Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta
28 dicembre 2018
In questo protocollo, dimostriamo come allevare gli adulti Astyanax mexicanus , sollevare le larve ed eseguire immunohistochemistry intero-monta il pesce post-larvale per confrontare i fenotipi della superficie e Grotta morfotipi.
Qui dimostriamo come allevare il messicano Tetra Astyanax Mexicanus, allevare le larve ed eseguire l'immunoistochimica a montaggio intero sui pesci post larvali per confrontare i fenotipi di pesci adattati al fiume e alle caverne. Alziamo il pesce alla stessa densità con una dieta ricca di nutrienti di rotiferi. Questa tecnica garantisce una crescita costante e offre vantaggi in termini di costi, biosicurezza e qualità dell'acqua.
Per iniziare, posizionare una rete di plastica nella parte inferiore di un serbatoio da cinque galloni. Quindi riempire il serbatoio con acqua pronta per il pesce. Apporre uno scaldabagno sul lato del serbatoio.
Aggiungi una femmina e due pesci astyanax mexicanus maschi che hanno più di un anno al serbatoio. Impostare la temperatura dello scaldabagno a 24 gradi Celsius. Dopo 24 ore, aumentare la temperatura di un grado Celsius.
Illumina una torcia elettrica sul fondo del serbatoio ogni giorno per verificare la presenza di uova. Una volta identificate le uova nel serbatoio di riproduzione, rimuovere il pesce adulto e la rete di plastica. Utilizzare un becher per ridurre la profondità dell'acqua a 10 cm.
Per stimare il tempo di fecondazione, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare diverse uova in una piastra di Petri e visualizzarle con un microscopio stereo per determinarne lo stadio. Rimuovere uova o feci opache. Quindi riempire il serbatoio con acqua pronta per il pesce e aggiungere sette gocce di blu di metilene all'acqua.
Dopo questo, aggiungi un riscaldatore e un bubbler dell'acquario al serbatoio. Impostare il riscaldatore a 24 gradi Celsius e regolare il regolatore del flusso d'aria per produrre un flusso delicato di bolle. Quindi coprire il serbatoio per mantenere la temperatura dell'acqua.
Aggiungere 20 grammi di sale a otto litri di acqua pronta per il pesce e mescolarla fino a quando non viene sciolta. Quindi aggiungere un litro dell'acqua preparata a ogni contenitore del vivaio. Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare 20 delle larve tratteggiate in ogni contenitore del vivaio.
Agitare l'acqua nel serbatoio più grande per assicurarsi che tutte le larve siano state rimosse. Per preparare il cibo per pesci, aggiungere tre ml di miscela di alghe a un litro di rotiferi raccolti. Cinque giorni dopo la fecondazione aggiungono tre ml del cibo per pesci a ciascun contenitore del vivaio.
I rotiferi devono essere visibili in gruppi densi all'angolo dei contenitori, a meno che non siano visibili vicino al centro. Controllare il contenitore per le rotifere ogni giorno e aggiungere più cibo se la concentrazione è esaurita. Rimuovere eventuali larve morte.
In primo luogo, per cancellare il tratto gastrointestinale del contenuto alimentare, versare il contenitore del vivaio con il pesce dell'età desiderata attraverso un colino a rete di nylon. Mettere il colino in un contenitore con acqua pulita pronta per il pesce e trattenere il cibo per 24 ore. Dopo aver eutanasiato il pesce, secondo le linee guida istituzionali, utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire il pesce in un tubo conico.
Sostituire la soluzione di eutanasia con fissante. E incubare il tubo con dondolo durante la notte a 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il fissatore e sostituirlo con PBST.
Incubare il tubo per altri 15 minuti con il dondolo. E ripeti il processo di lavaggio ancora una volta. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare il pesce su una fiala di vetro da quattro ml con un tappo superiore a vite.
Rimuovere il PBST dal flaconcino e aggiungere tre ml di soluzione di blocco. Incubare il flaconcino a temperatura ambiente per un'ora con il dondolo. Successivamente, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere la soluzione di blocco e sostituirla con anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco.
