Assemblaggio e caratterizzazione biomolecolare Memristors costituito da membrane lipidiche drogato con scanalatura dello ione
9 marzo 2019
Morbido, bassa potenza, biomolecolari memristors sfruttare simile composizione, struttura e meccanismi di bio-sinapsi di commutazione. Presentato qui è un protocollo da assemblare e caratterizzazione biomolecolare memristors ottenuto da isolante lipidici formate tra le goccioline di acqua in olio. L'incorporazione di tensione-attivato alameticina risultati di peptidi in memristive conduttanza ionica attraverso la membrana.
Il nostro protocollo descrive come assemblare e caratterizzare elettricamente una biomembrana drogata da peptidi che imita da vicino la composizione, la struttura e le proprietà di trasporto delle sinapsi biologiche e che mostra una resistenza alla memoria tonnibile. Questa tecnica consente agli utenti di valutare la dipendente dall'attività, la resistenza alla memoria e la plasticità a breve termine nei sistemi ingegnerizzati su scale di tempo e livelli di eccitazione rilevanti per sinapsi biologiche e canali ionici. Questa tecnica fornisce una struttura per caratterizzare le membrane biomimetiche contenenti canali ionici attivati dalla tensione, rendendola applicabile alla caratterizzazione di una varietà di processi di trasporto cellulare, compresi quelli nei neuroni.
Il nostro suggerimento ai nuovi ricercatori è di diventare prima abili nel preparare soluzioni liposomiche e assemblare un bistrato di interfaccia a goccia su elettrodi di tipo filo. Vedere in prima persona il processo di erogazione e posizionamento delle goccioline sugli elettrodi semplifica questa tecnica per la formazione di due strato, rendendola immediatamente accessibile a tutti. A dimostrare questa procedura sarà il dottor Joseph Najem, un postdoc del mio laboratorio.
Per iniziare, preparare la soluzione di calcio di alametina nel tubo di microcentrifugo sciogliendo la polvere di peptidi di alametina in etanolo a una concentrazione finale di 2,5 milligrammi per millilitro. Vortice brevemente il tubo per mescolare bene e conservare la soluzione stock in un congelatore meno 20 gradi Celsius. In un tubo Safe-Lock da 1,5 millilitri, aggiungere un microlitro di soluzione di alametina a 99 microlitri della soluzione A per ottenere una concentrazione finale di alametica di 13 micromolari nella sospensione liposoma.
Vortice da mescolare bene. La soluzione liposoma peptidica risultante è la soluzione B.Mescolare 117 microlitri della soluzione A con 10 microlitri della soluzione B per ottenere una concentrazione finale di alametina di un micromolare, quindi vortice per mescolare bene. Fare riferimento alla soluzione risultante come C.Store le soluzioni B e C a quattro gradi Celsius.
Posizionare un lato di vetro spesso un millimetro 25 volte 75 millimetri sul palco di un microscopio invertito. Distribuire alcune gocce di olio di esadecano al centro dello scivolo di vetro, quindi posizionare il serbatoio dell'olio direttamente sull'olio sullo scivolo di vetro. Riempire completamente il serbatoio dell'olio con olio di esadecano.
Assicurarsi che il serbatoio sia posizionato sopra l'obiettivo. Quindi collegare il supporto dell'elettrodo allo stadio di testa di un amplificatore di corrente montato su un micromanipolatore. Il micromanipolatore riduce al minimo la lunghezza dell'elettrodo e il rumore elettrico.
Quindi, montare il supporto in micropipetta di vetro con il secondo filo di cloruro argento-argento su un altro micromanipolatore. Utilizzando i micromanipolatori, posizionare gli elettrodi in modo che le punte rivestite di agarosio dei fili di cloruro argento-argento siano completamente sommerse nel serbatoio dell'olio su un piano verticale simile. Allineare i due elettrodi e separarli di alcuni millimetri.
Per formare il bistrato lipidico, spostare gli elettrodi verticalmente nella fase dell'olio. Utilizzare la micropipetta per depositare 200 nanolitri di soluzione lipidica A su ciascuno dei fili. Attendere da tre a cinque minuti per consentire l'assemblaggio spontaneo del monostrato lipidico all'interfaccia dell'olio d'acqua.
Le goccioline potrebbero abbassarsi se l'olio circostante è sufficientemente meno denso. Successivamente, abbassare gli elettrodi per ri-immergersi fino a quando le estremità di entrambi gli elettrodi toccano a malapena il fondo del serbatoio dell'olio. Quindi, per formare il bistrato, spostare gli elettrodi orizzontalmente per portare le goccioline in contatto.
