Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria
March 14th, 2020
La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.
Lo scopo di questa procedura è quello di avere un modello ex vivo per valutare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumorale-osseo utilizzando la coltura calvaria o la co-coltura con cellule tumorali. La maggior parte della tecnica calvaria è un sistema di coltura di organi che utilizza ossa di calvaria di topi neonatali per valutare il rimodellamento osseo. Si può testare il potenziale terapeutico di diverse molecole, o addirittura ricreare il microambiente osseo-tumorale quando si usano co-colture con cellule tumorali.
Tutto questo in un saggio semplice e facile in breve tempo e a basso costo. Lo scopo di questa tecnica è quello di avere uno strumento per valutare la rigenerazione ossea nel microambiente osseo tumorale, utilizzando un modello ex vivo di coltura dell'organo calvariale del topo. Per prima cosa, seleziona un cucciolo di topo e posizionalo sotto il cofano.
Usiamo calvaria da cuccioli di topo di cinque-sette giorni. Prendi la testa con la siringa, taglia la pelle e libera l'area del cuoio capelluto abbastanza da sezionare la calvaria. Identificare le suture del cranio, sagittale, coronale e lambdoidi.
Fai un taglio dritto lungo le suture lambdoidi, a circa il livello dell'occhio. Tagliare su ciascun lato, dalle suture lambdoidi verso la sutura coronale. Con un angolo di 45, fare un altro taglio per collegare l'estremità del taglio realizzato con il taglio della fontanella anteriore.
È estremamente importante definire le suture cranica, sagittale, frontale, coronale, lambdoide, per garantire la corretta inclusione tissutale e l'analisi istologico. Con punte sottili forza, rimuovere la calvaria e metterla su una copertura della piastra di Petri. Con un bisturi, fai un taglio dritto dalla fontanella posteriore lungo la sutura sagittale attraverso la sutura coronale.
Si ottengono due emicalvarias. Raccogli ogni calvaria con le forcep e mettile in una nuova piastra di Petri con PBS. Per la coltura, posizionare l'emicalvaria in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti, contenente un millilitro di mezzo, e incubare per 24 ore a 37 gradi.
Possiamo anche usare colture calvariali primarie per riprodurre il microambiente tumorale-osseo per il riassorbimento osseo. Per fare questo, co-coltimo le calvarias con cellule tumorali, o con mezzi condizionati da cellule tumorali. 24 ore dopo, rimuovere il supporto e sostituirlo con supporti contenenti il trattamento che si desidera testare.
Se si desidera valutare le cellule tumorali e le interazioni ossee, o ricreare il microambiente tumorale-osseo, passare la calvaria a una piastra di attacco cellulare bassa, per evitare l'attaccamento delle cellule tumorali alla piastra. Tripinare le cellule tumorali, contarle e posizionarle con attenzione nella parte superiore dell'emicalvaria. È inoltre possibile utilizzare supporti condizionali provenienti da cellule tumorali e utilizzarli per incubare l'emicalvaria.
Incubare per sei-sette giorni a 37 gradi, con il 5% di CO2. Il terzo giorno, cambia i media e continua a incubare. Il numero di cellule che usano nella co-coltura dipende dalla linea cellulare del cancro.
È necessario, in primo luogo, ottimizzare il numero di celle necessarie per indurre una risposta in quella. Dopo la cultura, la calvaria passa attraverso un processo di fissazione, decalcificazione e paraffina incorporata. Inoltre, i tessuti sono sessati in un microtomo, macchiato e viene eseguita un'analisi istomorfometrica.
L'inclusione della calvaria può essere complicata. Per assicurarsi che il tessuto sia protetto durante l'inclusione, è possibile mettere il tessuto tra le spugne o utilizzare una carta velina o altra carta assorbente prima di metterlo nella cassetta. Per la lavorazione dei tessuti, avvolgere l'emicalvaria in carta velina.
Quindi, posizionarlo in una cassetta di incorporamento e fissare in buffer neutro in formalina, per 24 ore a quattro gradi. Per decalcificare la calvaria, posizionare la cassetta in un EDTA al 10% per 48 ore a quattro gradi. Elaborare le cassette tissutali con l'emicalvaria in un processore automatico dei tessuti.
