Name: Valutazione dellintegrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Impara a valutare l'integrità del DNA nelle cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca. Questi protocolli garantiscono la qualità delle cellule prima del trapianto, migliorando l'efficacia delle terapie rigenerative.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Heart, Lung e sangue Istituto sovvenzioni RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (a Zhang J.) e dall'American Heart Association scientifico Development Grant 17SDG33670677 (di R. Michel).

1. comet Assay
<ol><li>
Preparazione dei reagenti
	<ol>
<li>Per punto di fusione basso dell'agarosi, porre in 100 mL di DNA - 500 mg di agarosio basso punto di fusione / RNA senza acqua. Riscaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando si scioglie l'agarosio. Posizionare la bottiglia in un bagno di acqua di 37 ° C fino a quando necessario. Nota: Per approfondimenti, Vedi Azqueta et al., che ha studiato gli effetti della concentrazione di agarosio sul tempo di svolgimento del DNA e diversi fattori di elettroforesi23.</li>
		<li>Diluire il colorante SYBR green DNA in tampone Tris-EDTA (TE) ad un rapporto di 1: 10.000 per ottenere un 1 x soluzione colorante stock di funzionamento. Questa tintura è sensibile alla luce, quindi conservarlo in un luogo buio.</li>
		<li>Per il buffer di lisi delle cellule, sciogliere 100 mL di tampone di lisi (2,5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) in acqua deionizzata (DI H2O). Quindi, aggiungere 10 M NaOH per regolare il pH a 10.0. Raffreddare il buffer a 4 ° C.</li>
		<li>Per il tampone alcalino-svolgimento/elettroforesi del DNA in esecuzione, sciogliere 1 L di soluzione alcalina (NaOH 0,3 M, 1 mM EDTA) DI H2O. Cool il buffer a 4 ° C. Assicurarsi che il pH > 13.</li>
		<li>Per le diapositive di cometa preverniciati, versare qualche goccia di 0,5% di agarosio su un vetrino. Immediatamente, utilizzando la superficie piana di un'altra diapositiva, diffondere l'agarosio per formare un sottile strato di rivestimento dell'agarosi. Nota: Asciugare i vetrini prima dell'uso.</li>
		<li>Per la coltura delle cellule iPS, brevemente le cellule iPS di cultura nel seminterrato-membrana-matrix-coated (Vedi Tabella materiali) cultura piastre in terreno di coltura di mTESR1 sino al confluency. Nota: Le cellule iPS umani-cardiaco-fibroblasto-derivati sono state utilizzate in questo protocollo. La riprogrammazione di derivazione delle cellule iPS e condizioni di coltura è descritto in articoli recenti dal nostro ricerca gruppo12,13,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del campione
	<ol>
<li>Scartare il terreno di coltura e lavare le cellule. Dissociare le cellule utilizzando soluzione di distacco (Vedi Tabella materiali). Lavare il pellet cellulare con tampone fosfato salino (PBS) e risospendere le cellule in PBS a 1 x 105 cellule/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del vetrino del campione Nota: Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di scarsa illuminazione per evitare il danno cellulare indotto da luce ultravioletta.<ol>
<li>Miscelare 10 µ l di sospensione cellulare e 90 μL di soluzione di agarosio (01:10 ratio) in un tubo. Collocare la provetta nel bagno d'acqua di 37 ° C per impedire la solidificazione di agarosio.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni senza introdurre bolle d'aria e pipettare 70 μL/spot sulla diapositiva cometa preverniciati. Utilizzando un puntale, stendere l'impasto di agarosio cella per formare uno strato sottile. Porre il vetrino a 4 ° C per 15 min.</li>
		<li>In un contenitore, completamente immergere il vetrino in tampone di lisi freddo. Mettere il recipiente al buio a 4 ° C per 1 h.</li>
		<li>Sostituire il tampone di lisi freddo con soluzioni alcaline. Assicurarsi che le diapositive sono completamente sommerse. Mettere il recipiente al buio a 4 ° C per 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elettroforesi
	<ol>
<li>Porre il vetrino in un serbatoio di elettroforesi orizzontale. Riempire il serbatoio con il tampone di elettroforesi alcalina fredda fino a quando le diapositive sono completamente sommerse. Applicare tensione a 1 V/cm per 15-30 min. Nota: Totale tensione = distanza tra gli elettrodi x 1 V</li>
		<li>In un contenitore, completamente immergere il vetrino in freddo DI H2O. Dopo 2 minuti, togliere il DI H2O e aggiungere fresco DI H2O. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Sostituire il DI H2O con etanolo 70% freddo. Attendere 5 min. delicatamente togliere il vetrino, non inclinare l'apparecchio e lasciarlo asciugare all'aria.</li>
