Ingegneria genetica di Dictyostelium discoideum cellule basata sulla selezione e crescita sui batteri
25 gennaio 2019
Dictyostelium discoideum è un organismo modello popolare per studiare i complessi processi cellulari come la migrazione cellulare, endocitosi e sviluppo. L'utilità dell'organismo è dipenda sulla fattibilità di manipolazione genetica. Qui, presentiamo metodi per transfect Dictyostelium discoideum cellule che superare i limiti esistenti delle cellule di coltura in terreno liquido.
Il valore di questo protocollo è che consente a quasi tutti i ceppo di dictyostelium discoideum di essere manipolati dalla genetica molecolare, indipendentemente dal fatto che tale ceppo crescerà axenicamente in mezzo liquido o meno. L'altro vantaggio di questa tecnica è che è veloce e semplice. Trasporre per trasfetto le cellule con un plasmide esocromosomiale prima di iniziare a mescolare i dictyosteliums.
I risultati possono già essere convalidati due giorni dopo la trasfezione tramite microscopia. È insolito lavorare con cellule di dictyostelium e sospensione batteriche. La visualizzazione aiuterà a dare agli sperimentatori un'idea di come vengono eseguiti i diversi passaggi dei protocolli.
A dimostrare la procedura con me sarà Soudabeh Imanikia, un postdoc del mio laboratorio. Per iniziare, preparare 1000 millilitri di soluzione di lavoro tampone sorensen con cloruro di magnesio e cloruro di calcio secondo il protocollo di testo. Dopo questo, usa una singola colonia di aerogeni K per inoculare un litro di mezzo LB.
Lascia che i batteri crescano durante la notte a 37 gradi celsius con tremori. Spingi le cellule in due tubi di centrifuga da 500 millilitri per raccogliere le cellule. Quindi, lavare i batteri una volta con 500 millilitri di tampone.
Rimosogliere il pellet in 20 millilitri di tampone. Utilizzare un fotometro per controllare la densità ottica del campione e diluire il campione con tampone fino a quando la densità ottica è di circa 100. Successivamente, preparare il buffer di elettroporazione H40 secondo il protocollo di testo.
Far crescere gli aerogeni K per confluire un mezzo SM durante la notte a temperatura ambiente. Aggiungere 400 microlitri di sospensione batterica a una piastra di agar SM e stenderla uniformemente. Quindi, prendere un ciclo sterile e inocularlo con cellule di dictyostelium e diffondere le cellule su un bordo della piastra.
Incubare la piastra a 22 gradi Celsius per due giorni, per garantire che le zone di crescita siano abbastanza grandi per la trasfezione. Aggiungere 10 millilitri di sospensione aerogena K a una piastra di Petri trattata con coltura di tessuto di 10 centimetri. Quindi, utilizzare un ciclo di inoculazione usa e getta da 10 microliter per raschiare le cellule dalle zone di crescita della piastra di coltura.
Trasferire le cellule in un tubo da 1,5 millilitri, contenente tampone H40 ghiacciato. Ruotare le celle per due secondi a 10000 volte la gravità. Quindi, scartare il supernatante e rimescolare le celle nel buffer H40.
Successivamente, aggiungere 100 microlitri delle cellule a un tubo contenente da uno a due microgrammi di DNA. Pipetta su e giù per mescolare e trasferire la miscela di DNA cellulare in una cuvetta di elettroporazione pre-refrigerata. Non aggiungere più di due microgrammi di DNA.
Una maggiore concentrazione di DNA è tossica per le cellule e riduce l'efficienza. Dopo l'elettroporazione, trasferire immediatamente le cellule in una piastra di Petri preparata di 10 centimetri e lasciare che le cellule si riprendano per cinque ore. Per selezionare un transettore per un knock-out, knock-in o un knock-in atto cinque, staccare le cellule dalla piastra di Petri pipettando il liquido sulla superficie.
Quindi, impostare tre diluizioni dell'agente selettivo in base al protocollo di testo. Infine, distribuire 150 microlitri delle diluizioni preparate in ogni pozzo di piastre di coltura tissutale a fondo piatto da 96 po '. In questo protocollo è stato dimostrato un sistema plasmide extracromosomico dual reporter.
32 ore dopo la trasfezione, la maggior parte delle cellule ha espresso entrambe proteine di fusione etichettate fluorescenti. Un atto cinque M cherry knock-in e un NC4 è stato anche tentato. Due bande sono state ottenute dopo aver eseguono il digest su un gel di agarosio.
La banda della coppia di basi 4127 contiene il costrutto desiderato. Il DNA purificato è stato utilizzato per la trasfezione delle cellule NC4. Due cloni della trasfezione NC4 sono stati analizzati tramite PCR ed entrambi hanno mostrato i modelli di banda previsti.
Southern blot è stato quindi utilizzato per convalidare i risultati della PCR. L'NC4 è cresciuto più velocemente sui prati batterici rispetto alle cellule Ax2. Dopo quattro ore, più cellule NC4 furono in grado di strisciare sotto l'agarosio rispetto alle cellule Ax2.
Le cellule NC4 erano più veloci e mostravano una risposta chemiotattica più forte al folato rispetto alle cellule Ax2. Utilizzare sempre le celle delle piastre SM appena impostate. Non utilizzare mai celle di età superiore ai quattro giorni, altrimenti l'efficienza scenderà.
