Name: Unanalisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Impara un saggio di micro-neutralizzazione ad alta velocità per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo metodo riproducibile utilizza cellule A549 e offre basso costo per laboratori globali.

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Gli autori ringraziano tutti i partecipanti coinvolti. Riconosciamo il programma di supporto dell'infrastruttura operativa del governo vittoriano. PVL è un destinatario NHMRC carriera sviluppo Fellowship.

Nota: Tutte le fasi devono essere eseguite in un cappuccio BSL2 se non diversamente indicato. Titolazione virale è richiesto in anticipo un dosaggio PRN per determinare la concentrazione ottimale di RSV usata per il test PRN. Si raccomanda di aliquota le scorte di virus in un piccolo volume che verrà una volta scongelati e utilizzato per ogni dosaggio NAb. Inoltre è consigliabile utilizzare lo stesso stock virale per tutti i saggi di NAb eseguite per tutti i campioni provenienti da uno studio. Assicurarsi di terreni di coltura e tampone fosfato salino (PBS) è riscaldato a 37 ° C prima di aggiungere alla cella piastre.
1. Titolazione virale RSV
Nota: A seconda del numero di azioni di virus e il numero di duplicati, la piastra di dosaggio può essere impostata secondo la Figura 1. Ogni stock di virus deve essere titolato in triplice copia verso il basso la piastra di dosaggio, a partire dalla più alta concentrazione virale (cioè, 01:10). Titolazioni seriale possono essere in genere 01:10. Coltura delle cellule A549 e manutenzione, nonché la procedura cultura RSV è fatto utilizzando le procedure standard e non sono inclusi nel presente protocollo.
<ol><li>Semina le piastre (1 giorno)
	<ol>
<li>Risospendere le cellule A549 in di Dulbecco per volta Eagles medium (DMEM) + 10% di siero fetale di vitello (FCS) + 1000 UI di penicillina/streptomicina (pen/strep) a 4 x 105/ml. Piastre sterili seme 96 pozzetti a fondo piatto con 100 μL/pozzetto contenente cellule 4 x 104 A459.</li>
		<li>Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 (cellule sarà la crescita di registro-fase). Nota: Utilizzare nuovo flacone di cellule A549 dopo 23 passaggi. Si consiglia di non iniziare gli esperimenti quando un nuovo flacone di cella è ancora alle prime tre passaggi.</li>
	</ol></li>
	<li>Infezione da virus (giorno 2)
	<ol>
<li>Preparazione delle diluizioni seriali di virus<ol>
<li>Scongelare rapidamente un singolo flaconcino congelato di RSV in un bagnomaria a 37 ° C fino a quando quasi completamente scongelati e mettere immediatamente sul ghiaccio. Preparare 3 ripetizioni per ogni RSV brodo di virus per essere analizzati, usare una diluizione stock iniziale virus di 01:10 con 100 μL di virus diluito/pozzetto e riservare almeno una colonna per il controllo negativo. Nota: La figura 1 Mostra controllo negativo in triplici copie.</li>
			<li>Aggiungere 100 μL di ogni virus diluito alle 01:10 in triplice copia della riga A di un fondo U 96 pozzetti piastra sterile. Aggiungere 90 μL/pozzetto di DMEM + 1000 IU pen/strep senza FCS a righe B-H.</li>
			<li>Eseguire serial 01:10 diluizioni giù la piastra trasferendo 10 μL dalla fila alla soluzione B. Mix di pipettaggio contenuto su e giù per 5 volte di fila e continuare le diluizioni dieci volte fino alla riga H. Discard 10 μL di finale, in modo che il volume finale in ciascuna è ben 90 μL. Nota: È importante utilizzare nuovi suggerimenti per ogni diluizione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculazione del virus alle cellule A549
		<ol>
<li>Recuperare A549 cell plate(s) preparato il giorno precedente. Assicurarsi che i monostrati di cellule umane A549 in piastre da 96 pozzetti siano ~ 80% confluenti. Gettare il terreno capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile.</li>
			<li>Lavare due volte tutti i pozzetti con 100 μL di PBS, eliminare l'eccesso di PBS capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile dopo ogni lavaggio. Non consentire piastre ad asciugare.</li>
