Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

Le attuali strategie per uno screening dei farmaci per le urine sono costose da eseguire per l'analisi di routine di pannelli sempre più grandi di farmaci di abuso come richiesto per i test sul posto di lavoro, nonché per le applicazioni di monitoraggio terapeutico dei farmaci. Inoltre, i metodi basati su test ammino sono inclini alla distorsione e sono in ultima analisi limitati all'analisi target di pannelli di farmaci noti. Il vantaggio principale del nostro metodo, che viene indicato come MSI-CE-MS, è che consente lo screening rapido di un pannello di farmaci illimitato e dei loro metaboliti con alta precisione e lavoro minimo del campione.

Vi è l'urgente necessità di un metodo di screening ad alta produttività e conveniente per migliorare i risultati dei pazienti confermando l'aderenza e ottimizzando i regimi di dosaggio dei farmaci, rivelando al contempo l'uso illecito di droghe. Questa piattaforma di separazione multiplexata può essere applicata a una varietà di altre aree di ricerca relative alla profilazione di metaboliti mirati o non mirati in campioni biologici complessi. Inizia scongelando campioni di urina mattutini non identificati raccolti da pazienti con una storia nota di farmaci soggetti a prescrizione medica per una conservazione di meno 80 gradi Celsius sul ghiaccio e vortexando i campioni scongelati per 30 secondi.

Successivamente, sedimentare i campioni mediante centrifugazione e combinare tre aliquote da 10 microlitri di ciascun campione con 10 microlitri di norme interne deuterate, cinque microlitri di una soluzione di 4-fluoro-L-fenilalanina e 3-cloro-L-tirosina e 25 microlitri di acqua deionizzata. Quindi centrifugare le miscele per un minuto e trasferire 20 microlitri di ciascun campione in singoli flaconcini di polipropilene. Per impostare i parametri di condizionamento capillare della silice fusa non patinato, tagliare un diametro interno di 135 centimetri, 50 micrometri di diametro interno e un capillare di diametro esterno di 360 micrometri da una bobina.

Utilizzare un produttore di finestre capillari per rimuovere circa 7 millimetri di rivestimento in poliammide da entrambe le estremità di ogni capillare. Successivamente, installare le insenature capillari nell'elettroforesi capillare, o cartuccia CE, facendo scorrere ogni capillare per due giri a 360 gradi, facendo attenzione a sporgere circa due millimetri delle prese capillari dall'ago dello spruzzatore CE. Una volta installati tutti i capillari, caricare con cura la cartuccia CE nel sistema CE e conservare lo spruzzatore CE dalla fonte di ioni.

Posizionare la cromatografia liquida, o spruzzatore LC, nella sorgente ionica e selezionare lo scarico nel software del sistema per impostare il condizionamento capillare. Impostare la durata del metanolo, un idrossido di sodio molare, acqua deionizzata ed elettrolita di fondo a filo a 30 minuti per scarico e posizionare la pompa isocratica in standby durante il periodo di condizionamento capillare. Dopo l'ultimo lavaggio, pulire lo spettrometro di massa dell'elettroforesi capillare, o spruzzatore CE-MS, e l'elettrodo CE con salviette imbevute di metanolo.

Pulire l'interfaccia CE-MS con una soluzione di acqua isopropanolo uno a uno per rimuovere eventuali depositi residui di sale. Sostituire lo spruzzatore LC con lo spruzzatore CE-MS pulito e un capillare appena condizionato nell'interfaccia liquida della pulitura coassiale. Quindi accendere la pompa isocratica e applicare una tensione di 30 kilovolt per 15 minuti per garantire che un profilo di corrente CE stabile sia raggiunto prima dell'analisi delle urine.

Nel software di sistema, selezionare la precondizione, impostare lo scarico su 600 secondi e specificare una posizione del file elettrolita in background. Impostare l'iniezione per iniettare idrodinamicamente i campioni a 100 millibar per cinque secondi e per iniettare elettrocineticamente i distanziati elettrolitici di fondo a 30 kilovolt per 75 secondi. Impostare la tensione applicata su 30 kilovolt, la temperatura della cartuccia a 25 gradi Celsius e il tempo di esecuzione totale su 40 minuti.

