Name: Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Scopri un metodo di immobilizzazione per Caenorhabditis elegans vivo utilizzando un chip microfluidico ultra-sottile in polidimetilsilossano con ritenzione idrica. Questa tecnica consente irradiazione mirata e osservazione a lungo termine.

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Gli autori ringraziano il Dr. Atsushi Higashitani per gentile Consiglio per quanto riguarda il trattamento di c. elegans e d. ssa Yuya Hattori, Yuichiro Yokota e Yasuhiko Kobayashi per discussioni importanti. Gli autori ringraziano il centro genetico di Caenorhabditis per la fornitura di ceppi di c. elegans ed Escherichia coli. Ringraziamo l'equipaggio del ciclotrone del diadema a QST-Takasaki per la loro assistenza gentile con gli esperimenti di irradiazione. Ringraziamo il Dr. Susan Furness per la modifica di un progetto di questo manoscritto. Questo studio è stato sostenuto in parte da KAKENHI (Grant numeri JP15K11921 e JP18K18839) da JSP a M.S.

<ol><li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Plasma+Science%22%5BJournal%5D)">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li>
<li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality%2C+molecular+nature+of+mutation%2C+mutation+rate%2C+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+evolution%3A+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li>
<li>Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+irradiation+system+with+heavy-ion+microbeam+for+active+individuals+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).</li>
<li>Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-ion+microbeam+system+at+JAEA-Takasaki+for+microbeam+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology.</a> Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).</li>
<li>Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans+germline+cells+following+heavy-ion+microbeam+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).</li>
<li>Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+irradiation+method+for+the+first+instar+silkworm+larvae+using+locally+targeted+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam.</a> Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).</li>
<li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li>
<li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1 (1), 12-14 (2012).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+calcium+leakage+causes+mitochondrial+damage+in+Caenorhabditis+elegans+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles.</a> Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).</li>
<li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. 2, 1-13 (2006).</li>
<li>Aubry, G., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+optical+developments+in+microfluidic+platforms+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research.</a> Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).</li>
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<li>Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-moulded+substrates+for+the+analysis+of+structure-dependent+behaviour+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes.</a> Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li>
<li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+dirt%3A+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Immobilizzazione su chip di c. elegans in condizioni dal vivo utilizzando un bagnabile PDMS microfluidic chip consente l'irradiazione efficiente microbeam mirata di più animali. La facilità di movimentazione e caratteristiche per evitare l'essiccazione rendono questo sistema adatto per applicazioni non solo in microbeam irradiazione, ma anche in diversi saggi comportamentali. Questi fogli di vite senza fine sono già stati commercializzati e possono essere facilmente ottenuti. Chip microfluidici convenzionali, qu...

Radiazioni, tra cui i raggi x, raggi gamma e fascio di ioni pesanti, sono ampiamente usato per applicazioni biologiche come nella diagnosi del cancro e nel trattamento e per l'allevamento del fascio di ioni. Numerosi studi e sviluppi tecnici si stanno attualmente concentrando sugli effetti della radiazione1,2,3. Microbeam irradiazione è un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti nel vivere organismi4. Il Takasaki Advanced radiazione ricerca Istituto di istituti nazionali per Quantum e radiologici Science and Technology (QST-Takasaki) ha sviluppato una tecnologia per irradiare le cellule individuali sotto osservazione microscopica utilizzando ioni pesanti microfasci5e ha stabilito i metodi per consentire l'irradiazione di microbeam mirato di diversi modelli animali, quali il nematode Caenorhabditis elegans4,6, bachi da seta7e Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Microbeam mirati irradiazione della del nematode c. elegans permette l'efficace atterramento di specifiche regioni, come l'anello del nervo nella regione cefalica, contribuendo così a identificare i ruoli di questi sistemi in processi quali la locomozione.
Un metodo per l'immobilizzazione su chip di c. elegans individui senza la necessità di anestesia è stato sviluppato per consentire microbeam irradiazione4. Inoltre, per migliorare il chip microfluidici utilizzato nel precedente studio4, abbiamo recentemente sviluppato chip microfluidici bagnabile, ione-penetrabile, polidimetilsilossano (PDMS), indicato come fogli di vite senza fine (Vedi Tabella materiali), per immobilizzazione di c. elegans individui9. Questi comprendono lenzuola morbide ultra-sottile (spessore = 300 µm; larghezza = 15 mm; lunghezza = 15 mm) con più canali microfluidici dritto (20 o 25) (profondità = 70 µm; larghezza = 60 µm o 50 µm; lunghezza = 8 mm) sulla superficie (Figura 1A-D). I canali microfluidici sono aperti e permettere agli animali di più di essere racchiuso tra loro simultaneamente (Figura 1E). I fogli sono resistenti per permettere i canali microfluidici essere ampliato (da ~ 10%, Figura 1,F), e l'elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali.
I canali non fanno male i vermi quando sono essere racchiusi o quando sono stati raccolti. Inoltre, i fogli sono realizzati da PDMS, che è essenzialmente idrofobico, ma ritenzione idrica può essere raggiunto da impartire idrofilia del materiale. La ritenzione idrica e lo spessore sono caratteristiche favorevoli dei fogli vite senza fine. La capacità di ritenzione idrica previene la disidratazione degli animali dopo immobilizzazione prolungata e consente osservazioni a lungo termine da effettuarsi.
Inoltre, come descritto in precedenza9, i fogli sono solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti come gli ioni di carbonio (con un intervallo di circa 1 mm di acqua) di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali. In questo modo le particelle di ioni per essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Inoltre, i fogli della vite senza fine possono essere riutilizzati e sono così economici. Con il metodo di iniezione convenzionali, gli animali racchiusi a volte sono morti e non possono essere prese fuori del canale; le uova possono anche ostruire i canali. Questo rende inutilizzabile il chip. Chip sono, pertanto, fondamentalmente USA e getta e il rapporto costi-benefici rapporto è scarsa.
Nella carta attuale, descriviamo dettagliatamente una serie di metodi per l'immobilizzazione su chip di streaming in c. elegans individui che utilizzano fogli di vite senza fine. Mediante saggi di locomozione degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip, abbiamo valutato il film di copertura adeguata. Inoltre, abbiamo mostrato gli esempi di immobilizzazione su chip per imaging osservazioni sia microbeam irradiazione.