		<li>Una volta asciugato, aggiungere 100 μL di colorante DNA diluito per ogni spot. Aspettare 15 min a temperatura ambiente. Utilizzando un filtro FITC in un microscopio a epifluorescenza, prendere le immagini di comete da 50 a 100 in totale per campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dell'immagine e calcolo dei risultati
	<ol>
<li>Per segnare le comete, utilizzare il National Institutes of Health (NIH) ImageJ con comet assay plugin (Scarica ImageJ qui: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; Scarica il plugin qui: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). Nota: Il plugin viene fornito con un PDF istruzioni che contiene tutti i dettagli per eseguire l'analisi. Inoltre, screenshot per l'analisi della cometa sono mostrati nella Figura 2A-C. Immagini della cometa rappresentante di controllo e doxorubicina (Doxo)-cellule trattate iPS e la quantificazione delle comete sono mostrati in Figura 3A-C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA Damage Response
<ol><li>Preparazione di campioni e reagenti
	<ol>
<li>Per una cultura di cellule iPS-CM, cultura iPS-CM le celle in scantinato-membrana-matrix-coated (Vedi Tabella materiali) piastre di coltura in RPMI supplementato con B-27 (CMM) sino al confluency. Nota: Cardiomiociti umani-iPS-cellula-derivati sono stati utilizzati in questo protocollo. Il protocollo per la differenziazione delle cellule iPS in cardiomiociti può essere trovato in articoli recenti dal nostro ricerca gruppo12,13,21.</li>
		<li>IPS-CMs in diapositive di alloggiamento del seme.<ol>
<li>Scartare il terreno di coltura dai pozzetti iPS-CM. Lavare le cellule tre volte con PBS.</li>
			<li>Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 5 min. Check la piastra sotto un microscopio per distacco cellulare. Aggiungere 1 mL di CMM per interrompere la tripsina.</li>
			<li>Posizionare la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 4 ° C e 200 x g. Eliminare il terreno, aggiungere 1 mL di CMM e risospendere le cellule. Contare le celle e regolare il numero di celle per ottenere 20 x 105 celle in 1,6 mL di CMM.</li>
			<li>Seme 200 µ l della sospensione di cellule per pozzetto della camera 8 pozzetti di slide (Vedi Tabella materiali). Tocca la diapositiva delicatamente per diffondere le celle intorno al pozzo e incubare a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per il trattamento di doxorubicina iPS-CM, scartare il terreno di coltura dai pozzetti iPS-CM. Lavare le cellule con PBS. Trattare le cellule con doxorubicina di 1 μM e CMM per 4 h. aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS.</li>
		<li>Per il tampone bloccante, preparare 10 mL di soluzione di albumina di siero bovino (BSA) contenente 3% BSA e 0.05% Triton X-100. Per preparare 10 mL di tampone bloccante, aggiungere 1 mL di siero normale asino a 9 mL di soluzione di BSA preparata.</li>
		<li>Per la soluzione di anticorpo primario, aggiungere 1 μL di anti-coniglio fosfo-istone H2A. X (Ser139) anticorpo a 200 μL di tampone bloccante.</li>
		<li>Per il mix di anticorpo secondario, aggiungere 1 µ l di anticorpo secondario anti-coniglio fluorocromo-coniugate, DAPI e falloidina fluorocromo-coniugate a 200 μL di tampone bloccante.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunolabeling
	<ol>
<li>Lavare le cellule tre volte con PBS e aggiungere 200 μL di preparati paraformaldeide al 4% (PFA) ad ogni pozzetto. Fissare le cellule per 20 min al buio a temperatura ambiente. Lavare le cellule con PBS.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante per bene e blocco per 30 min in una camera umidificata a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 200 μL di soluzione di anticorpo primario. Incubare per 45 min in una camera buia, umidificata a temperatura ambiente. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con PBS.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL di miscela di anticorpo secondario. Incubare per 45 min in una camera buia, umidificata a temperatura ambiente. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con PBS. Lavare con DI H2O prima di montarli con antifade. Posizionare un coprioggetto e conservare i vetrini al buio a 4 ° C.</li>
		<li>Utilizzando un microscopio a epifluorescenza, prendere tre a cinque immagini di campi aleatori per campione, come illustrato nella Figura 4Ae procedere all'analisi dell'immagine.</li>
	</ol></li>
	<li>Conteggio dei fuochi DDR
	<ol>
