Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica
9 febbraio 2019
Tomografia a coerenza ottica (OCT), una tecnologia di imaging tridimensionale, è stata utilizzata per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi multicellulari del tumore. Precisa quantificazione volumetrica di sferoidi tumore usando un voxel contando approccio e rilevamento di tessuto morto privo di etichetta in sferoidi basato sul contrasto intrinseco attenuazione ottica, sono stati dimostrati.
Gli sferoidi tumorali tridimensionali possono imitare le proprietà specifiche dei tumori in vivo, fornendo dati più rilevanti dal punto di vista clinico per la scoperta di farmaci anti-cancro rispetto alla semplice coltura cellulare 2D. La nostra tecnica di imaging, la tomografia a coerenza ottica, può facilmente visualizzare la struttura 3D di un singolo nervo tumorale, con una dimensione di diverse centinaia di micron, e fornire una caratterizzazione più accurata della sua morfologia e infestazione lavorativa, spesso in pochi secondi. Utilizzando il modello sferico 3D possiamo potenzialmente abbreviare la tempistica di scoperta dei farmaci, ridurre i costi e portare nuovi farmaci ai pazienti in modo più efficace.
Formare la forma sferica dell'ammasso tumorale è un passo fondamentale nel nostro esperimento. È importante scegliere la piastra di attacco ultra-bassa giusta con il fondo rotondo e la corretta velocità di centrifugazione dopo la semina cellulare. Inizia questo esperimento coltivando cellule interessanti in un pallone di coltura come descritto nel manoscritto.
Mantenere le cellule in un'incubatrice in condizioni standard e monitorare il loro stato di salute ogni giorno. Aggiornare i contenuti multimediali in base alle esigenze. Per eseguire la coltura cellulare 3D in piastre multi-pozzo, rimuovere prima il mezzo dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con PBS sterilizzato a 33 gradi Celsius prerifabbrito.
Quindi aggiungere un millilitro di Tripside-EDTA per rimorsi le cellule e incubare per tre minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere tre millilitri di mezzo di coltura per diluire la tripina. Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 500 G e temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con quattro millilitri di mezzo di coltura pre-riscaldato. Per determinare la concentrazione cellulare, hypat una goccia di campione su un emocitometro e contare le cellule. Diluire la concentrazione di semina desiderata.
Seme 200 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzo di un attacco ultra-basso, piastra multi-pozzo a fondo rotondo, ad una concentrazione di 3.000 cellule per millilitro, per raggiungere circa 600 cellule per pozzo. Subito dopo la semina, centrifugare l'intera piastra alla velocità più bassa disponibile, a temperatura ambiente, per sette minuti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5%Co2, assicurandosi di aggiornare il mezzo ogni tre giorni.
In primo luogo, costruire il braccio di riferimento e il braccio campione del sistema oct, seguendo gli schemi di questo manoscritto. Quindi, costruisci lo spettrometro, incluso un chilometro, una scarpata, un obiettivo F-Theta e una telecamera di scansione di linea. Utilizzare un adattatore piastra per mantenere la piastra multi-pozzo in posizione fissa.
Prima dell'imaging, correggere l'inclinazione e la rotazione della piastra multi-pozzo utilizzando uno stadio di inclinazione 2D e uno stadio di rotazione montato sullo stadio di transizione per ridurre al minimo la variazione del piano focale da diversi pozzi. Quindi regolare la rotazione per assicurarsi che i bordi della piastra siano paralleli alla direzione del movimento del palco, in modo che i pozzi rimangano nelle stesse posizioni orizzontali nelle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office. Quindi regolare lo stadio di inclinazione per assicurarsi che la piastra sia parallela al tavolo ottico, in modo che i pozzi rimangano nelle stesse posizioni verticali per l'imaging.
Il giorno dell'imaging degli sferoidi tumorali, rimuovere la piastra multi-pozzo dall'incubatrice. Trasferirlo sotto il sistema di imaging oct e posizionarlo sull'adattatore della piastra. Per regolare l'altezza della piastra, spostarla lungo la direzione Z della fase di traslazione.
Nel software di imaging personalizzato, impostare un intervallo di scansione OCT desiderato per coprire l'intero sferoide tumorale, a seconda delle sue fasi di sviluppo, e fare clic su Salva parametri per salvare l'impostazione. Quindi mostra le anteprime ottimizzate XZ e YZ OCT degli sferoidi tumorali. Acquisire immagini 3D OCT di sferoidi tumorali uno per uno per tutti i pozzi della piastra contenente sferoidi.
Per visualizzare l'immagine di anteprima, fare clic sul pulsante di anteprima. E per acquisire l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office, fare clic sul pulsante acquisisci. Registrare il processo di spostamento della fase complessiva dell'acquisizione dei dati dello Strumento di personalizzazione di Office.