			<li>Trasferire le diluizioni di virus dalla piastra di Titolazione virale (Figura 1) nei pozzetti corrispondenti sulla piastra delle cellule A549. Incubare la piastra per 1 h a 37 ° C, 5% CO2. Dopo 1 h di incubazione, decantare surnatanti utilizzando una pipetta (per evitare la contaminazione incrociata). Prendere fuori 90 μL/pozzetto.</li>
			<li>Aggiungere 100 μL di medium 1 x 199 (M199, vedi tabella materiali) + 1,5% sale di sodio carbossimetilcellulosa (CMC) bassa viscosità + 2% FCS contenente pen/strep a ciascun pozzetto. Nota: 2 x M199 + 4% FCS + pen/strep del 2% e 3% CMC soluzioni devono essere preparati in anticipo e conservato a 4 ° C per un uso futuro. Assicurarsi che la soluzione viene riscaldata a 37 ° C prima di aggiungere alle piastre.<ol>
<li>Preparare la soluzione di x M199 2: 1 bustina/500 mL di acqua distillata acqua + 20 mL FCS + penna 10ml/strep (compongono 2 x MI99). Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante di 0.22 μm.</li>
				<li>Per la preparazione di 3% CMC, aggiungere 15 g di CMC lentamente in 500 mL di acqua distillata. Sciogliere la CMC in acqua tramite riscaldatore metallico agitatore a 50 ° C, che dura circa 1 h di preparazione. Mix bene a fare 3% CMC ed autoclave la soluzione. Nota: La CMC solida deve essere aggiunto all'acqua al fine di essere sciolto; l'aggiunta di acqua al solido secco produce un "ciuffo" di solido che è molto difficile da sciogliere.</li>
				<li>Preparare 1 x M199 + 1,5% a bassa viscosità CMC + 2% FCS contenente pen/strep di miscelazione 1:1 2x M199 e 3% CMC preparata al punto 1.2.2.4.2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Incubare la piastra per 3 giorni a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Lo sviluppo di piastra di test e analisi (giorno 5)
	<ol>
<li>Fissazione e sviluppo analisi piastra<ol>
<li>Scartare M199 + CMC + 2% FCS contenente pen/strep capovolgendo delicatamente la piastra. Aggiungere lentamente (per evitare di disturbare lo strato delle cellule) 200 μL di tampone di fissazione (80% di acetone, 20% PBS, conservati a-20 ° C) per fissare le cellule. Incubare a-20 ° C per 20 min.</li>
			<li>Scartare il buffer di fissazione e asciugare delicatamente il foglio di carta assorbente. Lasciare il viso piatto fino a secco per 10 min. Nota: Da questo punto in poi, analisi possono essere eseguita di fuori della cappa BSL2.</li>
			<li>Preparare soluzione bloccante diluente di latte 5% in PBS filtrato contenente 0,05% polisorbato 20 (PBS-polisorbato, Vedi Tabella materiali). Per una piastra, calcolare il volume necessario per blocco basato su pozzi 200/bene e 110: 200/pozzetto x 110 pozzi = 22 mL (1,1 mL concentrato di latte diluente a 20,9 mL filtrato PBS-polisorbato). In questa fase, inoltre compongono sufficiente soluzione bloccante per anticorpi primari e secondari. Per una piastra, calcolare il volume necessario per ogni soluzione di anticorpo basata su pozzi/50 e 110: 110 pozzi x 50/ben = 5,5 mL. Di conseguenza, il volume totale di latte diluente soluzione necessaria per l'analisi di una singola piastra di blocco è 33 mL.</li>
			<li>Aggiungere 200 /well di soluzione bloccante. Incubare la piastra a temperatura ambiente (TA) per 30 min. scartare la soluzione capovolgendo delicatamente la piastra e asciugare su carta assorbente.</li>
			<li>Preparare l'anticorpo di capra X RSV 1: 500 (mAb – anticorpo primario) diluito in soluzione di blocco. Aggiungere 50 /well della soluzione mAb e incubare a 37 ° C per 1 h. piastra lavare 3 volte con PBS-polisorbato filtrata.</li>
			<li>Preparare asino di Alexa Fluor 1:5,000 anti-capra IgG (anticorpo secondario) diluito in soluzione di blocco. Aggiungere 50 /well della soluzione anticorpo secondario e incubare a 37 ° C per 1 h. piastra di lavare 5 volte con PBS-polisorbato filtrata.</li>
			<li>Leggere la piastra su un lettore di macchie automatizzati utilizzando il canale di fluoresceina isotiocianato (FITC) e contare le impostazioni come mostrato nella Figura 2. Piastra di avvolgere in un foglio e conservare a 4 ° C. Tarare lo strumento utilizzando una piastra 96 pozzetti inutilizzati e l'immissione delle impostazioni di conteggio prima del dosaggio. Nota: Ri-scansione entro pochi giorni è possibile se necessario. La calibrazione e l'impostazione di conteggio può essere salvati e utilizzati per la futura scansione se il dosaggio viene utilizzato lo stesso tipo di piastra utilizzata per la calibrazione.</li>