<li>Scaricare e installare CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
Nota: Immagine di elaborazione in questo studio è stato effettuato usando CellProfiler versione 2.1.1. Tutorial per CellProfiler che sono stati utilizzati possono essere trovate altrove (lista & https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk = PL7CC87670239B4D10). Se viene utilizzata una versione più recente di CellProfiler, la pipeline è in potrebbe di richiedere adeguamenti minori.</li>
		<li>Scarica il gasdotto punctae_gH2AX.cpipe. Selezionare File > Import > Pipeline dal file e scegliere punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>Drag-and-drop nella cartella contenente le immagini acquisite dei fuochi γH2A.X nella finestra di elenco di File nella sezione Moduli Input/immagini per analisi (Figura 5A). Quindi, seguire le istruzioni come mostrato in Figura 5A-L.</li>
		<li>Impostare i seguenti parametri per le immagini:<ol>
<li>L' elenco dei File, trascinare l'immagine desiderata per l'analisi. In moduli di Input, selezionare Immagini (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5A ). Nei moduli di Input, selezionare i metadati (per le impostazioni del modulo, vedere figura 5B ). Nei moduli di Input, selezionare NamesAndTypes (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5 ).</li>
			<li>Per i gruppi, selezionare no. Nei moduli di analisi, selezionare ColorToGray (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5 ).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nei moduli di analisi, selezionare liscia (vedere Figura 5E per le impostazioni del modulo). Nota: Questo valore potrebbe essere necessario essere ottimizzata, a seconda della risoluzione di immagine.</li>
		<li>Nei moduli di analisi, selezionare IdentifyPrimaryObjects (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5F ). Nota: Ottimizzare questi valori per assicurarsi che sia selezionato l'intero nucleo. Dopo questo passaggio, il computer può lag.</li>
		<li>Nei moduli di analisi, selezionare liscio (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5 ). Nota: Questo valore potrebbe essere necessario essere ottimizzata, a seconda della risoluzione di immagine.</li>
		<li>Nei moduli di analisi, selezionare EnhanceOrSuppressFeatures (vedere la Figura 5 H per le impostazioni del modulo).</li>
		<li>Nei moduli di analisi, selezionare IdentifyPrimaryObjects (per le impostazioni del modulo, vedere Figura 5I ). Nota: Ottimizzare questi valori per assicurarsi che siano selezionati il punctae. Dopo questo passaggio, il computer potrebbe rimanere ancora una volta.<ol>
<li>Nei moduli di analisi, selezionare RelateObjects (Vedi Figura 5J per le impostazioni del modulo). Nei moduli di analisi, selezionare ClassifyObjects (vedere la Figura 5 K per le impostazioni del modulo). Nei moduli di analisi, selezionare ExportToSpreadsheet (vedere la Figura 5 L per le impostazioni del modulo).</li>
			<li>Fare clic su Analizzare immagini al pannello sinistro inferiore per eseguire l'analisi di immagine. Con il completamento dell'analisi, vengono generati diversi immagini (Figura 6A-F). Nota: Gli utenti devono salvare queste immagini per riferimento futuro.</li>
			<li>Nota il file CSV contenente i dati quantitativi per ulteriori analisi che viene generato e salvato nella posizione appropriata sul computer. Nel foglio di calcolo chiamato MyExpt_Image, le colonne B e D avrà il numero dei nuclei che hanno fino a cinque e più punctae, rispettivamente. Aggiungere colonne B e D per ottenere il numero totale dei nuclei.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ripetere il punto 2.3.3 - 2.3.8 per tutte le immagini (cambiare il nome del file MyExpt_ prima di ogni analisi). Trame possono essere fatto per valutare l'integrità del DNA, come mostrato in Figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
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<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
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<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Integrità del DNA ritrae l'integrità delle cellule. Cellule con DNA danneggiato sono frequentemente nello sforzo e alla fine perdono la loro integrità. L'integrità delle cellule staminali e derivati da cellule staminali che sono essere propagate ai fini del trapianto è principale per le cellule di svolgere la loro funzione desiderata. Trapianto di cellule con DNA danneggiato avrebbe provocato un tasso di attecchimento poveri e prestazioni della cella8,20. Di cons...

