenente un microlitro di MLi-2 micromolare o inibitore alternativo della chinasi LRRK2 e chiamare questo buffer di resuspensione MLi-2. Dopo il periodo di incubazione di 30 minuti, centrifuga entrambi i tubi a 335G per cinque minuti, come prima. Scartare con cura il supernatante in ogni tubo senza disturbare il pellet neutrofilo.Per il tubo etichettato DMSO, rimorsi delicatamente pellet in un millilitro di DMSO Resuspension Buffer. E per il tubo etichettato MLi-2, resuspend pellet in un millilitro di MLi-2 Resuspension Buffer. Trasferire pellet di cellule rimorsi a corrispondenti tubi di centrifugazione etichettati DMSO e MLi-2 e centrifugare entrambi i tubi a 335G per tre minuti.Durante la fase di centrifugazione, preparare il tampone di lysis. Nella cappa aspirante aggiungere con cura 0,25 microlitri di soluzione DIFP molare da 0,5, nonché 0,25 microlitri di un milligrammo per microcistina-LR millilitro al tampone di lisi da 0,25 millilitri. Mescolare e lasciare sul ghiaccio fino all'uso.Subito dopo la centrifugazione, rimuovere con cura e completamente tutto il supernatante con una pipetta senza disturbare il pellet neutrofilo e posizionare i tubi sul ghiaccio. Aggiungere immediatamente 100 microlitri di tampone di lisi contenenti DIFP e microcistina-LR a ciascun tubo. Utilizzando una pipetta da 100 a 200 microliter, rimorsi il pellet di cella tubazione su e giù da cinque a 10 volte.Giacere le cellule sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, centrifuga i tubi a 20.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il supernatante DMSO e MLi-2 contenente lisati neutrofili in nuovi tubi di centrifugazione.Scartare i pellet di detriti. I lisati neutrofili sono ora pronti per l'uso o possono essere congelati a secco liquido e conservati a meno 80 gradi per l'analisi futura. Utilizzando i dati del database delle importazioni pubblicamente disponibile, questo grafico mostra che l'abbondanza delle proteine LRRK2 e Rab10 è particolarmente alta nei neutrofili e nei monociti del sangue periferico umano.Isolare i neutrofili del sangue periferico umano con questa procedura si traduce in un'elevata resa impura delle cellule. La tabella in alto mostra il numero totale di cellule isolate da 10 millilitri di sangue periferico da tre donatori sani. Sono inoltre mostrate la purezza e la vitalità delle cellule isolate, così come la resa totale di glisato proteico.Dopo il trattamento con e senza l'inibitore della chinasi LRRK2, MLi-2, i neutrofili vengono lisciviati in presenza del potente inibitore della proteasi, DIFP. Per la figura B sul lato sinistro, 10 microgrammi di estratti interi di cellule per corsia sono stati sottoposti ad analisi immunoblot quantitativo multiplex con gli anticorpi indicati. La figura a destra, C, dimostra l'importanza della DIFP per la prevenzione della degradazione proteolitica, in particolare della grande proteina LRRK2.In confronto, le alte concentrazioni di PMSF da sole sono meno efficaci. Qui viene mostrato che la fosforilazione Rab10 controllata da LRRK2 è significativamente aumentata di circa tre volte nei neutrofili del sangue periferici derivati da pazienti con morbo ereditario di Parkinson che ospitano una mutazione VPS35 D620N eterozigote rispetto ai controlli. Il grafico superiore mostra l'analisi dell'immunoblot multiplex e il fondo, la sua quantificazione.Ciò suggerisce che la mutazione VPS35 D620N attivi il percorso di attività della chinasi LRRK2 con un meccanismo ancora sconosciuto. In sintesi, presentiamo un saggio facile e robusto per misurare l'attività della via della chinasi LRRK2 monitorando la fosforilazione della proteina Rab, come Rab10, nei neutrofili di derivazione periferica umana, questo metodo ci consente di valutare l'attività della via LRRK2 e determinare come mutazioni, stati di malattia o inibitori modulano l'attività del percorso LRRK2.

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Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo...

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Gli isozimi lipossigenasi (LOX) possono generare prodotti che possono aumentare o diminuire la neuroinfiamminazione e la neurodegenerazione. Uno studio di interazione gene-ambiente potrebbe identificare effetti specifici dell'isozima LOX. L'uso del modello 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) del danno nigrostriatale in due linee transgeniche carenti di isozima LOX consente il confronto del contributo degli isozimi LOX sull'integrità dopaminergica e sull'infiammazione.

Modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di Parkinson

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Lo studio presente descrive un metodo semplice per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione dalla leucina-ricche ripetere chinasi 2.

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

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Questo lavoro analizza la dose vettoriale e il tempo di esposizione necessari per indurre neuroinfiammazione, neurodegenerazione e compromissione motoria in questo modello preclinico di malattia di Parkinson. Questi vettori che codificano la α-sinucleina umana vengono consegnati nella substantia nigra per ricapitolare la patologia sinucleina associata al morbo di Parkinson.

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Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation (Video) | JoVE Journal

Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation

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