			<li>Controllare le immagini di pozzi per manufatto placche o strati monomolecolari della cellula perturbato (Figura 3). Escludere i pozzetti con strati monomolecolari della cellula perturbato. Nota: A seconda delle dimensioni delle placche dell'oggetto, potrebbero essere necessario essere eseguita per quei pozzi conteggi manuali o quei pozzi potrebbero essere necessario essere scartato dall'analisi dei dati. Criteri per un risultato valido includere nessun perturbato cella monostrato o manufatto placche rilevate in più di una replica ben e nessun PFU rilevato nei pozzetti negativi (pozzi senza virus aggiunto).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Determinare le concentrazioni di virale
		<ol>
<li>Scegliere le ultime due diluizioni dove macchie possono essere conteggiati chiaramente. Calcolare il numero medio di macchie dai pozzi di replicare con la stessa diluizione. Calcolare il titolo virale (PFU / mL) del campione d'archivio utilizzando la seguente formula: PFU/mL = numero medio di placche / (fattore di diluizione × Volume di virus diluito aggiunto al pozzo) Nota: La concentrazione di virus determinata per ogni stock di RSV ora può essere utilizzata nell'analisi della PRN (passaggio 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. analisi di neutralizzazione RSV
<ol><li>
Semina le piastre (1 giorno)
	<ol>
<li>Risospendere le cellule A549 in DMEM + 10% FCS + 1000 IU pen/strep a 4 x 105/ml. Piastre sterili seme 96 pozzetti a fondo piatto con 100 μL/pozzetto contenente 4 x 104 A459 cellule e incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 (cellule sarà la crescita di registro-fase). Nota: Utilizzare nuovo flacone di cellule A549 dopo 23 passaggi. Non è consigliabile utilizzare cellule A549 prima numero di passaggio 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del siero e virus (giorno 2) Nota: A seconda del tipo di campione, ci sono passaggi necessari per la pre-elaborazione campioni prima del dosaggio di NAb. Si consiglia di utilizzare i sieri standard internazionali di RSV che sono ora disponibili su richiesta dell'Istituto nazionale per gli standard biologici e controlli (NIBSC).<ol>
<li>
Preparazione della diluizione del siero
		<ol>
<li>Scongelare l'antisiero di riferimento umano RSV (siero di riferimento, REF) e siero test campioni a RT. calore-inattivare i campioni di siero e riferimento antisiero in un bagno di acqua a 56 ° C per 30 min prima dell'uso. Preparare diluizioni secondo il modello di piastra (Figura 4).</li>
			<li>Preparare la diluizione 1: 100 di preparare il Rif. un minimo di 110 μL di REF diluito in DMEM + pen/strep senza FCS per piastra di dosaggio (ad esempio, 1.5 μL di REF in un volume totale di 150 µ l). Aggiungere 110 μL di 1: 100 diluito REF in A12 bene di un fondo U 96 pozzetti piastra sterile.</li>
			<li>Aggiungere 55 μL di DMEM + pen/strep senza FCS pozzetti B12 a H12 nella colonna 12. Eseguire diluizioni 1:2 giù la piastra serie trasferendo μL 55 da riga A riga B, soluzione di miscelazione di pipettaggio contenuto su e giù per 5 volte e continuando fino alla riga H. scartare il μL 55 finale dei media affinché il volume finale in ciascuna è ben 55 μL. Utilizzare nuovi suggerimenti per ogni diluizione.</li>
			<li>Preparare la diluizione 1: 100 del siero campioni di prova. Come tutti i campioni di siero sono analizzati in triplice copia, preparare un volume minimo di μL/pozzetto 110 x 3 = 330 µ l per campione di siero.</li>
			<li>Aggiungere 110 µ l di ogni campione di siero diluito (1: 100; S1 = siero 1, S2 = siero 2, ecc.) ai rispettivi pozzetti A1 a A9 e anche E1 a E9 della piastra 96 pozzetti sterile secondo Figura 4.</li>
			<li>Aggiungere 55 μL di DMEM + pen/strep senza FCS in tutti i pozzetti etichettati X. Perform seriale diluizioni 1:2 secondo passaggio 2.2.1.3 fino alla riga D (per campioni 1, 2 e 3). Scartare il μL 55 finale dei media di modo che il volume finale in ciascun pozzetto è 55 μL. Allo stesso modo, eseguire il seriale diluizioni 1:2 per esempi 4, 5 e 6 per le righe E a H. Nota: È importante utilizzare nuovi suggerimenti per ogni diluizione.</li>