La prova sperimentale e clinica dimostra che il trapianto di cellule moderatamente può migliorare le prestazioni contrattile del ventricolo sinistro della mancata cuori1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Recenti progressi hanno aperto ulteriormente accattivante opportunità per rigenerazione cardiovascolare; Questi includono l'espressione forzata di fattori di riprogrammazione di cellule somatiche per indurre pluripotenza e differenziare queste cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in diversi lignaggi cardiache, soprattutto del cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. il materiale ereditario in ogni cellula, compresi i iPSCs generata artificialmente e CM iPSC-derivato (iPS-CM), è il DNA. Le istruzioni genetiche memorizzate nel DNA determina la crescita, lo sviluppo e funzione di cellule, tessuti, organi e organismi. Il DNA non è inerte; metaboliti, come reattivi dell'ossigeno carbonilico e specie dell'azoto, di cella e gli agenti d'alchilazione può DNA causa danni in vitro e in vivo14,15,16,17. D'importanza, il danno del DNA si verifica in modo intuitivo in ogni cellula, con una frequenza significativa. Se questi danni non sono corretti, che porterà a mutazione del DNA, senescenza cellulare, la perdita di integrità del DNA e delle cellule e possibilmente, malattie, compreso i cancri mortali. Quindi, mantenendo l'integrità del DNA è essenziale per qualsiasi cella, soprattutto iPSCs, che ha un enorme potenziale nella clinica.
Per valutare la quantità e l'integrità del DNA genomico isolato, costose attrezzature sono disponibile sul mercato. Tuttavia, non ci sono nessun metodi semplici ed economici per valutare l'integrità del DNA in cellule senza isolare le cellule. Inoltre, utente-indotta di degradazione del DNA durante l'isolamento del DNA è uno dei principali svantaggi nell'uso di questi metodi. Le singole cellule gel elettroforesi (noto come analisi della cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 tecniche sono approcci fondamentali nei laboratori di ricerca per valutare il danno del DNA. Questi due metodi non richiedono attrezzature costose o isolato il DNA di genomic per analizzare DNA integrità8,20,21. Da allora, queste tecniche sono state effettuate con cellule intere; degradazione di DNA/RNA/proteina indotta da utente durante la preparazione del campione non influiranno questi protocolli. Qui, per valutare il danno del DNA e la risposta al danno al DNA in cellule staminali e derivati da cellule staminali, forniamo dettagliati protocolli per eseguire sia il comet assay e γH2A.X immunolabeling. Inoltre, la combinazione di questi due approcci, proponiamo una valutazione ingenuo che può essere utilizzata per valutare l'idoneità della cella per il trapianto.
Il test della cometa, o cella singola elettroforesi del gel, misura le rotture del DNA nelle cellule. Incorporato in basso punto di fusione dell'agarosi le cellule vengono lisate per nucleoids modulo contenente DNA supercoiled. All'elettroforesi, piccoli pezzi di DNA frammentato e filamenti di DNA rotti migrano attraverso i pori di agarosio, considerando che il DNA intatto, a causa della loro enorme dimensione e la loro coniugazione con la proteina della matrice, avrà una migrazione con restrizioni. Il modello di DNA macchiato con un microscopio a fluorescenza imita una cometa. La testa di cometa contiene DNA intatto e la coda è composta da frammenti e rotta filamenti di DNA. La frazione di danno del DNA può essere misurata con l'intensità di fluorescenza del DNA danneggiato (coda della cometa) riguardante l'intensità di (testa di cometa) DNA intatto. Il momento di coda di parametro può essere calcolato come illustrato nella Figura 1.
Danno al DNA induce la fosforilazione dell'istone H2A. X (γH2A.X) a Ser139 da chinasi ATM, ATR e DNA-PK. La fosforilazione e l'assunzione di H2A. X alle rotture del filo del DNA si chiama risposta al danno al DNA (DDR) e avviene rapidamente dopo il DNA è danneggiato. A seguito di questo processo, arresto del ciclo cellulare di checkpoint-mediata e DNA vengono avviati processi di riparazione. Dopo il completamento della riparazione del DNA, γH2A.X è defosforilata e inattivato da fosfatasi. Prolungata e più rotture del filo del DNA portano all'accumulo di γH2A.X i fuochi nel DNA. Questo indica l'incapacità delle cellule di riparare il danno del DNA e la perdita di integrità del DNA. Questi focolai γH2A.X nel DNA possono essere identificati da e il numero dei fuochi DDR può essere contato utilizzando il protocollo nella sezione 2.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>vetrino da camera a 8 pozzetti</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>Soluzione per il distacco delle cellule</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Supplemento, senza siero,</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita Matrigel ridotto</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>FalloidinaA488</td><td>Tecnologia della vita</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-istone H2A. Tecnologia di segnalazione cellulare anticorpale X (Ser139)</td><td></td><td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; Colorazione gel per acido nucleico Green I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

