Name: Rilevamento di immunoglobulina Anti-acquaporina-4 G di siero umano dallanalisi Cell-based (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Scopri il rilevamento dell'immunoglobulina G anti-acquaporina-4 nel siero umano tramite analisi cell-based. Questo metodo offre maggiore sensibilità e specificità per diagnosticare i disturbi dello spettro della neuromielite ottica.

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Gli autori sono grati per il sostegno da sovvenzioni dalla National Science Foundation of China (No. 31600820), la salute e Commissione di pianificazione familiare della provincia dello Jilin (No. 2016Q036) e la scienza e tecnologia pianificazione progetto della provincia di Jilin (No. 20180520110JH).

Questa procedura è stata approvata dal comitato etico dell'Università ospedale prima di Jilin ed è stata effettuata su circa 1.500 soggetti.
1. paziente iscrizione e raccolta campioni ematici
<ol><li>Applicare il rilevamento in laboratorio del siero di che IgG anti-AQP4 ai pazienti della clinica con i reclami principali ed i sintomi elencati di seguito. Eseguire esami fisici pure. Neurite ottica: pazienti soffrono di deficit visivi, come la perdita del campo visivo e riduzione dell'acuità visiva. Mielite acuta: i pazienti possono presentare con paralisi, deficit sensoriali e disfunzione autonomica. Sindrome di area postrema: i pazienti possono avere sintomi di inspiegabile singhiozzo, nausea o vomito. Sindrome acuta del tronco cerebrale: lesioni del tronco cerebrale potrebbero causare diversi sintomi e segni fisici a seconda della posizione delle lesioni. Narcolessia sintomatica o acuta Sindrome diencefalica clinica con le lesioni diencephalic NMOSD-tipici di MRI. Sindrome cerebrale sintomatica con le lesioni di cervello NMOSD-tipiche. Nota: Secondo i criteri diagnostici di un consenso internazionale per NMOSD5, una diagnosi di NMOSD può essere fatta se il paziente è siero anti-AQP4 IgG-positivo e ha almeno una delle caratteristiche cliniche principali di cui sopra. Tuttavia, si sconsiglia di test di IgG anti-AQP4 in pazienti con la neurite ottica solo.</li>
	<li>
Raccolta campioni ematici Nota: pazienti non è necessario essere a digiuno.<ol>
<li>Disegnare 2-3 mL di sangue venoso in un tubo di raccolta sangue vuoto 4 mL.</li>
		<li>Consentire il siero coagulare per 30 min a temperatura ambiente (TA). Nota: Coagulazione prolungato può aumentare i livelli del siero a causa di perdite dalle piastrine.</li>
		<li>Centrifuga a 2100 x g per 5 min, trasferire con cautela il siero ad un nuovo tubo.</li>
		<li>Analizzare il siero immediatamente o aliquotare e conservare a -20 o -80 ° C. Nota: Conservazione a-20 ° C è per l'archiviazione dei mesi, mentre è di-80 ° C per lo stoccaggio di anni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anti-AQP4 rilevazione dell'anticorpo
Attenzione: Campioni e reagenti di kit usato dovrebbero essere considerati materiale infettivo. Sodio azide-contenente i reagenti sono tossici. Un diagramma di flusso del protocollo è fornito nella Figura 1.
<ol><li>
Preparazione
	<ol>
<li>Portare il kit a RT prima dell'uso. Nota: Conservare il kit a 2-8 ° C.</li>
		<li>Preparare almeno 200 mL di tampone di lavaggio PBS contenente 0,2% Tween 20. Versare 100 mL di tampone di lavaggio in un becher da mL 500.</li>
		<li>Diluire il siero campioni 10x con tampone di lavaggio. Preparare i controlli positivi e negativi secondo le istruzioni del distributore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubazione del campione
	<ol>
<li>Aggiungere 30 µ l di campioni pre-diluiti, controllo positivo o controllo negativo per i campi di reazione del vassoio reagente (Figura 2). Nota: Evitare le bolle d'aria.</li>
		<li>Rimuovere il coperchio di protezione sulle diapositive biochip. Nota: Non toccare il biochip per evitare il distacco e la contaminazione delle cellule fisse. Tenere la diapositiva side-by-side prima di rimuovere il coperchio.</li>
		<li>Applicare la diapositiva di biochip al vassoio del reagente (Figura 2). Avviare un'incubazione di 30 minuti a TA. Nota: Ogni campione deve essere una gocciolina individuo collegata al biochip corrispondente senza miscelazione con altre goccioline.</li>
		<li>Sciacquare delicatamente il vetrino di biochip una volta con tampone di lavaggio. Immergere il vetrino di biochip nel bicchiere graduato 500 mL riempita con 100 mL di tampone di lavaggio per almeno 5 min posto il becher su un agitatore se possibile.</li>
		<li>Prendere lo scivolo di biochip dal tampone di lavaggio. Accuratamente pulire il tampone di lavaggio residuo fuori i campi di reazione con un tovagliolo di carta. Esporre la diapositiva di biochip aria aperta per 1-2 min per far evaporare il tampone di lavaggio residua sul campo di reazione. Nota: Non asciugare i campi di reazione. Non toccare il biochip con tovagliolo di carta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubazione dell'anticorpo secondario
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di anticorpo secondario secondo le istruzioni del distributore.</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l di anticorpo secondario fluorescente ai campi della reazione di un vassoio di reagente pulito.</li>
		<li>Applicare la diapositiva di biochip per vassoio reagente caricato con anticorpo secondario. Incubare per 30 minuti a TA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaggio
	<ol>
<li>Versare il tampone di lavaggio usate e aggiungere 100 mL di tampone di lavaggio fresco nel bicchiere graduato. Ripetere il lavaggio come descritto ai punti 2.2.4 e 2.2.5.</li>
		<li>Aggiungere con cautela il mezzo di inclusione per i campi di reazione in una diapositiva di biochip (una goccia per ogni campo di reazione). Sigillare la diapositiva di biochip con un pezzo di vetro di copertura. Evitare le bolle d'aria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rilevazione della fluorescenza
	<ol>
<li>Accendere la lampada fluorescente di microscopio e pre-riscaldare per 15 min. Scegli filtro a 488 nm.</li>
		<li>Software di fotografia aperto. Scattare foto da trasfettate e untransfected di tutti i campi di reazione con ingrandimenti differenti. In primo luogo, prendere una foto con ingrandimento 4x per una panoramica, poi scattare altre foto con 10 x e 20 x ingrandimenti. Nota: Il protocollo dettagliato è mostrato nella tabella 1. Interpretazione dei risultati è discussa nella sezione risultati rappresentativi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. diagnosi dei pazienti
<ol><li>Se il paziente è siero anti-AQP4 IgG-positivo e mostra almeno una caratteristica clinica di nucleo di NMOSD (Vedi sezione discussione), diagnosticare il paziente con NMSOD5. Tuttavia, se il paziente è anti-AQP4 IgG negativo, una diagnosi di NMOSD non può essere esclusa.</li>
</ol>