			<li>Aggiungere 55 μL di DMEM + pen/strep senza FCS pozzetti nelle colonne 10 e 11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparazione di virus
		<ol>
<li>Scongelare rapidamente un singolo flaconcino congelato di RSV in un bagnomaria a 37 ° C fino a quando quasi completamente scongelati e mettere immediatamente sul ghiaccio.</li>
			<li>Diluire il virus in DMEM + pen/strep senza FCS basato sulla concentrazione dell'aliquota RSV determinato al punto 1.3.2. Applicare una diluizione che dà circa 200 PFU/pozzetto. Preparare un volume totale di 5,5 mL (per 100 pozzi).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparazione della miscela di virus-siero
		<ol>
<li>Aggiungere 55 del virus diluito a tutti i pozzetti delle colonne 1-9 e pozzi di righe E-H di colonne 10 e 11 (controllo positivo) secondo il modello di piastra (Figura 4).</li>
			<li>Aggiungere 55 di DMEM + pen/strep senza FCS in tutti i pozzetti di righe A-D di colonne 10 e 11 (controllo negativo). Incubare la piastra per 1 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculazione del virus alle cellule A549
		<ol>
<li>Prima del completamento del periodo di incubazione, recuperare A549 cell plate(s) preparata al punto 2.1.1. Assicurarsi che i monostrati di cellule umane A549 in piastre da 96 pozzetti siano ~ 80% confluenti.</li>
			<li>Gettare il terreno capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile. Lavare due volte tutti i pozzetti con 100 μL di PBS, eliminare l'eccesso di PBS capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile dopo ogni lavaggio. Non consentire piastre ad asciugare.</li>
			<li>Trasferire 100 /well della miscela siero-virus ai pozzetti corrispondenti sulla piastra delle cellule A549 seguendo il modello di piastra Incubare la piastra per 1 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
			<li>Dopo 1 h, utilizzando una pipetta, prendere 90/bene e aggiungere 100 di preriscaldata 1x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + pen/strep. Incubare la piastra per 3 giorni a 37 ° C, 5% CO2. Nota: Assicurarsi che la soluzione viene riscaldata a 37 ° C prima di aggiungere alle piastre.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lo sviluppo di piastra di test e analisi (giorno 5)
	<ol>
<li>Sviluppare la fissazione e l'analisi lastra 1.3.1.1 a 1.3.1.8 come segue.</li>
		<li>Determinare il titolo di neutralizzazione del 50%<ol>
<li>Determinare che il titolo di neutralizzazione del 50% calcolando la distanza proporzionale tra le diluizioni di siero reciproco sopra e sotto il 50% del controllo 'nessun siero' pozzi (controllo positivo del virus - colonna 10, righe E-H).</li>
			<li>Contare il numero di PFU (cioè, placche) derivanti da infezioni virali individuali nei pozzi del siero e nessun controllo del siero. Calcolare il numero medio di PFU nei pozzetti di controllo senza siero e determinare il valore di 50%.</li>
			<li>Identificare le diluizioni del siero con conteggi che sono immediatamente sopra e sotto il valore di 50% nei pozzetti di controllo senza siero. Utilizzando un modello di foglio di calcolo o grafico semi-log, tracciare il numero di PFU su asse x (scala lineare) e la diluizione del siero reciproco sull'asse y (scala logaritmica10 ). Tracciare una linea tra i due punti e leggere i titoli di neutralizzazione del 50% del test i campioni del siero da questa linea. Nota: Il foglio di lavoro test RSV PRN (Foglio di lavoro complementare) viene utilizzato per determinare il titolo di neutralizzazione del 50%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015%3A+a+systematic+review+and+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo sviluppato e ottimizzato un'analisi di micro-neutralizzazione di RSV semplice ed efficiente che può essere facilmente adattata nella maggior parte dei laboratori. Questo test è in grado di misurare la capacità di infezione virale così come l'inibizione di infezione virale di NAb a livello cellulare mediante scansione immagine automatizzata di misura. L'uso di una piattaforma basata su formazione immagine e sistemi basati su anticorpi specifici ha aumentato la specificità e la sensibilità di rilevazione spot rispe...