<table><tbody><tr><td>C. elegans ceppo wild-type</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA</td><td>N2</td><td>Wild-type C. elegans ceppo generalmente utilizzato in questo studio</td></tr><tr><td>C. elegans unc-119(e2498) III mutante ceppo</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA</td><td>CB4845</td><td>C. elegans ceppo impiegato solo come esempio di mutanti con forma corporea anormale...</td></tr><tr><td>C. elegans ceppo transgenico HBR4</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>HBR4</td><td>Il genotipo di questo ceppo transgenico C. elegans è HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54&ndash; 3' utr, unc-119(+)]V. Questo ceppo è stato impiegato solo per l'osservazione delle immagini.</td></tr><tr><td>E. coli ceppo</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA</td><td>OP50</td><td>E. coli ceppo utilizzato come cibo per C. elegans</td></tr><tr><td>Worm Sheet IR (50/60)</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone</td><td>BCM17-0001</td><td>Chip microfluidico con 25 diritti 50/60-&micro; m canali di larghezza utilizzati in tutti gli esperimenti e le osservazioni in questo articolo&nbsp;</td></tr><tr><td>Foglio di vite senza fine 60</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone</td><td>BCM18-0001</td><td>Chip microfluidico con 20 60 diritti & micro; canali di larghezza m. Questo è adatto per gli adulti 3-5 giorni dopo la schiusa a 20 ° C.</td></tr><tr><td>Foglio di vite senza fine 50</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone</td><td>BCM18-0002</td><td>Chip microfluidico con 20 50 diritti & micro; canali di larghezza m. Questo è adatto per i giovani adulti ~ 3 giorni dopo la schiusa a 20 ° C.</td></tr><tr><td>MICRO VETRO DI COPERTURA</td><td>MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td><td>C030401</td><td>Vetro di copertura (spessore: 130-170 &; micro; m) utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3</td></tr><tr><td>Film di polistirene</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone</td><td>BCM18-0001/ BCM18-0002</td><td>Articoli in bundle di fogli di vite senza fine. PS filim (spessore: ~130 &micro; m) utilizzato nei saggi di locomozione del Protocollo 3.</td></tr><tr><td>Pellicola di poliestere Lumirror</td><td>TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Giappone</td><td>Lumirror T60 (t 125 &micro; m)</td><td>Filo PET (spessore: 125 &; micro; m) utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3</td></tr><tr><td>IWAKI 60 mm/piatto non trattato</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Giappone).</td><td>1010-060</td><td>Piatto non trattato utilizzato nell'incuvazione di C. elegans nel Protocollo 1</td></tr><tr><td>IWAKI 35 mm/piatto non trattato</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Giappone).</td><td>1010-035</td><td>Piatto non trattato utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck, Francia</td><td></td><td>Acqua ultrapura</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Giappone</td><td>62020</td><td>120 mm x 215 mm; 200 fogli/scatola</td></tr><tr><td>WormStuff Worm Pick</td><td>Genesee Scientific Corporation, CA, USA)</td><td>59-AWP</td><td>Raccoglitore di platina specializzato per il prelievo di C. elegans</td></tr><tr><td>Sistema di stereomicroscopio di ricerca</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone</td><td>SZX16</td><td>Micriscopio utilizzato in tutti gli esperimenti e le osservazioni in questo documento</td></tr><tr><td>Supporto di messa a fuoco motorizzato per SZX16</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone</td><td>SZX2-ILLB</td><td>Questo è stato utilizzato per l'osservazione in campo chiaro nel protocollo 3-8.</td></tr><tr><td>Obiettivo (&volte; 1)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone</td><td>SDFPLAPO1&times; PF</td><td>NA: 0,15; L.D.: 60 mm. Questo prestito è stato utilizzato per l'osservazione in campo chiaro nel Protocollo 3-8.</td></tr><tr><td>Obiettivo (&volte; 2)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone</td><td>SDFPLAPO2XPFC</td><td>NA: 0,3; L.D.: 20 mm. Questo&nbsp; Lends è stato utilizzato per osservazioni di imaging.</td></tr><tr><td>Mercury Light Source</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone</td><td>U-LH100HG</td><td>L'ampio spettro di emissione consente di condurre una serie di esperimenti di imaging a fluorescenza utilizzando tutti i comuni fluorofori.</td></tr><tr><td>SZX16 Unità filtro fluorescente (alte prestazioni per YFP)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone</td><td>SZX2-FYFPHQ</td><td>Es: 490-500 nm; Em: 510-560. Questo è stato utilizzato per l'osservazione di immagini della deformazione HBR4.</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale ad alta velocità EXILIM</td><td>CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Giappone</td><td></td><td>EX-F1 Le Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C e Video 1 sono state ottenute utilizzando questa fotocamera digitale.</td></tr><tr><td>Office 2013</td><td>Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA</td><td></td><td>EXCEL Software utilizzato per analisi statistiche</td></tr></tbody></table>