<ol><li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22in+vitro.Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).</li>
<li>Sato, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+between+MOG+antibody-positive+and+AQP4+antibody-positive+NMO+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders.</a> Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).</li>
<li>Wingerchuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+consensus+diagnostic+criteria+for+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).</li>
<li>Ruiz-Gaviria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+aquaporin+4+antibody+detection+tests+in+patients+with+neuromyelitis+optica%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).</li>
<li>Waters, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicentre+comparison+of+a+diagnostic+assay%3A+aquaporin-4+antibodies+in+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).</li>
<li>Fryer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP4+autoantibody+assay+performance+in+clinical+laboratory+service%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+in+neuromyelitis+optica%3A+re-testing+study+in+a+large+population+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China.</a> The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).</li>
<li>Pisani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoantibodies+in+Neuromyelitis+Optica%3A+AQP4+isoform-dependent+sensitivity+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity.</a> PloS One. 8 (11), 79185(2013).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+testing%3A+direct+comparison+of+M1-AQP4-DNA-transfected+cells+with+leaky+scanning+versus+M23-AQP4-DNA-transfected+cells+as+antigenic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate.</a> Journal of Neuroinflammation. 11, 129(2014).</li>
<li>Juryńczyk, M., Craner, M., Palace, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+CNS+inflammatory+diseases%3A+differentiating+features+of+NMO+and+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).</li>
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<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+antibodies+to+aquaporin-4+in+neuromyelitis+optica+and+related+disorders%3A+frequency%2C+origin%2C+and+diagnostic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance.</a> Journal of Neuroinflammation. 7, 52(2010).</li>
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<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+an+international+update%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+encephalomyelitis%3A+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134(2018).</li>
<li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody+disease%3A+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li>
<li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody-positive%2C+benign%2C+unilateral%2C+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322(2017).</li>
<li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab%3A+A+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317(2016).</li>
<li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+A+multicenter+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li>
<li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li>
<li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo descritto un metodo ampiamente accessibile per rilevare anti-AQP4 IgG nel siero umano. IgG anti-AQP4 è strettamente correlata alla NMOSD, e stabilire un metodo di rilevamento di IgG anti-AQP4 affidabile è fondamentale per la diagnosi clinica di NMOSD. In primo luogo, IgG anti-AQP4 è specifico per NMOSD. La sclerosi multipla è una malattia immune-mediata del sistema nervoso centrale e condivide molte somiglianze con NMOSD12. Tuttavia, IgG anti-AQP4 è solo positivo in NMOSD...