Incubare il flaconcino durante la notte a temperatura ambiente con agitazione. Successivamente, lavare il pesce con PBST tre volte, come descritto in precedenza. Sostituire il PBST con anticorpi secondari diluiti in soluzione di blocco.
E incubare il flaconcino durante la notte a temperatura ambiente con agitazione. Infine, lavare il pesce tre volte per 15 minuti con PBST. Utilizzando questo protocollo, i pesci di superficie Tinaja, Molino e Pachon sono stati allevati in serbatoi di riproduzione statici.
La superficie e pachon si generano, con embrioni fecondati, hanno sempre prodotto larve tratteggiate. Mentre i Molino e i Tinaja non ebbero successo. In generale, i pesci di superficie producevano il maggior numero di larve per deposizione delle uova, seguiti rispettivamente da Pachon, Tinaja e Molino.
La tecnica di immunostaining a montaggio intero è stata utilizzata con successo per etichettare neuroni e cellule pancreatiche in fasi fino a 12,5 giorni dopo la fecondazione. È importante rimuovere qualsiasi pesce morto mentre alleva le larve e registri il numero di pesci sopravvissuti. Se molti pesci muoiono può essere dovuto a contaminazione batterica o fungina.
I serbatoi devono essere sterilizzati con il 70% di etanolo prima dell'uso. La tecnica di immunostaining che abbiamo descritto è stata utilizzata con successo per gli anticorpi elencati nella tabella dei materiali. Dopo l'immunosocienza, i pesci possono essere montati interi o se vengono se vengono se vengono netti per visualizzare qualsiasi tessuto di interesse.
In combinazione, la procedura di allevamento, schiusa e immunosocienza fornisce un metodo robusto per valutare l'attività genica NC2 in modo comparabile tra i laboratori.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'allevamento di adulti di Astyanax mexicanus, la crescita delle larve e l'esecuzione di immunoidistochimica su pesci post-larvali in toto. Lo studio confronta i fenotipi di morfotipi di superficie e di grotta.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Morfologia comparata
Sfondo
- Astyanax mexicanus mostra distinti morfotipi di superficie e di caverna.
- Comprendere le differenze fenotipiche può fornire informazioni sui meccanismi di adattamento.
- L'immunohistochimica su preparati interi è una tecnica preziosa per visualizzare le strutture cellulari.
- Condizioni di crescita costanti sono essenziali per ottenere risultati sperimentali affidabili.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo di allevamento per Astyanax mexicanus.
- Confrontare i fenotipi di pesci adattati a fiumi e a caverne.
- Utilizzare l'immunohistochemica per l'analisi cellulare.
Metodi Utilizzati
- Allevamento di adulti riproduttivi in un ambiente controllato.
- Allevamento delle larve con una dieta ricca di nutrienti a base di rotiferi.
- Esecuzione di immunohistochimica su preparato intero su pesci post-larvali.
- Documentazione dei tassi di sopravvivenza e degli esiti fenotipici.
Risultati principali
- È stato ottenuto un accoppiamento riuscito tra i morfotipi di superficie e di caverna.
- I pesci di superficie hanno prodotto un numero maggiore di larve per deposizione rispetto ai pesci di caverna.
- La colorazione immunologica ha etichettato efficacemente i neuroni e le cellule pancreatiche.
- I tassi di sopravvivenza sono stati monitorati per valutare lo stato di salute e i rischi di contaminazione.
Conclusioni
- Il protocollo stabilito fornisce un metodo affidabile per l'allevamento e l'analisi di Astyanax mexicanus.
- Studi comparativi possono migliorare la comprensione delle adattamenti evolutivi.
- L'immunohistochimica è uno strumento potente per lo studio della biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La definizione di protocolli standardizzati per la coltura post-larvale e l'immunomarcatura di Astyanax mexicanus permette un'analisi fenotipica comparativa tra i morfotipi di superficie e quelli cavernicoli. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi fornendo un sistema rilevante per lo studio delle malattie, utile per analizzare tratti adattativi e la funzione genica nello sviluppo. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nella fase iniziale della scoperta, consentendo la riduzione del rischio meccanicistico dei percorsi conservati attraverso il confronto tra popolazioni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche confrontando la divergenza fenotipica negli stadi post-larvali tra popolazioni di superficie e popolazioni di grotta.
