Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità
18 gennaio 2019
Qui, presentiamo un protocollo per isolare la membrana plasmatica, citoplasma e nei mitocondri delle cellule U937 senza l'uso di centrifugazione ad alta velocità. Questa tecnica può essere utilizzata per purificare le frazioni subcellulari per l'esame successivo di localizzazione della proteina tramite immunoblotting.
Questo protocollo consente ai ricercatori di ottenere frazioni distinte di una cellula senza l'uso di attrezzature specializzate, reagenti costosi o tecniche complesse. Il vantaggio principale di questo protocollo è la semplicità delle tecniche che lo rendono modificabile e facile da eseguire. A dimostrare la procedura saranno Matt Deragon, Rob Haluska e Alexa Hodges.Tre studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare a centrifugare la sospensione cellulare preparata per creare un pellet. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet a temperatura ambiente PBS. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per dieci minuti. Quindi rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare nel tampone freddo ghiacciato. Preparare il buffer Una soluzione in base al protocollo di testo. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per dieci minuti e rimuovere il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet nel tampone Una soluzione ad una concentrazione finale di 200 milioni di cellule per ml e pipettare delicatamente per rompere eventuali grumi. Dopo questo incubare la sospensione cellulare su un rotatore end over end a 4
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'isolamento della membrana plasmatica, del citoplasma e dei mitocondri di cellule U937 senza l'uso della centrifugazione ad alta velocità. La tecnica permette la purificazione di frazioni subcellulari per studi di localizzazione proteica mediante immunoblotting.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Chimica biologica
- Neuroscienze
Sfondo
- Le cellule U937 costituiscono un modello per lo studio della funzione dei monociti umani.
- L'isolamento di componenti subcellulari è fondamentale per comprendere i processi cellulari.
- I metodi tradizionali prevedono spesso la centrifugazione ad alta velocità, che può risultare dannosa per le cellule.
- Questo protocollo ha lo scopo di fornire un'alternativa più delicata per la frazionamento subcellulare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'isolamento di componenti cellulari senza centrifugazione ad alta velocità.
- Permettere l'analisi successiva della localizzazione delle proteine.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi cellulari nelle cellule U937.
Metodi Utilizzati
- Isolamento della membrana plasmatica, del citoplasma e dei mitocondri.
- Utilizzo di reagenti specifici per facilitare la frazionamento cellulare.
- Immunoblotting per l'analisi della localizzazione delle proteine.
- Confronto dei risultati con metodi tradizionali.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di frazioni subcellulari senza centrifugazione ad alta velocità.
- Visualizzazione chiara della localizzazione delle proteine mediante immunoblotting.
- Dimostrata efficienza e delicatezza del nuovo protocollo.
- Potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca in biologia cellulare.
Conclusioni
- Il nuovo protocollo è efficace per l'isolamento dei componenti delle cellule U937.
- Fornisce un'alternativa praticabile ai metodi tradizionali.
- Studi futuri possono utilizzare questa tecnica per svariate analisi cellulari.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo protocollo consente una frazionamento subcellulare economico delle cellule U937 senza centrifugazione ad alta velocità, supportando la validazione degli bersagli e la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta. Isolando le frazioni citoplasmatiche, mitocondriali e della membrana plasmatica mediante reagenti e attrezzature facilmente accessibili, facilita studi sulla localizzazione proteica fondamentali per la chiarificazione dei percorsi metabolici e lo sviluppo di saggi. L'approccio riduce la dipendenza da infrastrutture specializzate, migliorando scalabilità e riproducibilità nei flussi di lavoro per la valutazione preclinica dei bersagli.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la localizzazione subcellulare delle proteine in un modello di monocita umano rilevante per l'immunologia e l'infiammazione.
- Valore operativo: Offre un'alternativa più delicata all'ultracentrifugazione, preservando l'integrità delle proteine e la formazione di complessi per la valutazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica chiarificando il coinvolgimento delle vie e il segnale specifico del compartimento nelle cellule rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera frazioni subcellulari purificate adatte a saggistica basata su immunoblotting per valutare l'interazione o la modulazione del bersaglio.
- Riproducibilità: Utilizza condizioni standardizzate di tampone e passaggi di centrifugazione differenziale per garantire una frazionamento consistente tra esperimenti.
- Scalabilità: Il protocollo può essere adattato per accogliere diversi numeri di cellule, supportando preparazioni per schermature a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Le cellule U937 modellano la funzione dei monociti umani, consentendo l'esplorazione traslazionale di biomarcatori in contesti di malattie infiammatorie e infettive.
- Continuità preclinica: Le frazioni isolate supportano la validazione successiva della localizzazione del bersaglio e del meccanismo d'azione prima di studi in vivo.
- Avanzamento con valutazione del rischio: Permette una riduzione precoce dei rischi associati ai bersagli confermandone l'accessibilità subcellulare e il potenziale di interazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio mediante frazionamento biochimico prima di passare allo sviluppo del saggio e alla valutazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi mediante frazionamento subcellulare per chiarire la localizzazione del bersaglio e il coinvolgimento nelle vie metaboliche in cellule U937.
- Screening: Produce frazioni citoplasmatiche, mitocondriali e di membrana standardizzate per saggi di convalida del bersaglio basati su immunoblotting affidabili.
- Analisi: Genera dati quantitativi sulla localizzazione proteica tramite immunoblotting, consentendo il confronto della distribuzione del bersaglio in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento di biomarcatori confermando la presenza del bersaglio in compartimenti subcellulari rilevanti per la malattia in un modello umano di monociti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di frazionamento riutilizzabile e a basso costo, applicabile a più bersagli e progetti nella ricerca in immunologia e infiammazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie a prove dirette di localizzazione subcellulare.
- Valore operativo: Elimina la necessità di ultracentrifugazione, riducendo i costi delle attrezzature e aumentando l'accessibilità in diversi siti di ricerca.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati precoci e affidabili sull'accessibilità e sul compartimento dell'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla localizzazione subcellulare validata in un modello cellulare umano fisiologicamente rilevante.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nella frazionamento subcellulare e nelle tecniche di immunoblotting.
- Richiede l'accesso a centrifughe refrigerate, agitatori rotanti e reagenti di laboratorio standard come la digitonina e i tamponi ipotonici.
- Necessita della standardizzazione della densità cellulare, dei tempi di incubazione e delle condizioni di lisi per garantire un frazionamento riproducibile tra diversi utilizzatori.
- L'adattamento ad altri tipi cellulari potrebbe richiedere l'ottimizzazione della composizione del buffer di lisi e dei parametri di centrifugazione.
- I limiti pratici includono la possibile separazione incompleta degli organelli e la variabilità nel rendimento in funzione dello stato di salute delle cellule e del numero di passaggi.