Siero AQP4 IgG è un biomarcatore diagnostico di nucleo per neuromielite optica spettro disturbi (NMOSD)1. L'analisi basata sulle celle (CBA) è un metodo di rilevamento di IgG anti-AQP4 ampiamente usato con alta sensibilità e specificità. Qui, è stato introdotto un protocollo dettagliato per CBA.
AQP4, una proteina di canale di acqua, ha sei unità dimisurazione e due domini elicoidale che circonda uno acquosa2del poro. IgG anti-AQP4 è coinvolto nella patogenesi della NMOSD tramite l'associazione alla relativa destinazione AQP4, che si trova principalmente su endfeet di astrociti3. Esso ha dimostrato che le IgG anti-AQP4 è positivo in circa due terzi di NMOSD pazienti4. Nei più recenti criteri diagnostici internazionali per NMOSD, IgG anti-AQP4 è considerato essere un biomarcatore diagnostico core5. A questo proposito, è fondamentale stabilire un protocollo affidabile per rilevare siero umano IgG anti-AQP4 e facilitare la diagnosi clinica di NMOSD.
Attualmente, diversi metodi di rilevamento di IgG anti-AQP4 sono disponibili, come CBA, analisi tissutali, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente e flusso cytometry6,7. CBA impiega celle EU90, che transfected con AQP4 umana, per catturare le IgG anti-AQP4. Le IgG anti-AQP4 catturato viene rilevata da fluorescenti anticorpi secondari e successivamente visualizzate da microscopia. Raccogliendo la prova ha dimostrato che CBA è più sensibile e specifico rispetto altri anti-AQP4 IgG rilevamento metodi6,7. Secondo una meta-analisi, la sensibilità e la specificità del CBA sono stati indicati per essere 76% e 99%, che erano superiori di tissutali e6di analisi enzima-collegata dell'immunosorbente. Inoltre, un confronto multicentrico di saggi diagnostici di IgG anti-AQP4 era condotto7. Un totale di 193 Studio soggetti da 15 centri diagnostici europei sono stati arruolati7. Quattro diversi metodi sono stati utilizzati per rilevare siero anti-AQP4 IgG7. È stato dimostrato che la CBA era più sensibile e specifico rispetto gli altri metodi7. AQP4 è espressa come due isoforme principali (AQP4-M1 e AQP4-M23), delle cellule di cattura di IgG anti-AQP4 sono trasfettate con AQP4-M1 o AQP4-M23. Tuttavia, quale tipo di cella di cattura è migliore rimane discutibile. Una ricerca ha sostenuto AQP4-M1 basata CBA8, mentre altri hanno indicato che l'AQP4-M23 basato CBA è meglio7,9,10. Tuttavia, basati su AQP4-M23 CBA può dare risultati falsamente positivi a causa di non specifico IgG associazione8. Jarius et al.. 11 ha riferito che non c'era differenza significativa nei tassi di rilevamento di IgG anti-AQP4 tra AQP4-M1 ed eventuali CBA AQP4-M23-basato.
In sintesi, siero anti-AQP4 IgG è un biomarcatore di nucleo per NMOSD. CBA ha maggiore specificità e sensibilità rispetto ad altri metodi di rilevamento di IgG anti-AQP4. Rimane controverso se AQP4-M1 AQP4 M23-basato o CBA è meglio. In questo articolo, è descritto un protocollo dettagliato per CBA AQP4-M1-base, che può essere applicato a diagnosi clinica e studi di NMOSD.