I ceppi di HAP bianchi appena isolati, non estenici sono comunemente usati per affrontare domande riguardanti un comportamento ruching o sociale dei dictyosteliums. Il nostro permette di applicare la genetica molecolare attraverso quegli isolati.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la trasfezione di cellule di Dictyostelium discoideum, che consente la manipolazione genetica indipendentemente dalle condizioni di crescita del ceppo. Il metodo è efficiente e semplice, permettendo una rapida validazione dei risultati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Manipolazione genetica
- Organismi modello
Sfondo
- Dictyostelium discoideum è un organismo modello ampiamente utilizzato per lo studio dei processi cellulari.
- La manipolazione genetica è fondamentale per esplorare diverse domande biologiche.
- I metodi esistenti presentano limitazioni legate alle condizioni di crescita di ceppi diversi.
- Questo protocollo mira a superare tali limitazioni.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la trasfezione di diverse ceppi di Dictyostelium discoideum.
- Facilitare l'applicazione della genetica molecolare in ceppi che non crescono in modo asenico.
- Dimostrare l'efficienza del processo di trasfezione.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni batteriche e tampone per la trasfezione.
- Electroporazione di cellule di Dictyostelium discoideum con DNA plasmidico.
- Convalida dei risultati della trasfezione mediante microscopia e PCR.
- Valutazione del comportamento cellulare e della crescita in risposta alla trasfezione.
Risultati principali
- Trasfezione riuscita di ceppi multipli di Dictyostelium discoideum.
- Espressione di proteine fluorescenti osservata 32 ore dopo la trasfezione.
- Le cellule NC4 hanno mostrato una crescita più rapida e una risposta chemiotattica migliore rispetto alle cellule Ax2.
- Convalida delle modifiche genetiche mediante analisi PCR e Southern blot.
Conclusioni
- Il protocollo consente una manipolazione genetica efficace di ceppi di Dictyostelium discoideum.
- Fornisce un quadro per futuri studi sul comportamento cellulare e sulla genetica.
- I ceppi appena isolati danno i migliori risultati in termini di efficienza di trasfezione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la manipolazione genetica di ceppi selvatici di Dictyostelium capaci di crescere su batteri, superando le limitazioni dei ceppi adattati all'assenza di cellule con segnalazione Ras alterata. Fornisce un metodo scalabile e rapido per la validazione di bersagli in un sistema modello rilevante per le malattie, sostenendo la riduzione del rischio meccanicistica nelle fasi iniziali della scoperta. L'approccio estende la genetica molecolare ai ceppi isolati dall'ambiente, migliorando la continuità traslazionale e la fiducia predittiva nei flussi di lavoro di screening fenotipico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche in percorsi di segnalazione e motilità non alterati, utilizzando ceppi non assestici con segnalazione Ras integra.
- Valore operativo: Riduce i fattori di confusione sperimentale derivanti dai difetti di macropinocitosi e dai deficit di migrazione osservati nei ceppi assestici.
- Valore predittivo: Consente la validazione funzionale di target e la riduzione del rischio biologico, permettendo la mutagenesi in condizioni di crescita fisiologicamente rilevanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule ricombinanti che esprimono reporter fluorescenti doppi entro 32 ore, consentendo letture rapide di saggi per lo screening di composti.
- Valore operativo: Standardizza il flusso di lavoro di trasfezione utilizzando prati batterici ed elettroporazione, migliorando la riproducibilità tra laboratori.
- Scalabilità: Accelera il passaggio dalla trasfezione a cloni validati da settimane a giorni, favorendo l'ingegnerizzazione di ceppi ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita lo studio della chemiotassi e del comportamento sociale in ceppi selvatici appena isolati, migliorando la rilevanza del modello di malattia.
- Valore operativo: Consente l'applicazione diretta della genetica molecolare a isolati ambientali senza necessità di adattamento asentico preliminare.
- Continuità traslazionale: Collega la validazione dei bersagli nella fase di scoperta a fenotipi preclinici attraverso output misurabili come la chemiotassi indotta da folato e i saggi di penetrazione in agarosio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nelle fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione del capostipite, fornendo modelli geneticamente trattabili per l'interrogazione dei percorsi metabolici e lo screening fenotipico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi nei processi di chemiotassi, macropinocitosi e segnalazione dello sviluppo utilizzando ceppi selvatici integri.
- Screening: Fornisce letture quantitative di fluorescenza e accrescimento su prati batterici per una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Permette la validazione mediante PCR, blot di Southern e microscopia delle modifiche genetiche entro 32–48 ore dal transfezionamento.
- Ricerca traslazionale: Collega la manipolazione genetica a saggi funzionali come chemiotassi e crescita sotto agarosio, fornendo indicazioni per un avanzamento proporzionato al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'ingegnerizzazione di qualsiasi ceppo di Dictyostelium, indipendentemente dalla fonte di isolamento o dalle condizioni di crescita.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva eliminando gli artefatti derivanti dall'adattamento asseptico e ripristinando i percorsi di segnalazione nativi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso preparazioni standardizzate dei tamponi, parametri di elettroporazione e protocolli di selezione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo i tempi di ingegnerizzazione dei ceppi e consentendo decisioni rapide di tipo go/no-go nella validazione degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio generando modelli meccanicamente depurati da rischi con modifiche genetiche validate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microbiologia per la preparazione delle colture batteriche e la manipolazione di Dictyostelium su prati batterici.
- Richiede l'accesso a un elettroporatore e a infrastrutture sterili per colture cellulari per le fasi di trasfezione e recupero.
- Necessita della standardizzazione della densità dell'inoculo batterico (OD ~100) e della preparazione del buffer H40 tra diversi utilizzatori.
- Richiede considerazioni di adattamento quando si applica il protocollo a diversi isolati selvatici o ceppi ambientali.
- Limitato ai ceppi capaci di crescere su prati batterici; l'efficienza diminuisce con cellule più vecchie di quattro giorni dall'isolamento.