Per garantire la qualità ottimale dell'immagine per tutti gli sferoidi tumorali, l'adattatore a piastre deve essere sintonizzato con precisione e il volume mediano deve essere lo stesso. Utilizzare un codice di elaborazione C+ personalizzato per elaborare set di dati 3D OCT di sferoidi tumorali per generare immagini strutturali dello Strumento di personalizzazione di Office. Usa immagini oct 2D in tre piani di sezione trasversale, XY, XZ e YZ attraverso il baricentro dello sferoide per generare il collage di immagini sferoidi.
Per ottenere il rendering 3D dello sferoide utilizzando un software desiderato, caricare prima i dati dello Strumento di personalizzazione di Office SD nel software. Fate clic sul pannello di superamento, quindi aggiungete nuovo volume e scegliete la modalità di fusione da utilizzare per il rendering 3D. Per regolare l'angolo di visualizzazione, usate il puntatore del mouse per trascinare l'immagine e procedere con la quantificazione come descritto nel manoscritto.
Dai dati elaborati è stato generato un collage di immagini oct non stampate di sferoidi a linea cellulare HCT116, con risultati paragonabili alle immagini di altri sistemi di imaging ad alta produttività 2D. Inoltre, è stato generato il collage di immagini sferoidi trasversali 2D da 96 pozzi per monitorare le altezze degli sferoidi e visualizzare l'inomogeneità degli sferoidi nella direzione verticale. Un collage di immagini sferoide renderizzate in 3D può essere generato da qualsiasi angolazione definita per visualizzare la forma 3D complessiva e valutare la rotondità dello sferoide.
Dopo la post-elaborazione generale degli OCT, sono state ottenute immagini strutturali 3D OCT di uno sferoide tumorale. Dai dati degli OCT, sono stati generati un palo di superficie 3D e fette ortogonali XZ, YZ e XY per visualizzare la struttura dello sferoide tumorale in qualsiasi direzione. Il monitoraggio longitudinale di un singolo sferoide tumorale è stato eseguito per caratterizzarne il diametro, l'altezza e il volume a base di voxel, generando le curve di crescita in dimensioni e volume durante lo sviluppo di 21 giorni.
Qui, lo sferoide è stato interrotto il giorno 11 e completamente crollato il giorno 21. Il tracciamento longitudinale ha mostrato l'aumento delle aree cellulari morte nello sferoide tumorale. Le immagini rese in 3D dello sferoide tumorale hanno mostrato l'aspetto e la crescita delle regioni delle cellule morte dal settimo al giorno 14, come dimostrato dall'aumento delle aree necrotiche evidenziate in rosso.
Con l'aumentare della percentuale delle aree necrotiche, lo sferoide tumorale non riusciva a mantenere la sua forma perfetta, e quindi collassò. Con questa piattaforma di imaging possiamo esplorare ulteriormente altri complessi modelli di sfera tumorale, come il modello di imaging 3D, il modello di creatura vasta e i modelli di co-coltura per simulare meglio i tumori in vivo. Il nostro sistema di imaging OCT ad alta produttività può fornire un approccio alterativo per lo screening dei farmaci nella scoperta di farmaci contro il cancro.
Questo è qualcosa di anche caratterizzato, campioni biofabbricati 3D per varie applicazioni biomediche.
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Panoramica
Questo studio utilizza la tomografia a coerenza ottica (OCT) per monitorare e caratterizzare la cinetica di crescita di sferoidi tumorali multicellulari. La tecnica consente una quantificazione volumetrica precisa e un rilevamento senza etichette del tessuto morto all'interno degli sferoidi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Tecnologia dell'imaging
Sfondo
- Gli sferoidi tumorali tridimensionali replicano le proprietà del tumore in vivo.
- Forniscono dati più clinicamente rilevanti per la scoperta di farmaci rispetto alle colture 2D.
- La OCT può visualizzare rapidamente e con precisione la struttura tridimensionale dei tumori.
- Un corretto allestimento sperimentale è fondamentale per la formazione degli sferoidi tumorali.
Scopo dello studio
- Migliorare la comprensione della cinetica della crescita tumorale.
- Accorciare i tempi della scoperta di farmaci e ridurre i costi.
- Utilizzare l'immagine 3D per una migliore caratterizzazione della morfologia tumorale.
Metodi Utilizzati
- Tomografia a coerenza ottica (OCT) per l'acquisizione di immagini.
- Approccio basato sul conteggio dei voxel per la quantificazione volumetrica.
- Rilevamento senza etichette del tessuto necrotico basato sull'attenuazione ottica.
- Utilizzo di piastre con attacco ultra-basso per la formazione di sferoidi.
Risultati principali
- Monitoraggio riuscito della cinetica di crescita degli sferoidi tumorali.
- Dimostrata quantificazione volumetrica accurata.
- Rilevamento efficace di tessuto necrotico all'interno degli sferoidi.
- Potenziale di ridurre i tempi di scoperta di farmaci.