valutazione dell'integrità del dna di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Cellule staminali e derivati da cellule staminali hanno un potenziale immenso come terapia rigenerativa per varie malattie degenerative. Il DNA è il magazzino dei dati genetici in tutte le cellule, comprese le cellule staminali, e la sua integrità è fondamentale per la sua capacità rigenerativa. Cellule staminali subiscono rapida propagazione nei laboratori per ottenere i numeri necessari per il trapianto. Crescita accelerata delle cellule porta alla perdita di integrità del DNA dai metaboliti accumulati, come reattive dell'ossigeno, del carbonilico e agenti alchilanti. Trapianto di queste cellule porterebbe a scarso attecchimento e rigenerazione dell'organo deterioramento. Inoltre, trapiantando cellule con DNA danneggiato porta a mutazioni, instabilità del DNA, senescenza cellulare e possibilmente, life-threatening malattie come il cancro. Di conseguenza, c'è un'esigenza immediata di un metodo di controllo di qualità valutare l'idoneità della cella per il trapianto. Qui, forniamo dettagliate protocolli per la valutazione dell'integrità del DNA delle cellule staminali prima del trapianto di cellule.

Cellule staminali pluripotenti indotte umane sono state coltivate e il danno del DNA e al momento di coda, che sono stati utilizzati come misura dell'integrità del DNA, sono stati analizzati dall'analisi della cometa. le cellule iPS sono state incorporate nell'agarosi di basso-punto di fusione e posti su un vetrino. Le cellule sono state, quindi, trattate con buffer di Lisi, seguita da una soluzione alcalina, per ottenere il DNA supercoiled. Nucleoids erano electrophoresed e comete sono s...

Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un apparato sperimentale per un'analisi della valutazione dell'integrità del DNA nelle cellule staminali prima del trapianto di cellule.

Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Per le malattie neonatale come la cardiomiopatia, la terapia rigenerativa con cellule staminali pluripotenti indotte ha un enorme potenziale. Tuttavia, la crescita accelerata delle cellule in vitro porta al danno del DNA da parte di metaboliti accumulati come le specie reattive dell'ossigeno. Il trapianto di queste cellule danneggiate dal DNA comporterebbe uno scarso innesto e rigenerazione dell'organo.Prima del trapianto, la qualità delle cellule deve essere valutata. Qui forniamo due protocolli passo-passo per valutare il danno al DNA nelle cellule staminali. A dimostrare le procedure saranno Jessica Miller, ricercatrice, Nikhil Mardhekar, ricercatrice, e Vasanthi Rajasekaran, tecnico di laboratorio.Per iniziare, posizionare 500 milligrammi di agarosio a bassa fusione in 100 millilitri di acqua priva di DNA-RNA. Scaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si dissolve. Quindi, posizionare la bottiglia in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius fino a quando necessario.Per preparare diapositive di comete pre-rivestite, posizionare alcune gocce dello 0,5% di agarosio su uno scivolo di vetro. Stendere immediatamente l'agarosio per formare un sottile strato di rivestimento di agarosio utilizzando un copripasta. Lavorando in condizioni di scarsa illuminazione per evitare danni cellulari indotti dalla luce ultravioletta, mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare e 90 microlitri di soluzione di agarosio in un tubo.Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per evitare che l'agarosio si solidifica. Mescolare la soluzione senza introdurre bolle d'aria e pipettare 70 microlitri per punto sul vetrino pre-rivestito. Utilizzando una punta di pipetta, stendere la miscela di agarosio cellulare per formare uno strato sottile.Posizionare la diapositiva a quattro gradi Celsius per 15 minuti. In un contenitore, immergere completamente lo scivolo nel tampone di lysis fredda. Posizionare il contenitore al buio a quattro gradi Celsius per un'ora.Sostituire il tampone di lisi con soluzione alcalina fredda. Assicurarsi che le diapositive siano completamente sommerse. Dopo aver lasciato il contenitore al buio a quattro gradi Celsius per altri 30 minuti, posizionare lo scivolo in un serbatoio di elettroforesi orizzontale.Riempire il serbatoio con tampone di elettroforesi alcalina fredda fino a quando i vetrini sono completamente sommersi. Applicare la tensione a un volt per centimetro per 15-30 minuti. In un contenitore, immergere completamente lo scivolo in acqua fredda deionizzata.Dopo due minuti, rimuovere l'acqua deionizzata e aggiungere acqua fresca deionizzata, quindi ripetere questo passaggio una seconda volta. Quindi, sostituire l'acqua deionizzata con 70% di etanolo freddo. Dopo cinque minuti, rimuovere delicatamente lo scivolo senza inclinarlo e lasciarlo asciugare all'aria.Una volta asciugato, aggiungere 100 microlitri di colorante di DNA diluito in ogni punto e attendere 15 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando un filtro FITC in un microscopio a epifluorescenza, scatta immagini da 50 a 100 comete in totale per campione. Cultura cardiomiociti derivati da iPS come descritto nel protocollo di testo.Per vedere i cardiomiociti derivati da iPS nelle diapositive da camera, prima scartare il mezzo di coltura dai pozzi e lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside per pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Controllare la piastra al microscopio per il distacco cellulare.Quindi aggiungere un millilitro di CMM per fermare la tripina. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 200 volte g. Scartare il mezzo, aggiungere un millilitro di CMM e rimospend le celle.Contare le celle e regolare il conteggio delle celle per ottenere due milioni di celle in 1,6 millilitri di CMM. Ora semina 200 microlitri di sospensione cellulare per pozzo dello scivolo da camera a otto pozzi. Toccare delicatamente la diapositiva per stendere le celle intorno al pozzo.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Per il trattamento con doxorubicina di cardiomiociti derivato da iPS, scartare il mezzo di coltura dai pozzi cardiomiociti derivati da iPS e lavare le cellule con PBS. Trattare le cellule con doxorubicina un micromolare per quattro ore a 37 gradi Celsius.Aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS. Per eseguire l'immunoetichettatura, lavare le cellule tre volte con PBS e aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide al 4% preparata al momento ad ogni pozzo. Fissare le cellule per 20 minuti al buio a temperatura ambiente.Dopo aver lavato le celle con PBS, aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco per pozzo e bloccare per 30 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere 200 microlitri di soluzione anticorpale primaria. Dopo aver incubato per 45 minuti in una camera umidificata scura a temperatura ambiente, lavare i pozzi tre volte con PBS.Rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di miscela di anticorpi secondari. Incubare per 45 minuti in una camera umidificata scura a temperatura ambiente. Quindi lavare i pozzi tre volte con PBS.Lavare con acqua deionizzata prima di montare gli scivoli con antifade. Posizionare un vetro di copertura e conservare gli scivoli al buio a quattro gradi Celsius. Utilizzando un microscopio confocale, prendi da tre a cinque immagini