Name: Lesame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Impara a misurare la suscettibilità antibiotica di Neisseria gonorrhoeae in aggregati utilizzando saggi ATP e colorazione Live/Dead. Questo metodo quantifica la sopravvivenza batterica dopo trattamento con ceftriaxone.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal National Institute of Health D.C.S e W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., ed E.N. sono stati sostenuti in parte/partecipare al programma "Il primo anno l'innovazione & ricerca Experience" finanziato dall'Università del Maryland. I finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Riconosciamo l'UMD CBMG Imaging Core per tutti gli esperimenti di microscopia.

1. generale manutenzione dei ceppi di GC
<ol><li>Striscia N. gonorrhoeae ceppi su agar GCK con 1% Kellogg integratori18 (tabella 1, tabella 2) dalle scorte di congelatore e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 16-18 h. uso MS11 esprimendo la variabile phase Opa (MS11Opa +), nessuna Opa (MS11ΔOpa), o un LOS troncato (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Scegliere attentamente pili negativi (Colonia, senza bordo scuro) o colonie positive (Colonia con bordo scuro) da ogni ceppo basato su Colonia morfologia19 utilizzando un microscopio per dissezione e striscia su un piatto GCK nuovo.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 16-18 h prima dell'uso.</li>
</ol>2. quantificazione di attuabilità delle aggregazioni di GC
<ol><li>Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. Tampone di GC dalla piastra e risospendere GC in brodo pre-riscaldato (GCP, tabella 3) completati con 4,2% NaHCO3 e 1% Kellogg soluzioni18. Utilizzare spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm (un OD650 di 1 = ~ 1 x 109 CFU/mL) per determinare la concentrazione di batteri sospesi.</li>
	<li>Regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 108 UFC/mL.</li>
	<li>Aggiungere 99 µ l della sospensione di GC regolata nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Incubare la piastra per 6 h a 37 ° C con 5% CO2 per consentire i batteri da aggregare.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di ceftriaxone diluito seriale (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µ g/mL) in ciascun pozzetto. Lasciare alcuni pozzi non trattate per servire come controlli.</li>
	<li>Incubare la piastra per 24 h a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Sonicare la sospensione 3 volte in ogni pozzetto per 5 s a 144 W e 20 kHz.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di reagente di bagliore utilizzazione ATP disponibile in commercio in tutti i pozzetti, Pipettare fino- e giù per 3 volte e incubare per 15 min a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Attentamente trasferire 150 µ l di miscela da ogni pozzetto in un nuovo pozzo in una micropiastra 96 pozzetti nero ed evitare di introdurre bolle.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 560 nm utilizzando il lettore di piastra.</li>
	<li>Calcolare il tasso di sopravvivenza dal rapporto tra la lettura ottenuta dopo il trattamento di ceftriaxone seriale alla lettura da pozzi non trattati.</li>
</ol>3. analisi microscopiche fluorescenza di Live/Dead degli aggregati di GC
<ol><li>Raccogliere GC utilizzando un applicatore sterile. GC di tampone dalla piastra e risospendere GC in media GCP plus 1% pre-riscaldato Kellogg integratori.</li>
	<li>Determinare il numero di batteri mediante spettrofotometria ad una lunghezza d'onda di 650 nm e regolare la concentrazione di GC a ~ 1 x 107 CFU/mL.</li>
	<li>Aggiungere 198 µ l della sospensione di GC nelle camere a 8 pozzetti vetrino coprioggetti-fondo.</li>
	<li>Incubare la camera per 6 h a 37 ° C con 5% CO2 per permettere la formazione di aggregazione.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di ceftriaxone (100 µ g/mL o varie diluizioni) in ogni pozzetto all'interno di ogni condizione di aggregazione. Incubare per il tempo desiderato a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Aggiungere 0,6 µ l di miscela di soluzione colorante live/dead in ogni pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Acquisire immagini di Z-serie utilizzando un microscopio confocale (può essere utilizzato un microscopio equivalente).</li>
	<li>Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ per la misura delle dimensioni degli aggregati di GC e il rapporto di intensità di fluorescenza (FIR) di vivere-a-morti macchiatura in ogni funzione di aggregazione.</li>
</ol>4. analisi di immagine
<ol><li>Stima delle dimensioni degli aggregati batterici.<ol>
<li>Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.</li>
		<li>Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione nell'immagine del cerchio.</li>
		<li>Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.</li>
		<li>Ottenere il numero in una nuova finestra sotto la colonna di zona .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificazione del rapporto vive-di-morte di aggregazioni<ol>
<li>Aprire ImageJ e aprire un'immagine trascinando un file di immagine raw alla barra dei menu di ImageJ.</li>
		<li>Fare clic su analisi | Impostare misure nella barra dei menu di ImageJ.</li>
		<li>Controllare la densità integrata nella finestra a comparsa e fare clic su OK.</li>
		<li>Fare clic su immagine di | Colore | Canali strumento nella barra dei menu e selezionare il colore.</li>
		<li>Controllo canale 1 come la fluorescenza per batteri vivi che macchia.</li>
		<li>Fare clic su Linee a mano libera nella barra dei menu di ImageJ e l'area di ogni aggregazione del cerchio.</li>
		<li>Fare clic su analisi | Misura nella barra dei menu di ImageJ.</li>
		<li>Ottenere il numero nella colonna IntDen .</li>
		<li>Verifica canale 2 come la fluorescenza per la macchiatura morto batterica. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.2.8.</li>
		<li>Ottenere il rapporto di vive-di-morte dividendo il numero di passaggio 4.2.8 di numero dal passaggio 4.2.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi statistica<ol>
<li>Aprire GraphPad Prism e immettere i numeri ottenuti da ImageJ per la colonna desiderata.</li>
		<li>Fare clic su analizza e seleziona t test sotto analisi colonna.</li>
		<li>Controllare la colonna desiderata per il confronto e fare clic su OK.</li>
		<li>Ottenere il P-valore sotto la finestra di analisi .</li>
		<li>Selezionare la Regressione lineare sotto analisi XY dal passaggio 4.3.3</li>
		<li>Ottenere la R-quadrato e il P-valore sotto la finestra di analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I batteri possono formare biofilm durante l'infezione del corpo umano. Test di MIC tradizionale potrebbe non riflettere la concentrazione necessaria per sradicare i batteri nel biofilm. Per verificare gli effetti antimicrobici su un biofilm, metodi basati sulla biomassa di biofilm, nonché CFUs di placcatura possono essere errati a causa dell'impatto della struttura del biofilm. Ad esempio, il metodo di placcatura funziona solo se il biofilm può essere interrotta. Quindi, il CFU ottenuto può essere inferiore rispetto al n...