Virus respiratorio sinciziale (RSV) è la causa principale delle infezioni più basse delle vie respiratorie nella popolazione pediatrica in tutto il mondo1. Nonostante la sua alta difficoltà, non c'è ancora nessun vaccino o trattamento disponibile. Dal 2013, l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha dichiarato lo sviluppo di vaccini di RSV come una priorità di ricerca principali, con annuale WHO consultazione riunioni2,3. L'OMS ha concordato sull'utilizzo RSV neutralizzando misura dell'anticorpo (NAb) per monitorare l'immunogenicità del vaccino, come questo è riconosciuto come il principale marker sierologico di protezione4. NAbs hanno dimostrato di proteggere contro l'infezione RSV severa in un certo numero di studi, nonché a studi clinici di palivizumab l'anticorpo monoclonale anti-RSV, attualmente la strategia solo profilattico disponibili4.
Ci sono diversi formati di dosaggio NAb usati dai laboratori in tutto il mondo, tra cui saggi basati su molecolare e cellulare, che hanno compiuto sforzi di standardizzazione impegnativo5,6,7,8. Tuttavia, l'analisi di neutralizzazione (PRN) riduzione della placca convenzionale che misura il numero di riduttore della placca formando unità (PFU) dalla presenza di un anticorpo specifico RSV rimane ancora il gold standard9. Qui, segnaliamo un protocollo PRN migliorato, semplificato e ad alta velocità che può essere utilizzato su numerose linee cellulari, per diversi ceppi di RSV e con un throughput di dosaggio aumentato. Questo protocollo è stato testato utilizzando campioni clinici da impostazioni diverse, come pure su campioni provenienti da esperimenti di modello animale.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>fornito dal Dr. Keith Chappell, University of Queensland</td></tr><tr><td>Viral ceins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RSV A2</td><td>ATCC</td><td>VR-1540</td><td>numero di lotto 60430286</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck</td><td>1000142511</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor asino anti-capra IgG (conservato a 4 &deg; C)</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>CMC sale sodico in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (senza siero, 3,7 g/L NaHC, P/S) (conservato a 4 &deg; C)</td><td>Servizi scientifici &ndash; Coltura tissutale</td><td>MCRI in house fornitura</td>Siero fetale di vitello (conservato in aliquote da 50 ml a -20 °;<td></td></tr><tr><td> C)</td><td>Interpath</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>Goat X RSV anticorpo</td><td>Merck</td><td>AB1128</td><td></td></tr><tr><td>antisiero policlonale umano contro il virus respiratorio sinciziale (RSV) (conservato in 45 &micro; L aliquote a -20 &deg; C)</td> <td>BEI Resources</td><td>NR-4022</td><td>Ordine gratuito tramite BEI Resources al momento della registrazione. Questo siero appartiene a un pannello di antisiero umano e immunoglobuline per RSV (NR-32832)</td></tr> <tr><td>M199 polvere</td><td>Life Technologies</td><td>31100035</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante diluente al latte (conservata a 4 &deg; C)</td><td>Australian Biosearch</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (conservato in aliquote da 6 ml a -20 gradi; C)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>s.d.H2O dal dispenser Milli-Q</td><td>Merck</td><td></td><td>Dispensazione interna</td></tr><tr><td>Sterile 1x PBS per coltura (conservato a 4 &deg; C)</td><td>Servizi scientifici &ndash; Coltura tissutale</td><td>MCRI in house supply</td>Tween 20 polisorbato Sigma-Aldrich 9005-64-5General Materiali di consumoProvette Falcon coniche (50 mL)Invitro Technologies FAL352070 Unità filtrante 0,22 &;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> m (500 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL5660020</td><td></td></tr><tr><td>Provette sterili Eppendorf (1,5 mL)</td><td>Australia PL</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Piastre sterili a fondo piatto (96 pozzetti con coperchio)</td><td>Interpath</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Piastre sterili con fondo a U (96 pozzetti con coperchio)</td><td>Interpath</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 10 mL</td><td>Interpath</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 25 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Tip Pipette 1-200 &; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilizzato 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-200-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Tip Pipetta 5-20 &; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilizzato 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-20-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Tip Pipetta 100-1.000 &; LClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-1000-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Tip Pipetta 1-10 &; L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td><td>Fisher Biotec</td><td>TXLF-10-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature e software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISpot sistema di lettura</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AID ELISpot software versione 5.0</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2007</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un'analisi di micro-neutralizzazione del virus respiratorio sinciziale (rsv) migliorata e ad alta velocità di trasmissione