<table><tbody><tr><td>Anti-acquaporina-4 IIFT</td><td>Euroimmun</td><td>FA 1128-2005-50</td><td>Contiene vetrini per biochip rivestiti con cellule EU 90 trasfettate e non trasfettate AQP4-M1, IgG umane marcate con fluoresceina, anticorpi anti-AQP4 come controllo positivo, campione negativo per anticorpi, sale per PBS pH 7.2, Tween 20 e terreno di inclusione.</td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>OLYMPUS</td><td>Software fotografico N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo attivatore di gel e coaguli</td><td>Migliora la</td><td>623040202</td> medica <td>Da un'azienda cinese locale</td></tr></tbody></table>

rilevamento di immunoglobulina anti-acquaporina-4 g di siero umano dall'analisi cell-based

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-acquaporina-4 (AQP4) dell'immunoglobulina G (IgG) è il biomarcatore diagnostico di nucleo per disordini di spettro di optica di neuromyelitis (NMOSD). L'analisi basata sulle celle (CBA) è un metodo ampiamente usato per rilevare anti-AQP4 IgG nel siero umano con alta sensibilità e specificità. Brevemente, siero anti-AQP4 IgG è catturato dai cellule trasfettate con AQP4 che sono fissata sul biochip poi rilevata da un anticorpo secondario marcato con fluoresceina. Microscopia di fluorescenza è utilizzata per visualizzare la fluorescenza e l'intensità di fluorescenza viene valutato da almeno due esperti clinici. Una diagnosi finale di NMOSD può essere fatta basata sulla combinazione di risultati di rilevamento di IgG anti-AQP4, manifestazioni cliniche e risultati neuroradiological. Secondo studi precedenti, CBA è più sensibile e specifico rispetto ad altri metodi di rilevamento di IgG anti-AQP4 e può essere applicato alla diagnosi clinica e di studi di NMOSD. Il metodo presenta limitazioni; ad esempio, la scala internazionale per valutare i titoli di IgG del siero anti-AQP4 è ancora carente. Qui, un protocollo dettagliato per il rilevamento di IgG anti-AQP4 siero umano utilizzando CBA è descritto.

Utilizzando la procedura descritta qui, IgG specifiche anti-AQP4 nel siero è rilevabile. Durante la procedura, campioni pre-diluiti, un controllo positivo e un controllo negativo sono state aggiunte per i campi di reazione, che contengono aree trasfettate e untransfected (Figura 2). Fluorescenza del controllo negativo in una zona trasfettata principalmente indicato il legame non specifico dell'anticorpo secondario alle cellule trasfettate il biochip (<strong ...

Test basati su celle è un metodo ampiamente utilizzato per rilevare l'immunoglobulina del siero anti-acquaporina-4 G. Questo metodo potrebbe essere applicato a diagnosi clinica e ricerche scientifiche di neuromielite ottica dello spettro autistico.