La gonorrea è che una comune infezione (STI)1trasmesse per via sessuale. Neisseria gonorrhoeae (GC), un batterio gram-negativo diplococcal, è l'agente eziologico di questa malattia. I sintomi dell'infezione genitale possono provocare dolore durante la minzione, dolore genitale generalizzato e scarico uretrale. L'infezione è spesso asintomatica2,3,4,5, e in questo modo estesa colonizzazione. Queste infezioni non trattate sono un problema sanitario importante, come hanno il potenziale per facilitare la trasmissione dell'organismo e questo può portare a complicazioni come la malattia infiammatoria pelvica (PID) e diffuso l'infezione gonococcica (DGI)6. Gonorrea resistente agli antibiotici è una crisi di salute pubblica e un crescente onere socio-economico7. Ridotta sensibilità alle cefalosporine ha provocato il cambiamento di regime di trattamento da un singolo antibiotico a duplice terapia, che combina azitromicina o doxiciclina con ceftriaxone8. Il guasto aumentato di ceftriaxone e azithromycin9,10, in combinazione con le infezioni asintomatiche, evidenzia l'esigenza di comprendere gli insuccessi del trattamento di gonorrea.
La prova di concentrazione inibitoria minima (MIC), tra cui agar diluizione e disco test di diffusione, è stata usata come la prova medica standard per l'identificazione di resistenza ad un antibiotico. Tuttavia, non è chiaro se il MIC test riflette la resistenza antibiotica batterica in vivo. La formazione di biofilm batterici contribuisce alla sopravvivenza di batteri in presenza di concentrazioni battericide di antibiotico: il MIC Test è in grado di rilevare questo effetto11. Perché GC può formare biofilm su superfici mucose12, possiamo ipotizzare che tale antibiotico suscettibilità all'interno di aggregati sarebbe diverso da quello visto in GC individuali. Inoltre, gli studi hanno indicato che la proteina molecole di superficie variabile, Pili, opacità (Opa) a tre fasi, e lipooligosaccharides (LOS), che regolano le interazioni inter-batterio, portare a diversi aggregati di dimensioni13, 14 , 15. il contributo di questi componenti di resistenza agli antibiotico non è stato esaminato a causa della mancanza di metodi adeguati.
Attualmente, ci sono diversi metodi per misurare l'eradicazione biofilm. Il metodo quantitativo più ampiamente usato è misurando i cambiamenti nella biomassa usando cristalvioletto macchiatura16. Tuttavia, il metodo richiede significativi manipolazione sperimentale, che potenzialmente possa generare errori in esperimento ripetizioni17. Il metodo di macchiatura live/dead qui utilizzato permette la visualizzazione di batteri vivi e morti e loro distribuzione all'interno del biofilm. Tuttavia, la struttura di biofilm può rappresentare come una barriera fisica che riduce la penetrazione della tintura. Pertanto, per quantificare i batteri vive/morte all'interno di un gruppo, la colorazione è limitata a piccole biofilm oppure il suo precursore-microcolonies o aggregazioni. Altri metodi, compreso le prove di diffusione agar diluizione e disco, non sono in grado di misurare gli effetti dell'aggregazione. Per esaminare la suscettibilità di GC all'interno di aggregazione dopo esposizione agli antibiotici, un metodo ideale avrebbe bisogno di avere entrambi un dosaggio quantitativo che può misurare batteri vivi e visualizzare la loro distribuzione.
La procedura qui descritta combina una misurazione di ATP-utilizzazione e un live/dead colorazione dosaggio a quantitativamente ed esaminare visivamente la suscettibilità di GC all'interno di aggregati in presenza di antibiotici.