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratori sinciziali virus-specifici anticorpi neutralizzanti (RSV NAbs) sono un indicatore importante di protezione contro RSV. Un numero di formati diversi test è attualmente in uso in tutto il mondo c'è un'esigenza di un metodo preciso e ad alta produttività per la misurazione NAbs RSV. Descriviamo qui un'analisi micro-neutralizzazione basato su formazione immagine che è stata testata su sottogruppo RSV A e può essere adattata anche per RSV sottogruppo B e tipi di campioni diversi. Questo metodo è altamente riproducibile, con variazioni inter-saggio per l'antisiero di riferimento inferiore al 10%. Crediamo che questo test può essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Sviluppo di un'analisi migliore, ad alta produttività che misura RSV NAbs rappresenta un significativo passo avanti per la normalizzazione di questo metodo a livello internazionale, oltre ad essere critici per la valutazione di nuovi candidati vaccinali di RSV in futuro.

La titolazione di uno stock di virus è stata effettuata da 01:10 a 01:108 diluizione per determinare la concentrazione di stock di virus prima del dosaggio del PRN (risultati rappresentativi illustrati nella Figura 5). Dalla Figura 5, PFU può contare in modo affidabile alle diluizioni di 01:104 e 01:105. È stato calcolato il numero medio di PFU da pozzi triplici con la stessa diluizione. Poiché il...