- Valore operativo: Fornisce un sistema standardizzato di acquacoltura per generare coorti larvali con densità controllata, riducendo la variabilità biologica nei saggi di convalida degli obiettivi.
- Valore scientifico: Supporta la convalida funzionale degli obiettivi mediante immunomarcatura su preparati interi per valutare i profili di espressione genica nei neuroni e nelle cellule pancreatiche, senza l'uso di reporter transgenici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera fenotipi post-larvali riproducibili adatti allo screening ad alto contenuto di composti che influenzano i percorsi dello sviluppo.
- Valore operativo: Standardizza l'allevamento larvale con diete a base di rotiferi in sistemi statici, garantendo una crescita costante e riducendo al minimo le variabili di confondimento nei risultati dei saggi.
- Valore scientifico: Permette misurazioni fenotipiche quantitative mediante immunomarcatura, favorendo la standardizzazione dei saggi e la comparabilità dei dati tra laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita l'allineamento traslazionale dei biomarcatori collegando le differenze fenotipiche post-larvali a tratti di sopravvivenza nell'adulto negli ambienti dei pesci cavernicoli.
- Valore operativo: Supporta lo sviluppo di modelli preclinici stabilendo protocolli di allevamento iniziale scalabili all'allevamento adulto per studi fenotipici a lungo termine.
- Valore scientifico: Promuove la riduzione del rischio meccanicistica permettendo il confronto di vie di sviluppo conservate coinvolte nell'adattamento e nella resistenza alle malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una piattaforma standardizzata per lo screening fenotipico e la validazione del bersaglio prima degli sforzi di identificazione del capostazione.
- Biologia della Scoperta: Consente la verifica di ipotesi sui geni dello sviluppo confrontando i modelli di immunomarcatura tra pesci post-larvali derivati da ambienti superficiali e sotterranei.
- Screening: Fornisce popolazioni larvali pronte per i saggi, con parametri costanti di crescita e sopravvivenza, sostenendo campagne di screening di composti in modo riproducibile.
- Analisi: Produce letture quantitative di immunohistochimica che permettono ai gruppi di lavoro di confrontare i livelli di espressione proteica tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega lo screening fenotipico precoce ai tratti adattativi adulti, supportando decisioni di avanzamento ponderate sui rischi nello sviluppo preclinico.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una struttura di allevamento e una piattaforma di immunomarcatura riutilizzabili, applicabili in numerosi studi volti a indagare la funzione dei geni dello sviluppo in modelli vertebrati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione delle target riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso il confronto fenotipico diretto di varianti adattative.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori grazie a protocolli definiti per l'allevamento delle larve e per l'immunomarcatura.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o abbandono delle target consentendo una riduzione precoce dei rischi basata su risposte fenotipiche conservate in modelli pertinenti alla malattia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio fornendo dati empirici sugli effetti della modulazione delle target in un sistema comparativo geneticamente accessibile.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento di zebrafish e nella coltivazione di cibo vivo (rotiferi) per un allevamento larvale di successo.
- È subordinato all'accesso a microscopia fluorescente e a reagenti standardizzati per immunoreazioni per il rilevamento di cellule neuronali e pancreatiche.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro delle procedure di fissazione, bloccaggio e incubazione con gli anticorpi per garantire risultati di colorazione riproducibili.
- Comporta la necessità di adattamenti qualora si estenda il protocollo ad altre specie di pesci o a stadi di sviluppo superiori ai 12,5 giorni dopo la fecondazione.
- Presenta limitazioni pratiche, come il variabile successo di deposizione delle uova in alcune popolazioni di caverne (ad esempio, Molino, Tinaja), che richiedono rapporti di riproduzione modificati o un numero maggiore di ripliche.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
Breeding
1:20
Hatching Fertilized Eggs
2:16
Transfer of Hatched Larvae to Nursery Containers
2:45
Preparation of Rotifer-based Fish Food and Feeding of Post-Larval Fish
3:19
Whole-Mount Immunohistochemistry of Post-Larval Fish
5:11
Results: Surface Fish Produce Greatest Number of Larvae per Spawn
5:56
Conclusion