<table><tbody><tr><td>100x integratore</td><td></td><td></td><td></td>Kellogg's</tr><tr><td>Agar</td><td>Stati Uniti Biologico</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC base media&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato ferrico, nonaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina Polvere cristallina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight colorazione viva/morta</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Neisseria gonorrhoeae ceppo</td><td></td><td></td><td>gentilmente fornito dal Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute per Ricerca</td></tr><tr><td>Potassio fosfato bibasico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassio fosfato monobasico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Proteoso Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>Amido solubile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina pirofosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>a 8 pozzetti camera inferiore del vetrino coprioggetti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet (NU-425-600 Classe II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; Modello 3530</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale dotato di camera di imaging dal vivo</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 96 pozzetti Micropiastra in polistirene nero&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Glomax Illuminatore&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (0,1-10 &; micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1000 &; micro; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (200 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche sterili da 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Provette sterili per microcentrifuga (1,7 mL)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori sterili con punta in poliestere</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Kontes</td><td>Equivalente a 9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

l'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando atp-utilizzazione commerciale live/dead macchiatura

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

L'emergere di resistenti agli antibiotici Neisseria gonorrhoeae (GC) è una minaccia per la salute in tutto il mondo e mette in evidenza la necessità di identificare gli individui che non riescono di trattamento. Questo batterio gram-negativo causa gonorrea esclusivamente in esseri umani. Durante l'infezione, è in grado di formare aggregati e/o biofilm. Il test di concentrazione inibitoria minima (MIC) è utilizzato per determinare la suscettibilità agli antibiotici e di definire il trattamento adatto. Tuttavia, il meccanismo di eradicazione in vivo e la sua relazione ai risultati di laboratorio non sono noti. È stato sviluppato un metodo che esamina come aggregazione di GC influisce sulla sensibilità agli antibiotici e illustrata la relazione tra dimensioni di aggregazione e di sensibilità agli antibiotici. Quando aggregato GC, sono più resistenti agli antibiotici uccisione, con batteri nel centro della sopravvivenza ceftriaxone trattamento meglio di quelli in periferia. I dati indicano che l'aggregazione di N. gonorrhoeae può ridurre la sua suscettibilità a ceftriaxone, che non trova riscontro utilizzando i metodi MIC basati su piastra di agar standard. Il metodo utilizzato in questo studio permetterà ai ricercatori di testare la suscettibilità batterica in condizioni clinicamente rilevanti.