Per ottenere la relazione pizzicata, isterica, di tensione di corrente, utilizzare un generatore di funzioni per applicare una forma d'onda di tensione triangolare o sinusoidale a una membrana lipidica priva di alamethicina assemblata con goccioline della soluzione A.Registrare la risposta di corrente indotta attraverso più frequenze. Per registrare la dimensione del bistrato lipidico interfacciale, misurare il diametro della membrana lipidica su computer o registrare l'ampiezza di corrente dal picco al picco risultante dall'onda triangolare da 10 hertz, 10 millivolt per calcolare l'area della membrana. Togliere i fili dalla fase dell'olio per rimuovere le goccioline che non contengono alametina.
Aggiungere nuove goccioline acquose utilizzando la soluzione C e formare un bistrato lipidico. In base all'ampiezza della corrente d'onda quadrata, utilizzare i micromanipolatori per regolare il contatto tra goccioline, in modo che il bistrato abbia un'area simile a quella formata in precedenza. Quindi applicare una forma d'onda di tensione da 10 e 10 millivolt e registrare la risposta di corrente indotta come in precedenza.
Per condurre esperimenti di impulsi utilizzando un software di programmazione personalizzato e una sorgente di tensione analogica, generare impulsi di tensione con ampiezze specifiche alte e basse in tempo e fuori tempo. Registrare la corrente in risposta agli impulsi applicati. La trama tra corrente e tensione mostra la risposta di corrente diversa da zero all'applicazione di una distorsione di tensione a un bistrato lipidico privo di alametina.
Aggiungere 0,017 hertz, una frequenza in cui l'impedenza è dominata dalla resistenza della membrana. Una risposta a bassa corrente ohmica è mostrata per la membrana altamente isolante. La trama di un bistrato lipidico formato tra due goccioline contenenti peptidi di alametina mostra correnti esponenzialmente crescenti a tensioni superiori alla soglia di inserimento di 100 millivolt.
Ad alta tensione, i peptidi di alametina che risiedono sulla superficie del bistrato lipidico si inseriscono nella membrana e si aggregano per formare pori conduttivi. Le risposte di corrente simmetrica ad entrambe le polarità sono dovute all'inserimento e all'aggregazione di popolazioni separate di peptidi dai lati opposti della membrana. La corrente capacitiva deve essere sottratta dalla corrente totale per ottenere solo la risposta memristive, pizzicata di corrente-tensione dell'isteresi.
La risposta del memristor biomolecolare ai successivi impulsi di tensione con un aumento della conduttività durante il tempo di inneggio, nonostante il ripristino intermittente di uno stato isolante durante ogni tempo libero. Sia lo stimolo attuale che gli stimoli precedenti contribuiscono all'attuale aumento. I monostrati coesi su entrambe le goccioline devono formarsi prima di riunirli per formare il bistrato.
Se le goccioline vengono riunite troppo presto, si uniscono e non si forma alcun bistrato. Stiamo ora progettando e fabbricando reti neurali di base microfluidiche costituite da neuroni a stato solido collegati da sinapsi basate su membrana supportate dall'ottimizzazione dell'assimilazione della rete di supercomputer ad alte prestazioni presso ORNL. Questi memristors sono i primi ad avere la composizione, la struttura, il meccanismo di commutazione e il trasporto ionica di sinapsi biologiche.
Forniscono così una base biomolecolare arredata aggiungendo calcolo e memoria simili a cervelli.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'assemblaggio e la caratterizzazione elettrica di biomembrane drogate con peptidi che imitano le sinapsi biologiche. La tecnica consente la valutazione della resistenza di memoria e della plasticità a breve termine, aspetti rilevanti nei sistemi biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Biomateriali
Sfondo
- I memristori biomolecolari sono ispirati alle sinapsi biologiche.
- Strati lipidici isolanti si formano tra gocce d'acqua nell'olio.
- Peptidi di alametina attivati dal voltaggio potenziano la conducibilità ionica.
- La comprensione di questi sistemi aiuta ad esplorare i processi di trasporto cellulare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la creazione di membrane biomimetiche.
- Caratterizzare la resistenza di memoria in sistemi ingegnerizzati.
- Fornire un quadro per lo studio del comportamento dei canali ionici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni di liposomi.
- Assemblaggio di bicamere a interfaccia goccia su elettrodi.
- Caratterizzazione elettrica delle biomembrane.
- Valutazione della resistenza memoriale dipendente dall'attività.
Risultati principali
- Dimostrata resistenza di memoria regolabile nelle biomembrane.
- Evidenziato il potenziale per lo studio della plasticità a breve termine.
- Forniti spunti sulle proprietà di trasporto di sistemi ingegnerizzati.
- Evidenziata l'accessibilità della tecnica per nuovi ricercatori.
Conclusioni
- Il protocollo consente lo studio efficace di membrane biomimetiche.