Questo studio descrive un throughput elevato, basato su formazione immagine di analisi di micro-neutralizzazione per determinare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo formato di dosaggio è stato testato su tipi di campioni diversi.

Un'analisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

C'è bisogno di un metodo accurato e ad alta produttività per misurare gli anticorpi neutralizzanti RSV, come importante marcatore di protezione contro il virus respiratorio sinciteale. Questo metodo è altamente riproducibile con variazioni inter-test per l'antisiero di riferimento inferiore al 10%Crediamo che questo saggio possa essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Descriviamo qui un saggio di micro-neutralizzazione basato sull'imaging che è stato testato sul sottogruppo RSV A e può anche essere adattato per il sottogruppo RSV B e diversi tipi di campione.A dimostrare la procedura sarà Reuben Tse, membro del gruppo di ricerca di MCRI. Per seminare piastre il primo giorno, riutilizzare per la prima volta le cellule A549 nei supporti DMEM, con 10%FCS e 1.000 unità miscela Penicillina-Streptomicina ad una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro. Quindi seminare piastre sterili a fondo piatto da 96 po 'con 40.000 cellule A459 ad una densità di 100 microlitri per pozzo.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica del 5% durante la notte. Per preparare la diluizione del siero il secondo giorno, scongelare prima il siero di riferimento RSV umano e i campioni di prova del siero a temperatura ambiente. Quindi mettili in un bagno d'acqua a 56 gradi Celsius per 30 minuti per riscaldarli e attivarli.Successivamente, preparare più di 110 microlitri di una diluizione da uno a 100 del siero di riferimento mescolando 1,5 microlitri del siero di riferimento con supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ad un volume finale di 150 microlitri. Pipetta 110 microlitri di questa diluizione in pozzo A12 di una piastra sterile con fondo a U da 96 po '. Per effettuare diluizioni seriali da uno a due lungo la piastra, aggiungere prima 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi da B12 a H12.Quindi con una nuova punta trasferire 55 microlitri dal pozzo A12 al pozzo B12. Pipettare su e giù cinque volte per mescolare la soluzione, e continuare fino a raggiungere bene H12. Pipettare fuori gli eccesso di 55 microlitri della soluzione dal pozzo H12.Successivamente, preparare una diluizione da uno a 100 di campioni di prova del siero e aggiungere 110 microlitri di ogni diluizione ai pozzi corrispondenti da A1 a A9 ed E1 a E9 della piastra sterile da 96 po '. Quindi aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi nelle colonne da uno a nove. Effettuare diluizioni seriali da una a due della riga A alla riga D e dalla riga E alla riga H come descritto in precedenza.Aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi nelle colonne 10 e 11. Per preparare lo stock di virus, prima metti una fiala congelata di RSV in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per scongelarla rapidamente, quindi posiziona il flaconcino sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere il virus al supporto DMEM contenente miscela Penicillina-Streptomicina a circa 200 PFU per pozzo per fare un volume totale di 55 millilitri per 100 pozzi.Per preparare la miscela di siero virale, aggiungere prima 55 microlitri del virus diluito a tutti i pozzi delle colonne da uno a nove e pozzi di righe da E a H delle colonne 10 e 11. Quindi aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina a tutti i pozzi di file da A a D delle colonne 10 e 11 e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% per un'ora. Prima dell'inoculazione delle cellule A549 con RSV, esaminare la piastra cellulare al microscopio leggero per confermare che i monostrati cellulari A549 sono confluenti all'80%.Quindi invertire delicatamente la piastra per scartare il supporto e asciugare leggermente la piastra su un tovagliolo di carta assorbente sterile. Dopo ciascuno, lavare con PBS sterile filtrato. Aggiungere quindi 100 microlitri per pozzo della miscela di siero virale ai pozzi corrispondenti sulla piastra cellulare A549 in base al modello di piastra fornito nel manoscritto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per un'ora.Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta per rimuovere 90 microlitri per pozzo e aggiungere 100 microlitri del supporto contenente 1XM199, 1,5%CMC e 2%FCS nella miscela Penicillina-Streptomicina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per tre giorni. Per fissare e sviluppare una piastra di dosaggio, invertire prima delicatamente la piastra cellulare A549 infetta da RSV per scartare delicatamente il supporto contenente M199, CMC, 2%FCS e la miscela Penicillina-Streptomicina.Quindi aggiungere lentamente 200 microlitri di Fixation Buffer ad ogni pozzo. Incubare la piastra a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi scartare il tampone di fissazione e tamponare delicatamente su un tovagliolo di carta assorbente.Lasciare asciugare la piastra a faccia in giù per 10 minuti. Quindi, con tampone PBS filtrato contenente 05 polisorbato 20, fare soluzione di blocco del latte al 5%. Aggiungere 200 microlitri della soluzione di blocco ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti.Al termine dell'incubazione invertire delicatamente la piastra per scartare la soluzione e tamponare su un tovagliolo di carta assorbente. Per realizzare l'anticorpo primario, diluire da uno a 500 anticorpi XRSV di capra nella soluzione di blocco. Aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.Lavare la piastra tre volte con PBS-polisorbato filtrato. Successivamente, fare l'anticorpo secondario diluire da uno a 5.000 Alexa Fluor anti-capra immunoglobulina G nella soluzione di blocco. Aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.Lavare la piastra cinque volte con PBS-polisorbato filtrato. Per contare le placche con un lettore di spot automatizzato, utilizzare prima una piastra di coltura inutilizzata da 96 pozzi per collaborare allo strumento inserendo le impostazioni di conteggio nel canale FITC. Quindi leggere la piastra cellulare, avvolgerla in un foglio e conservarla a quattro gradi Celsius.Quindi, controlla le immagini dei pozzi alla ricerca di placche artefatto o monostrati cellulari interrotti ed escludi i pozzi con monostrati cellulari interrotti. Il numero medio di placche dei pozzi di controllo senza siero è stato calcolato e utilizzato per determinare il taglio di neutralizzazione del 50% che avrebbe determinato un'inibizione del 50% dell'attività del virus. La diluizione reciproca del siero è stata tracciata sull'asse x e il numero di placche sull'asse y di un grafico semi-log da una linea tracciata tra i due punti.I titoli di neutralizzazione del 50% dei campioni di siero di prova erano diluizioni rosse e siere con conteggi immediatamente superiori o inferiori al valore del 50% dei pozzi di controllo senza siero. I test RSVAPRN in due diverse coorti adulte del Gambia e volontari sani a Melbourne hanno portato gli adulti gambiani ad avere un titolo NAB medio inferiore rispetto agli adulti di Melbourne. Il siero di riferimento RSV umano mostrato dimostra una variabilità molto bassa con il coefficiente di variazione del 6,82%Questo test di neutralizzazione della riduzione della placca RSV ad alta produttività migliorato può essere facilmente implementato in molti laboratori e sosterrà lo sforzo di armonizzazione internazionale dell'OMS per i test anticorpali neutralizzanti RSV.Questo sarà fondamentale per la valutazione dei nuovi candidati al vaccino RSV in futuro.