Due metodi sono stati impiegati: un'analisi di utilizzo di ATP e un saggio di colorazione live/dead. I risultati possono essere combinati o usati individualmente per l'esame di sopravvivenza batterica all'interno di aggregazioni dopo il trattamento antibiotico. Il dosaggio di utilizzazione di ATP è stato indicato per misurare con precisione praticabile batteri Staphylococcus aureus biofilm20,21. Qui, MS11Opa + Pil + ceppo...

Un'analisi di ATP-misurazione semplice e live/dead metodo di colorazione sono stati usati per quantificare e visualizzare le gonorree di Neisseria sopravvivenza dopo il trattamento con ceftriaxone. Questo protocollo può essere esteso per esaminare gli effetti antimicrobici di qualsiasi antibiotico e può essere utilizzato per definire la concentrazione inibitoria minima di antibiotici in biofilm batterici.

L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Questa tecnica ci consente di misurare la suscettibilità agli antibiotici in condizioni clinicamente più rilevanti. La tecnica ci consente anche di determinare la vera concentrazione di antibiotici che può uccidere i batteri negli aggregati. Questa tecnica può essere applicata per determinare la concentrazione necessaria per eliminare gli aggregati GC.Il metodo può anche essere applicato alla misurazione della suscettibilità antimicrobica di qualsiasi batterio in grado di formare aggregati. Prestare attenzione alle fasi di lisi per assicurarsi che lalisi sia completa. Altrimenti il saggio di misurazione ATP sottovaluterà il numero di batteri vitali.La visualizzazione di questo metodo consentirà ad altri ricercatori di seguire e replicare questo esperimento con coerenza. Inizia striando neisseria gonorrhoeae, o ceppi GC, su agar GCK integrato con 1%Kellogg per un'incubazione da 16 a 18 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. La mattina seguente, usa un microscopio chiaro per selezionare attentamente colonie pili-negative senza bordi scuri o colonie pili-positive con bordi scuri da ogni piastra e strisci le colonie raccolte su nuove piastre GCK per una coltura da 16 a 18 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.La mattina seguente, utilizzare un applicatore sterile per raccogliere colonie gc da ogni piastra e rimescolare ogni tampone in brodo caldo integrato con bicarbonato di sodio al 4,2% e soluzione 1%Kellogg. Misurare la densità ottica a 650 nanometri, o OD650, per determinare la concentrazione dei batteri sospesi e regolare la concentrazione di GC a circa una per 10 alle otto unità di formazione della colonia per millilitro. Successivamente, aggiungere 99 microlitri della sospensione GC in singoli pozzi di una piastra da 96 porri e consentire ai batteri di aggregarsi a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei ore.Al termine dell'incubazione, aggiungere un microlitro di ceftriaxone diluito serialmente ad ogni pozzo lasciando alcuni pozzi non trattati per fungere da controlli e riportare la piastra all'incubatrice per altre 24 ore. Il giorno dopo, sonicare le sospensioni in ogni pozzo tre volte a 144 watt e 20 kilohertz per cinque secondi per sonicazione e aggiungere 100 microlitri di reagente di utilizzo ATP disponibile in commercio a ciascun pozzo. Trasferire con cura 150 microlitri di miscela da ogni pozzo in singoli pozzi di una nuova micropiastra nera da 96 po 'e misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 560 nanometri su un lettore di piastre.Quindi, calcola il tasso di sopravvivenza in base al rapporto tra la lettura ottenuta dopo il trattamento antibiotico seriale e la lettura dai pozzi non trattati. Per la visualizzazione degli aggregati GC vivi/morti, utilizzare un applicatore sterile per raccogliere GC dalle piastre coltivate durante la notte e rimescolare il GC in mezzo GCP prebellico integrato con 1%Kellogg. Misurare l'OD650 per spettrofotometria e regolare la concentrazione a circa una per 10 alle sette unità di formazione della colonia per millilitro.Successivamente, aggiungere 198 microlitri di sospensione GC in camere con fondo di copra a otto pozzi e incubare le camere a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei ore. Al termine dell'incubazione, trattare i batteri con due microlitri di ceftriaxone per condizione di aggregazione e restituire le camere all'incubatore per l'appropriato periodo di incubazione sperimentale. Al termine dell'incubazione, aggiungere 0,6 microlitri di soluzione di colorazione viva / morta in ogni pozzo e restituire le camere all'incubatore per altri 20 minuti.Quindi, utilizzare un microscopio confocale per ottenere immagini della serie Z. Per misurare le dimensioni degli aggregati GC, aprite la prima immagine in ImageJ e selezionate linee a mano libera per cerchiare l'area di ogni aggregazione nell'immagine. Fare clic su analizza e misura.La dimensione degli aggregati sarà indicata sotto la colonna dell'area. Per quantificare il rapporto di intensità di fluorescenza della colorazione vivo-morto in ogni aggregato, fare clic su analizza e impostare le misurazioni e controllare la densità integrata nella finestra popup. Fare clic su OK e quindi su immagine, colore e strumento canali.Selezionare il colore e canalizzarne uno come fluorescenza per la colorazione dei batteri morti. Selezionate linee a mano libera per cerchiare l'area di ogni aggregazione e fate clic su analizza e misurate per ottenere il rapporto di intensità della fluorescenza per ogni aggregato nella colonna di densità integrata. Selezionare il canale due per la fluorescenza per la colorazione batterica viva e misurare l'intensità della fluorescenza in ogni aggregato come appena dimostrato.Quindi dividi i dati sull'intensità della fluorescenza viva per i dati sull'intensità della fluorescenza morta per ottenere il rapporto di intensità della fluorescenza da vivo a morto. In questo esperimento rappresentativo, i batteri pili positivi, aggregati pili positivi o aggregati e interrotti pili positivi non aggregati sono stati trattati con diluizioni seriali di ceftriaxone prima della misurazione dei loro livelli di ATP. Il GC preaggregato ha dimostrato una sopravvivenza significativamente più elevata rispetto al GC non aggregato o interrotto dall'aggregazione se trattato con concentrazioni uguali di ceftriaxone o superiore.I ceppi pili-positivi che formano aggregati più grandi hanno mostrato i più alti livelli di ATP dopo il trattamento con ceftriaxone rispetto ai ceppi mutanti. Indipendentemente dal ceppo testato, la colorazione viva /morta prima del trattamento antibiotico ha rivelato batteri morti in gran parte situati negli strati esterni della coltura, mentre il GC vivo è stato identificato principalmente all'interno del nucleo degli aggregati trattati con ceftriaxone. Come previsto, i batteri pili-positivi formavano gli aggregati più grandi, mentre le colture pili-negative formavano le più piccole.In particolare, gli aggregati pili-positivi erano ancora vivi nei loro strati principali dopo il trattamento antibiotico, mentre il GC nei piccoli aggregati mutanti sciolti era morto. In base alle dimensioni e alla sopravvivenza del GC, è possibile tracciare un grafico di correlazione per esaminare la relazione tra la dimensione dell'aggregazione e la sopravvivenza antibiotica dei batteri. La sonicazione è importante per assicurarsi che l'ATP di ogni singolo batterio sia rilasciato all'interno degli aggregati strettamente legati.In caso contrario, le misurazioni non saranno coerenti. È importante placcare i batteri dopo che si aggregano e vengono trattati con antibiotici per misurare sia i batteri vitali che i batteri capaci di replicazione. La tecnica misura l'influenza dell'aggregazione batterica sulla suscettibilità agli antibiotici consentendo ai ricercatori di sviluppare farmaci migliori per il trattamento delle malattie.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Cayron, J. e Lesterlin, C. Analisi multiscala della crescita batterica sotto stress. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per valutare la filamentazione di E. coli e la replicazione del DNA in un trattamento antibiotico che inibisce la divisione cellulare utilizzando la placcatura per misurare la vitalità e la citometria a flusso per analizzare le dimensioni delle cellule e il contenuto di DNA.