immobilizzazione degli individui live caenorhabditis elegans utilizzando un chip microfluidico polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiazione è ampiamente usato per applicazioni biologiche e per l'allevamento del fascio di ioni, e tra questi metodi, microbeam irradiazione rappresenta un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti negli organismi viventi. Questo articolo descrive una serie di metodi di immobilizzazione su chip sviluppato per l'irradiazione di microbeam mirata degli individui dal vivo di Caenorhabditis elegans. In particolare, il trattamento dei chip microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) che abbiamo precedentemente sviluppato per immobilizzare gli individui di c. elegans senza la necessità per l'anestesia è spiegato in dettaglio. Questo chip, indicato come un foglio di vite senza fine, è resiliente per consentire i canali microfluidici essere ampliato e l'elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali. Inoltre, il foglio di vite senza fine Mostra la ritenzione idrica e permette agli individui di c. elegans di essere sottoposti ad osservazione microscopica per lunghi periodi in condizioni live. Inoltre, il foglio è solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti ad esempio ioni carbonio di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali, consentendo in tal modo le particelle di ioni essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Perché la selezione dei film di copertura utilizzato per racchiudere gli animali è molto importante per il successo a lungo termine immobilizzazione, abbiamo condotto la selezione dei film copertura adeguata e ha mostrato un consigliato uno tra alcuni film. Come un esempio di applicazione del chip, abbiamo introdotto imaging osservazione delle attività muscolare degli animali che racchiude il canale di microfluidica del foglio di vite senza fine, come pure l'irradiazione microbeam. Questi esempi indicano che i fogli di vite senza fine hanno notevolmente ampliato le possibilità per gli esperimenti biologici.

Attivo di c. elegans individui potrebbero essere immobilizzati con successo usando un ultra-sottile, bagnabile PDMS, chip microfluidico (foglio di vite senza fine). Abbiamo studiato l'idoneità delle pellicole di copertina diversa per sigillare il foglio di vite senza fine, come descritto nel protocollo sezione 3. Per valutare gli effetti di tenuta dei film copertura, abbiamo determinato la motilità degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip con copertura in vetro (spessore: ...

Una serie di metodi di immobilizzazione è stata stabilita per consentire l'irradiazione mirata di live Caenorhabditis elegans individui che utilizzano un microfluidici recentemente sviluppati polidimetilsilossano ultra-sottile chip con ritenzione idrica. Questa romanzo immobilizzazione su chip è anche sufficiente per osservazioni di imaging. Il trattamento dettagliata ed esempi di applicazione del chip sono spiegati.

Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Un vantaggio di questo protocollo è che il foglio del worm è facile da gestire. Il foglio ha caratteristiche che prevengono l'essiccazione, permettendoci di condurre l'irradiazione del microbeam agli animali viventi, eseguire diversi saggi comportamentali e osservazioni a lungo termine. I canali microfluidici in questo foglio di vermi sono aperti, rendendo più facile la raccolta degli animali.Questi fogli di vermi possono anche essere usati ripetutamente, rendendoli più economici. Quando stavamo sviluppando questa tecnica, volevamo irradiare solo una parte degli animali con un microbeam al microscopio. Quindi avevamo bisogno di chip chiari e molto sottili in grado di contenere gli animali.Per iniziare, posizionare un foglio sottile e trasparente sul palco per utilizzarlo come pellicola di copertina inferiore. Posizionare delicatamente un foglio di verme sulla pellicola di copertura inferiore con pinzette piatte. Posizionare almeno tre goccioline di soluzione tampone sulla superficie di una piastra di Petri non trattata di 6 centimetri.Quindi, scegli diversi C.elegans adulti con un raccoglitore platina da un piatto di cultura. Trasferire gli animali su una goccia con il raccoglitore platina e consentire agli animali di nuotare nel tampone per rimuovere eventuali batteri. Lavare gli animali in due goccioline separate e sciacquare gli animali in un'altra goccia.Quindi, posizionare una goccia di soluzione tampone sulla superficie del foglio del verme. Rimuovere gli animali lavati dalla goccia tampone e trasferirli in una goccia sul foglio del verme. Utilizzare una pinzetta piatta per posizionare una pellicola di copertura PS sopra il foglio del verme e premere delicatamente sui canali da un'estremità all'altra del foglio.O semplicemente far cadere gli animali in goccioline e sigillare delicatamente con la pellicola di copertura in modo che la goccia si diffonda tra la copertura e i fogli di verme con gli animali all'interno del canale. Confermare che gli animali sono vivi controllando il movimento con un microscopio a ingrandimento 1-2x. Registrare le posizioni degli animali e notare in particolare il numero del canale in cui ogni animale è racchiuso e la posizione di ciascun animale nel canale.Per raccogliere animali immobilizzanti, utilizzare una pinzetta piatta per rimuovere la pellicola di copertura dal foglio del verme, quindi far cadere 10-15 microlitri di soluzione tampone su uno dei canali microfluidici che racchiudono gli animali. Sotto lo stereomicroscopio, osserva gli animali mentre iniziano a girare. Quindi usa il raccoglitore platina per raccogliere gli animali da nuoto e trasferirli su un piatto di dosaggio.Dopo aver racchiudeto gli animali come precedentemente dimostrato, osservare macchie fluorescenti sugli animali con un microscopio a farinescenza. Quindi immagine della propagazione dell'onda ionica di calcio utilizzando l'acquisizione video per osservare le attività dinamiche. Posizionare il foglio di verme usato su una piastra di petri di sei centimetri e posizionare circa 100 microlitri di acqua ultra pura sterilizzata sul foglio.Utilizzare le dita guantate per stendere l'acqua sulla superficie del foglio e lavare via eventuali contaminanti. Quindi, utilizzare salviette monouso per rimuovere l'umidità dal foglio del verme. Erogare cinque millilitri di 70% di etanolo nella piastra di Petri e utilizzare le dita guantate per stendere l'etanolo sul foglio del verme.Infine, dopo che il foglio è asciutto, posizionare il foglio su una piastra di Petri sterile e coprire. Utilizzando questo protocollo, è stata studiata l'idoneità di diversi film di copertina. Non c'era alcuna differenza significativa nella motilità tra animali di controllo e animali racchiusi in canali microfluidici con pellicola PS.Al contrario, la motilità è stata significativamente ridotta negli animali racchiusi sotto un vetro di copertura. Anche la motilità degli animali racchiusi con un film per animali domestici è stata significativamente diminuita. È importante selezionare attentamente le pellicole di copertura per la sigillatura dei canali microfluidici.Utilizzando questo protocollo, abbiamo valutato l'idoneità di diversi film di copertina attraverso test di locomozione degli animali tre ore dopo l'immobilizzazione su chip. Utilizzando questa tecnica, intendevamo sviluppare un chip bagnabile ultrasottile solo per l'irradiazione dei microbi. Tuttavia, questi fogli worm sono già stati utilizzati per l'imaging e i saggi comportamentali oltre le loro applicazioni originali.

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Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica (Video) | JoVE Journal

Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

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