Rilevamento di immunoglobulina Anti-acquaporina-4 G di siero umano dall'analisi Cell-based

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Secondo i recenti criteri diagnostici internazionali per i disturbi dello spettro della neuromielite ottica, l'IgG anti-AQP4 è considerato un biomarcatore diagnostico di base. Il rilevamento IgG anti-AQP4 tramite saggio a base cellulare può facilitare la diagnosi clinica. Quindi, il saggio basato sulle cellule è più sensibile e specifico rispetto ad altri metodi di rilevamento.E può essere applicato sia alla diagnosi clinica che agli studi scientifici. In primo luogo, portare i campioni di siero del paziente, lo scivolo biochip, la polvere PBS e l'TWEEN 20 dal kit di dosaggio a base di cellule refrigerate alla temperatura ambiente. Quindi, preparare più di 200 millilitri di tampone di lavaggio PBS contenente lo 0,2% di TWEEN 20 per ogni scivolo biochip.Utilizzare il tampone di lavaggio per effettuare diluizioni seriali di 10 volte di ogni campione di siero. Preparare controlli positivi e negativi secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 30 microlitri di diluizioni seriali 10 volte del campione, il controllo positivo e il controllo negativo a cinque singoli campi di reazione sul vassoio del reagente.Tenere lo scivolo biochip per i suoi scivoli e rimuovere la sua copertura protettiva senza toccarne i campi di reazione. Mettere lo scivolo sopra il vassoio del reagente e incubare la configurazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare delicatamente lo scivolo biochip con il tampone di lavaggio.Quindi immergerlo in un becher da 500 millilitri riempito con 100 millilitri del tampone di lavaggio e lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti. Eserti lo scivolo biochip dal tampone di lavaggio. Utilizzare un tovagliolo di carta per pulire con cura il buffer rimanente dall'esterno dei campi di reazione.Lasciare asciugare l'aria dello scivolo per uno o due minuti. Nella stanza buia, aggiungere 25 microlitri di anticorpo secondario fluorescente a ciascun campo di reazione del vassoio del reagente. Mettere lo scivolo sopra il vassoio del reagente e incubare la configurazione a temperatura ambiente per 30 minuti.Risciacquare delicatamente lo scivolo biochip con il tampone di lavaggio. Quindi immergerlo in un becher da 500 millilitri riempito con 100 millilitri del tampone di lavaggio fresco e lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti. Eserti lo scivolo biochip dal tampone di lavaggio.Utilizzare un tovagliolo di carta per pulire con cura il buffer rimanente dall'esterno dei campi di reazione. Lasciare asciugare l'aria dello scivolo per uno o due minuti. Aggiungere con cura una goccia del mezzo di incorporamento a ciascun campo di reazione sullo scivolo biochip.Infine, sigillare lo scivolo biochip con un vetro di copertura evitando bolle d'aria e procedere con l'imaging. La debole intensità di fluorescenza del controllo negativo osservato nell'area infetta indica il legame aspecifico dell'anticorpo secondario. Il confronto tra le intensità di fluorescenza rilevate del controllo positivo nelle aree infette e non infette indica il legame specifico dell'IgG anti-AQP4 ad AQP4M1 nelle cellule infette.Il siero negativo IgG anti-AQP4 mostra modelli di legame simili al controllo negativo sia nelle aree infette che in aree non infette. Il siero positivo mostra modelli di legame simili al controllo positivo sia nelle aree infette che in aree non infette. I campioni sono considerati anti-AQP4 IgG positivi quando la fluorescenza aumenta eterogeneamente nell'area infetta.L'intensità della fluorescenza è correlata al titer IgG anti-AQP4 nel siero. I campioni sono considerati probabilmente positivi quando solo un piccolo numero di cellule nell'area trasfettata mostra intensità di fluorescenza rilevabili. Un campione deve essere considerato anti-AQP4 IgG negativo quando la sua intensità nell'area infetta è solo omogeneamente più forte che nell'area non infetta.Evitare bolle d'aria è vitale e difficile. Per eliminare le bolle d'aria, utilizzare prima una pipetta per evitare bolle d'aria nelle goccioline. In secondo luogo, durante l'applicazione della diapositiva biochip al vassoio del reagente, lasciare prima che un lato della diapositiva tocchi le goccioline, quindi livellare lentamente la diapositiva.Inoltre, non toccare i campi di reazione durante l'esperimento.

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Rilevamento di immunoglobulina Anti-acquaporina-4 G di siero umano dall'analisi Cell-based

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