di campi casuali per campione e procedi all'analisi delle immagini.Per contare i focolai di risposta ai danni del DNA, scaricare e installare CellProfiler. Selezionate file, importate, condotte dal file e scegliete il file della tubazione denominato puncti gamma-H2AX. Trascinare la cartella contenente le immagini acquisite dei fuochi gamma-H2AX nella finestra dell'elenco dei file nella sezione immagini dei moduli di input per l'analisi.Quindi seguire le istruzioni come mostrato nel protocollo di testo. Per impostare i parametri per le immagini, trascinare l'immagine desiderata per l'analisi nell'elenco dei file. In Moduli di input selezionare immagini.Anche nei moduli di input, selezionare i metadati e quindi selezionare nomi e tipi. Per i gruppi, selezionare no. Lavorando nei moduli di analisi, selezionare da colore a grigio.Quindi selezionare smussato, identificare gli oggetti primari e selezionare di nuovo liscio. Selezionare quindi migliora o sopprimere le feature e quindi identificare gli oggetti primari. Ancora lavorando nei moduli di analisi, selezionare Correla oggetti, quindi classificare gli oggetti e infine selezionare esporta in foglio di calcolo.Fate clic su Analizza immagini nel pannello in basso a sinistra per eseguire l'analisi delle immagini. Al completamento dell'analisi, vengono generate diverse immagini. Si noti il file CSV generato e salvato nel percorso appropriato nel computer.Questo file contiene i dati quantitativi per ulteriori analisi. Nel foglio di calcolo chiamato immagine dell'esperimento, la colonna B avrà il numero di nuclei che hanno fino a cinque puncti, e la colonna D avrà il numero di nuclei che hanno più di cinque puncti. Aggiungere le colonne B e D per ottenere il numero totale di nuclei.Ripetere questi passaggi per tutte le immagini, modificando il nome del file dell'esperimento prima di ogni analisi. Qui sono riportate micrografie rappresentative di comete provenienti da cellule iPS non trattate e non trattate. Una quantità basale di danno al DNA è stata trovata nelle cellule iPS, espressa come frazione del danno al DNA e del momento della coda.Tuttavia, il trattamento doxo ha aumentato il danno al DNA nelle cellule iPS come previsto, indicando che il test della cometa può essere utilizzato per valutare l'integrità del DNA nelle cellule staminali pluripotenti. Qui sono mostrate micrografie rappresentative dell'immunoetichettatura gamma-H2AX, con un ingrandimento inferiore e un ingrandimento più elevato. Nei cardiomiociti derivati dall'iPS di controllo, più del 90% delle cellule aveva meno di cinque focolai DDR per nuclei.E un totale di meno del 10% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Per i cardiomiociti derivati dall'iPS coltivati per sei mesi, meno del 90% delle cellule aveva fino a cinque focolai DDR per nuclei, e un totale di oltre il 13% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Mentre nei cardiomiociti derivati dall'iPS trattati con doxo, meno dell'80% delle cellule aveva fino a cinque focolai DDR per nuclei.E un totale di circa il 24% delle cellule aveva più di sei focolai DDR per nuclei. Questi dati indicano che la coltura prolungata di cellule cardiomiociti derivate da iPS e il trattamento doxo hanno indotto danni significativi al DNA, rendendoli inadatti al trapianto di cellule. È molto importante evitare variabili durante la miscelazione della sospensione cellulare, in quanto ciò potrebbe influire sull'elettroforesi.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire i test delle comete e le procedure di immunoetichettatura con cellule di vari tipi. Queste tecniche consentiranno di valutare cellule di vario tipo per il danno al DNA prima di essere utilizzate negli studi sul trapianto di cellule.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

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Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Qui si descrive in vivo mutagenesi saggio per un piccolo numero di cellule ematopoietiche purificate utilizzando il modello di topo transgenico LacI. Il gene LacI può essere isolato per determinare la frequenza, la posizione ed il tipo di mutanti DNA sorto spontaneamente o dopo l'esposizione a genotossine.

L&#39;identificazione del DNA Mutazioni in depurata ematopoietiche cellule staminali / progenitrici

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

La quantificazione del turnover dei cardiomiociti è impegnativa. Il protocollo qui descritto fornisce un contributo importante a questa sfida, consentendo una quantificazione accurata e sensibile della generazione di nuclei neo-cardiomiocitari e della ploidia dei nuclei.

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Migliorare l'innesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di Rho Kinase

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Valutazione della terapia di modulazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti 2D derivati da cellule staminali umane

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Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

Impara a valutare l'integrità del DNA nelle cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca. Questi protocolli garantiscono la qualità delle cellule prima del trapianto, migliorando l'efficacia delle terapie rigenerative.

Valutazione dell'integrità del DNA di cellule staminali per la terapia cellulare cardiaca

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