Conclusioni
- OCT è uno strumento prezioso per lo studio degli sferoidi tumorali.
- Fornisce informazioni che possono migliorare i processi di sviluppo dei farmaci.
- È necessaria un'ulteriore ottimizzazione delle tecniche di formazione degli sferoidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Documento
La tomografia a coerenza ottica ad alto rendimento (HT-OCT) consente imaging 3D senza etichette e non distruttivo di sferoidi tumorali in piastre multipozzetto, affrontando una limitazione fondamentale nella scoperta di farmaci antitumorali, dove le modalità convenzionali non riescono a risolvere l'intera struttura 3D a causa della scarsa penetrazione e risoluzione in profondità. Fornendo dati morfologici e fisiologici longitudinali—tra cui dimensioni, volume e crescita delle regioni necrotiche—l'HT-OCT supporta la riduzione del rischio meccanicistica e aumenta la fiducia predittiva nei flussi di lavoro di validazione del bersaglio e identificazione dei composti promettenti. Questa capacità colloca l'HT-OCT come strumento traslazionale per lo screening di composti antitumorali in modelli 3D fisiologicamente rilevanti, migliorando l'accuratezza dei processi decisionali preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche monitorando la crescita longitudinale e l'integrità strutturale di sferoidi tumorali durante il trattamento con composti.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative e prive di marcatori esogeni della morfologia e vitalità dei sferoidi, riducendo la complessità del saggio.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione diretta dello sviluppo del core necrotico, un segno distintivo dell'evoluzione del microambiente tumorale.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera dati strutturali tridimensionali e contrasto basato sull'attenuazione, consentendo la discriminazione tra regioni vitali e necrotiche negli sferoidi.
- Valore operativo: Si integra con formati a piastre a 96 pozzetti per scansioni automatizzate dell'intera piastra, aumentando la produttività e la riproducibilità nelle campagne di screening.
- Prontezza del saggio: Produce sezioni ortogonali e ricostruzioni 3D che standardizzano la valutazione morfologica tra pozzetti e punti temporali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Mantiene la rilevanza fisiologica monitorando la cinetica di crescita degli sferoidi e le modifiche strutturali per 21 giorni, rispecchiando l'evoluzione tumorale in vivo.
- De-risking meccanicistico: Traccia l'attenuazione ottica intrinseca per quantificare le regioni di cellule morte, offrendo un surrogato senza etichette per la valutazione istopatologica.
- Allineamento preclinico: Supporta decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, collegando modifiche morfologiche a esiti funzionali nei modelli tumorali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
HT-OCT si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale del target all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, offrendo un ponte tra lo screening in 2D e modelli complessi in vivo mediante la fornitura di dati fenotipici in 3D in un formato scalabile.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante il monitoraggio longitudinale di dimensioni, altezza e volume degli sferoidi, consentendo una valutazione dinamica degli effetti dei composti sulla crescita tumorale.
- Screening: Fornisce dati 3D OCT pronti per il saggio con un allineamento coerente del piano focale tra pozzetti, garantendo immagini riproducibili per lo screening comparativo di composti.
- Analisi: Offre una quantificazione volumetrica basata sui voxel e parametri metrici basati sul contrasto di attenuazione che permettono un confronto oggettivo della morfologia degli sferoidi e del carico necrotico.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando la degenerazione strutturale e la progressione della necrosi osservate nella crescita tumorale acellulare.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile applicabile a diversi modelli 3D, inclusi co-colture e tessuti biofabbricati al di fuori dell'oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella valutazione della risposta tumorale mediante il monitoraggio diretto della struttura tridimensionale e della vitalità.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie alla scansione automatizzata delle piastre e al posizionamento invariante dei pozzetti, minimizzando la varianza tecnica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo fornendo segnali precoci e fisiologicamente rilevanti dell'efficacia o della tossicità del composto in contesto tridimensionale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio identificando composti che modulano la crescita degli sferoidi o la frazione necrotica, orientando l'ottimizzazione del capostipite.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento dei sistemi ottici, inclusa la costruzione dello spettrometro e la calibrazione della piattaforma per l'acquisizione di immagini da piastre multipozzetto.
- Si basa su un hardware OCT stabile dotato di piattaforme di traslazione, inclinazione e rotazione per mantenere la costanza del fuoco su formati a 96 pozzetti.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di formazione degli sferoidi, in particolare per quanto riguarda l'uso di piastre a adesione ultra-ridotta e i parametri di centrifugazione.
- Richiede l'adattamento delle procedure di elaborazione delle immagini per la ricostruzione 3D, il taglio ortogonale e l'analisi basata sui voxel in funzione di dimensioni variabili degli sferoidi.
- È limitato dall'altezza degli sferoidi (~600 µm) e dalla profondità di acquisizione, il che ne restringe l'applicabilità ai modelli entro il range di penetrazione dell'OCT.