Quindi, utilizzando l'orario, applicare un gradiente di pressione di due millibar al minuto da zero a 40 minuti durante la separazione. Al termine dell'acquisizione del campione, sciacquare il capillare a 50 millibar di pressione con gli elettroliti di fondo durante la notte mentre il capillare si trova nello spruzzatore CE nella sorgente ionico. Impostare il rilevamento degli ioni positivi TOF-MS in modo che si estende su un rapporto massa-carica da 50 a 1.700, con una velocità di acquisizione dati di 500 millisecondi per spettro, e verificare che sia il profilo che i dati baricentri siano memorizzati in formato file D.

Impostare le condizioni di ionizzazione elettrospray su capillare e su tensioni di ugello di 2000 volt ciascuna, il gas nebulizzatore a 10 libbre per pollice quadrato e l'erogazione del gas di essiccazione a otto litri al minuto a 300 gradi Celsius con un flusso di gas di focaia di 3,5 litri al minuto a 195 gradi Celsius durante l'acquisizione. Quindi impostare le impostazioni di tensione MS di fragmenter, skimmer e octapole una radiofrequenza rispettivamente a 120, 65 e 750 volt e impostare i parametri di controllo dello strumento e acquisizione dei dati in base alla progettazione dell'esperimento. Per l'analisi dei dati, aprire i dati CE-MS multi-segmento nel software di sistema.

In cromatogrammi impostare i dati di estrazione e i formati cromatogramma e dati spettrali di massa sulla modalità profilo. In smussatura, selezionate savitzky-golay cubica quadratica e impostate la larghezza della funzione su 15 punti. Quindi fare clic su Integra MS e impostare l'integratore su agile.

In Filtri di picco impostare il numero massimo di picchi su 11. In visualizzazione, fare clic sull'elenco dei picchi di integrazione e selezionare il numero di picco, il tempo di conservazione, l'area di picco, l'altezza di picco e il rapporto segnale/rumore. Salvare quindi i parametri con un nome di metodo univoco e applicare il metodo al processo per l'interpretazione di ogni set di dati.

In questa analisi rappresentativa di vari farmaci isobarici isomerici di abuso e dei loro metaboliti, sono stati rilevati 30 picchi risolti da 10 campioni indipendenti di una miscela di farmaci senza riporto del campione. Altri due oppioidi isobarici potrebbero essere completamente risolti come 20 picchi distinti con l'acquisizione completa dei dati di scansione. Allo stesso modo, due isomeri posizionali delle anfetamine sono stati completamente risolti in questa analisi CE-MS multi-segmento, per distinguere l'abuso illecito di metanfetamina dal potenziale uso improprio della fentermina, uno stimolante prescritto che viene utilizzato come soppressore dell'appetito per la perdita di peso.

In questa analisi rappresentativa dello screening farmacologico, un risultato positivo del test di screening per il metadone è stato dedotto dal rilevamento di un grande picco di segnale che co-migra con il picco metadone-d3 con un basso errore di massa. Nessun altro segnale è stato rilevato in altri campioni di urina all'interno della stessa corsa e la concentrazione di metadone rilevata ha superato 13 volte il limite di taglio raccomandato rispetto al rapporto di risposta ionica misurata nel campione e corretto da un fattore di diluizione delle urine di quattro volte, confermando l'aderenza dei pazienti alla terapia di mantenimento del metadone. Qui, una configurazione di iniezione seriale in CE-MS multi-segmento, composta da cinque diversi calibranti di farmaci, è stata analizzata in duplicato all'interno di una singola corsa insieme al vuoto di urina sintetico.

I metaboliti del farmaco sono stati rilevati come i loro ioni molecolari potenati al di sopra dei loro limiti di taglio dello screening. Seguendo questa procedura, un gran numero di metaboliti polari e ionici nelle urine possono anche essere analizzati da MSI CMS a supporto della ricerca metabolica basata sulla scoperta. Inoltre, è possibile ottenere una sorveglianza completa di una vasta gamma di farmaci esogeni e dei loro metaboliti, compresi i farmaci non prescritti e le droghe illecite soggette ad abuso.

Questo metodo ottimizzato può anche essere utilizzato per schermare regolarmente altre droghe di abuso. Questi potrebbero essere metaboliti di cannabis o alcol e il nostro metodo può anche distinguere tra una matrice di urina sintetica o falsa e anche un campione di urina naturale, reale e autenticamente donato. Ricordarsi di usare sempre cautela quando si lavora con fluidi biologici.