Valutazione della filamentazione indotta da antibiotici in E. coli mediante saggio di placcatura e citometria a flusso

Fonte: Maurakis, S. e Cornelissen, CN Crescita limitata ai metalli di Neisseria gonorrhoeae per la caratterizzazione di geni sensibili ai metalli e l'acquisizione di metalli da ligandi ospiti. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra la procedura per rilevare i trasportatori di metalli superficiali in Neisseria gonorrhoeae cresciuta in condizioni di metallo limitato utilizzando un saggio di dot blot, che coinvolge il legame del ligando, il rilevamento degli anticorpi e la visualizzazione...

Rilevamento dei trasportatori metallici di superficie in Neisseria gonorrhoeae mediante Dot Blot

Questo video mostra una tecnica in vitro per studiare l'impatto del trattamento antimicrobico sugli aggregati di Pseudomonas aeruginosa (Pa). Le cellule Pa marcate in fluorescenza vengono coltivate come aggregati, imitando il modello di crescita durante l'infezione. Dopo aver sfidato gli aggregati con una concentrazione subletale dell'antibiotico colistina, la valutazione in tempo reale dell'interazione batterio-antibiotico viene eseguita tramite microscopia a fluorescenza.

Una tecnica in vitro per studiare trattamenti antimicrobici su aggregati batterici

Questo video descrive il semplice test di misurazione dell'ATP utilizzando il reagente per la luciferasi glow. Questo test viene utilizzato per quantificare la sopravvivenza di Neisseria gonorrhoeae dopo il trattamento con ceftriaxone.

Un test di utilizzo dell'ATP per determinare la sopravvivenza batterica in trattamento antibiotico

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti.

Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

Qui, presentiamo protocolli per selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio di rilascio del colorante utilizzano substrati batterici target per la valutazione qualitativa e quantitativa dell'attività enzimatica.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Il protocollo presenta l' Escherichia coli-base pressione selettiva incorporazione degli aminoacidi non canonico (ncAAs) il lactococcal peptide antimicrobico nisina. Le proprietà possono essere modificate durante l'espressione ricombinante tramite sostituzione con ncAAs desiderata in media di sviluppo definito. Conseguenti variazioni bioattività sono mappati da saggi di inibizione di crescita e microscopia a fluorescenza.

Peptidi antimicrobici prodotte dalla pressione selettiva incorporazione di aminoacidi Non canonico

Gli antibiotici fluorescenti etichettati con fluorescente sono potenti strumenti che possono essere utilizzati per studiare molteplici aspetti della resistenza agli antimicrobici. Questo articolo descrive la preparazione di antibiotici fluorescenti con tag e la loro applicazione allo studio della resistenza agli antibiotici nei batteri. Le sonde possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di resistenza batterica (ad esempio, l'efflusso) mediante spettrofotometria, citometria di flusso e...

Visualizzazione della resistenza batterica utilizzando sonde antibiotici fluorescenti

Il mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica (SCFM2) può essere utilizzato in combinazione sia con la microscopia a scansione laser confocale che con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per osservare aggregati batterici ad alta risoluzione. Questo documento descrive in dettaglio i metodi per valutare le popolazioni aggregate durante il trattamento antimicrobico come piattaforma per studi futuri.

Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa

La resistenza agli antibiotici tra i ceppi di Escherichia coli invasivi in adesione pone difficoltà nella valutazione dell'invasione batterica utilizzando il tradizionale saggio protettivo per la gentamicina. Viene descritto un metodo migliorato per valutare quantitativamente l'invasione batterica enumerando le unità formative di colonie e qualitativamente tramite la visualizzazione delle cellule infette tramite microscopia confocale a immunofluorescenza.

Test di protezione amikacin per la quantificazione e visualizzazione dell'invasione delle cellule di Escherichia coli

Impara a misurare la suscettibilità antibiotica di Neisseria gonorrhoeae in aggregati utilizzando saggi ATP e colorazione Live/Dead. Questo metodo quantifica la sopravvivenza batterica dopo trattamento con ceftriaxone.

Lesame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura (Video) | JoVE Journal

L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

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