Seguire un normale ciclo di rotazione giornaliera, quindi, includere nella paraffina. Per la sessatura, tagliare quattro sezioni microtiche con un microtomo, montare le sezioni su vetrini al microscopio e macchiare con ematossilina, eosina. L'analisi istologia è stata utilizzata per eseguire analisi quantitative della superficie ossea e delle aree di rimodellamento osseo.
Le immagini della calvaria nei sette giorni sono state analizzate utilizzando il software di imaging. Per la valutazione quantitativa, in primo luogo, definire l'area per l'analisi. Guarda nelle sezioni della telopa dove quattro X per identificare l'orientamento e le suture.
Definire la sutura coronale e identificare la lunga superficie ossea su un lato, e quindi la superficie corta dall'altro. Sotto l'ingrandimento 40X, identificare la sutura coronale e spostare due o tre campi ottici lontano dalla sutura, lungo la superficie lunga. Acquisire l'immagine di quest'area per l'analisi.
È possibile utilizzare il software di immagini per analizzare l'integrità strutturale dell'osso. Si può fare un'analisi istomorfometrica quantitativa per lo spessore e l'area ossea dell'emicalvaria. La corretta analisi della calvaria dipende da un buon incorporamento e da un corretto orientamento per risultati istologici coerenti.
Assicurati di usare almeno tre calvaria per condizione sperimentale. Qui, possiamo vedere la struttura dell'osso. In arancione, si osserva l'osso.
Possiamo anche vedere la presenza del periostio, dell'ostocita, dell'endosteo e di altre parti dell'osso. Nel nostro caso, usiamo l'insulina per aumentare il rimodellamento osseo. Rispetto a un controllo, possiamo vedere un aumento significativo dell'area ossea.
Qui, possiamo vedere l'effetto della linea cellulare MDA-MB-231 sul modello calvaria. Possiamo vedere, rispetto al controllo, che la presenza di cellule tumorali induce fattori osteolitici che stimolano la distruzione ossea. Abbiamo usato il modello calvaria per misurare la rigenerazione ossea e le interazioni cellule-ossa tumorali attraverso co-colture con cellule tumorali e istologia.
Convalidiamo anche i nostri dati tramite PCR quantitativa in tempo reale. Questo modello ex vivo ha molti vantaggi, come l'organizzazione tridimensionale e la diversità cellulare dell'osso sono preservati, e le condizioni sperimentali possono essere controllate. Inoltre, il modello è semplice, puoi vedere i risultati in un breve periodo di tempo ed è a basso costo.
E può essere combinato con altre tecniche, come PCR quantitativa in tempo reale, microscopia e micro-TC.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la coltura ex vivo di calvaria di topi neonati, volto a studiare la fisiologia ossea e valutare gli effetti dei farmaci sul rimodellamento osseo. La tecnica permette la ricreazione del microambiente tumore-osso.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Fisiologia ossea
- Rimodellamento osseo
- Biologia del cancro
Contesto
- Gli espianti ossei possono essere coltivati per studiare i processi fisiologici.
- Le calvarie di topi neonatali servono come modello per gli studi ossei.
- La co-coltura con cellule tumorali può imitare il microambiente tumore-osso.
- Questo metodo è economico e semplice.
Obiettivo dello studio
- Valutare il rimodellamento osseo in un modello ex vivo.
- Valutare il potenziale terapeutico di varie molecole.
- Ricreare il microambiente osso-tumore.
Metodi utilizzati
- Isolamento delle calvarie da topi neonati.
- Tecniche di coltura ex vivo per gli espianti ossei.
- Sistemi di co-coltura con cellule tumorali.
- Valutazione della rigenerazione ossea e degli effetti dei farmaci.
Principali risultati
- Coltura di successo della calvaria per studiare il rimodellamento osseo.
- Capacità di testare agenti terapeutici in un ambiente controllato.
- Ricreazione del microambiente tumore-osso dimostrata.
- Metodo dimostrato essere efficiente e a basso costo.
Conclusioni
- La coltura ex vivo della calvaria è uno strumento prezioso per la ricerca ossea.
- Facilita lo studio degli effetti dei farmaci sulla fisiologia ossea.
- I sistemi di co-coltura migliorano la comprensione delle interazioni del cancro con l'osso.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