- Fornisce uno strumento prezioso per comprendere il comportamento sinaptico.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a diversi processi di trasporto cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I memristori biomolecolari offrono un approccio biomimetico per emulare le funzioni sinaptiche nel calcolo neuromorfico, affrontando limitazioni dei dispositivi a base di silicio come l'elevato consumo energetico e la scarsa interconnettività. Riproducendo la composizione, la struttura e il trasporto ionico delle sinapsi biologiche, questa tecnologia consente la modellizzazione predittiva dei processi neurali e supporta la riduzione del rischio nella validazione precoce dei bersagli per neurofarmaci. La piattaforma fornisce un sistema scalabile e riproducibile per valutare l'attività dei canali ionici e la resistenza di memoria, in linea con le esigenze delle fasi di scoperta per approfondimenti meccanicistici e continuità traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione dei canali ionici attivati dal voltaggio in un ambiente lipidico simile a quello nativo, supportando la validazione degli obiettivi attraverso la valutazione funzionale della formazione dei pori e della dinamica della conduttanza.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma riproducibile per la caratterizzazione dell'inserimento e dell'aggregazione del poro indotta da alametina, riducendo la variabilità negli studi meccanicistici iniziali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita lo sviluppo di saggi quantitativi per modulatori dei canali ionici mediante la misurazione dell'isteresi corrente-tensione di tipo memristivo e delle risposte di plasticità a breve termine.
- Valore operativo: Supporta la standardizzazione dei saggi attraverso la formazione controllata di bicapidi lipidici e l'incorporazione di peptidi, consentendo letture riproducibili tra diverse prove sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un sistema rilevante per lo studio dei meccanismi di disfunzione sinaptica, in particolare nei disturbi neurodegenerativi in cui è implicata una disregolazione dei canali ionici.
- Valore operativo: Collega le fasi di scoperta e preclinica fornendo un metodo standardizzato per valutare gli effetti di composti sul trasporto ionico mediato da membrane prima dei test in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo la verifica di ipotesi su bersagli canali ionici, supporta lo sviluppo di saggi per lo screening dell'attività dei canali ionici e fornisce letture elettrofisiologiche quantitative che guidano l'identificazione dei composti promettenti e la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione funzionale dei canali ionici attivati dal voltaggio catturando variazioni della conduttanza dipendenti dall'attività e la resistenza di memoria in un sistema di membrana biomimetico.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso la formazione riproducibile di bicouche e il doping con peptidi, consentendo una valutazione costante degli effetti dei composti sul flusso ionico.
- Analisi: Genera curve di isteresi strette e metriche di plasticità da voltammetria ciclica e treni di impulsi, offrendo parametri quantitativi per confrontare condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dalla scoperta dei canali ionici alla valutazione preclinica modellando un comportamento simile a quello sinaptico in un sistema riduzionista.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la caratterizzazione di canali ionici su diversi bersagli, riducendo lo sviluppo ridondante di saggi e aumentando la produttività nei percorsi di validazione dei bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile sul meccanismo dei canali ionici dimostrando la formazione del poro dipendente dalla tensione e la modulazione della conduttanza analoga a quella delle sinapsi biologiche.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso la preparazione standardizzata della soluzione lipidica, l'assemblaggio controllato delle interfacce tra gocce e concentrazioni definite di peptidi.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nella selezione degli obiettivi fornendo dati funzionali precoci sul comportamento dei canali ionici, orientando le decisioni di avanzamento o interruzione nell'ottimizzazione dei composti promettenti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei target sui canali ionici in base al rischio, sulla base di dinamiche di conduttanza e profili di plasticità validati in un sistema rilevante dal punto di vista sinaptico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei lipidi, nell'elettrofisiologia e nella manipolazione di goccioline microfluidiche per una formazione affidabile del doppio strato.
- Richiede l'accesso a sistemi di patch-clamp o di amplificazione della corrente, generatori di funzioni e generatori di impulsi di tensione per la caratterizzazione elettrica.
- Necessita della standardizzazione della composizione lipidica, della concentrazione del peptide e delle dimensioni delle goccioline tra diversi gruppi di lavoro per garantire la comparabilità dei dati.
- Richiede considerazioni di adattamento quando si estende ad altri canali ionici oltre l'alametina, inclusa la solubilità del peptide e la cinetica di inserimento.
- È limitato dalla necessità di una accurata pulizia degli elettrodi e di una corretta manutenzione della fase oleosa per prevenire contaminazioni e garantire la stabilità del doppio strato.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Reconstitution of Alamethicin Peptides
2:20
Setting Up the Experiment
3:30
Formation of the Lipid Bilayer
4:15
Electrical Characterization of the Biomolecular Memristor
5:54
Results: Current-voltage Relationship, Pinched Hysteresis, and Response to Voltage Pulses
7:25
Conclusion