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Questo protocollo descrive una procedura generale per lo studio ricombinante del recettore dominio di legame (RBD) a base di vaccini a subunità contro la SARS. Esso include metodi per la trasfezione ed espressione di proteine ​​nelle cellule 293T RBD, l'immunizzazione di topi con RBD e la rilevazione di attività di neutralizzazione del mouse utilizzando un siero stabilito pseudovirus SARS saggio di neutralizzazione.

Protocollo per ricombinante RBD-based Vaccines SARS: Preparazione di proteine, vaccinazione degli animali e la rivelazione di neutralizzazione

Questo video mostra un test per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro il virus respiratorio sinciziale (RSV). La pre-incubazione con siero contenente anticorpi neutralizzanti l'RSV neutralizza le particelle virali, riducendo l'infezione cellulare e la formazione di placche. Le cellule infettate dal virus vengono quindi sottoposte a fissazione, blocco e marcatura degli anticorpi coniugati con fluorofori per la visualizzazione della placca. Questo processo consente l'identificazione della...

Un test per misurare il titolo anticorpale neutralizzante specifico per il virus respiratorio sinciziale

Il virus respiratorio sinciziale umano (HRSV) può causare grave bronchiolite nei neonati. Parte della patogenesi della malattia grave da HRSV è causata dalla risposta immunitaria dell'ospite. La stimolazione delle cellule immunitarie umane primarie con HRSV fornisce un sistema modello rapido e riproducibile per studiare l'attivazione delle vie infiammatorie e delle infezioni.

Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus respiratorio sinciziale umano

Questo studio descrive un   di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.

Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

Per un'analisi meccanicistica approfondita della sintesi dell'RNA del virus respiratorio sincrezionale (RSV), segnalamo un protocollo di utilizzo della fosfoproteina chaperone (P) per la coespressione della nucleoproteina priva di RNA (N0)per il successivo assemblaggio in vitro dei nucleocapsidi specifici del virus (NC).

Generazione e assemblaggio di nucleocapsidi specifici del virus respiratorio

Il protocollo qui descritto delinea un metodo rapido ed efficace per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro la proteina spike SARS-CoV-2 valutando la capacità dei campioni di siero convalescente di inibire l'infezione da un virus della stomatite vescicolare potenziato con proteina fluorescente verde pseudotipizzato con glicoproteina spike.

Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus

Un sistema di analisi di flusso per saggi multiplexati basati su perle che fornisce una lettura a due reporter è stato utilizzato per lo sviluppo di saggi sierologici multiplex e di neutralizzazione degli anticorpi in grado di misurare contemporaneamente gli anticorpi IgG e IgM neutralizzanti per SARS-CoV-2.

Un test di neutralizzazione rapido e multiplex Dual Reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 per un sistema di analisi del flusso basato su perle multiplexate

Un protocollo di laboratorio completo e un flusso di lavoro di analisi sono descritti per un test colorimetrico basato su cellule rapido, economico e semplice per rilevare elementi neutralizzanti rispetto ad AAV6.

Un metodo passo-passo per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV utilizzando un test colorimetrico basato su cellule

I virus pseudotipizzati (PV) sono virioni difettosi di replicazione che vengono utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus in condizioni più sicure rispetto alla manipolazione di virus autentici. Di seguito è presentato un protocollo dettagliato che mostra come i PV SARS-CoV-2 possono essere utilizzati per testare la capacità neutralizzante del siero dei pazienti dopo la vaccinazione COVID-19.

Virus pseudotipizzati come strumento molecolare per monitorare le risposte immunitarie umorali contro SARS-CoV-2 tramite test di neutralizzazione

Impara un saggio di micro-neutralizzazione ad alta velocità per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo metodo riproducibile utilizza cellule A549 e offre basso costo per laboratori globali.

Un'analisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione

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