Name: Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Scopri come sintetizzare una nanoemulsione di acido oleico coniugato al platino stabilizzata con il tripeptide KYF per applicazioni farmaceutiche e terapie anti-cancerose.

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Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dal National Cancer Institute, concedere SC2CA206194. Concorrenti interessi finanziari non vengono dichiarati.

1. sintesi del coniugato acido oleico Acids–Platinum(II)
<ol><li>Attivazione di cisplatino<ol>
<li>Sospendere 50 mg (0.167 mmol) di cisplatino in 4 mL di acqua (ad es., nanopure) a 60 ° C.</li>
		<li>Aggiungere goccia a goccia 55,2 mg (0.325 mmol) di AgNO3 in 0,5 mL di acqua per la soluzione di cisplatino e mescolare la reazione per almeno 2 h a 60 ° C. Il precipitato bianco di AgCl formerà che indica l'avanzamento della reazione.</li>
		<li>Per determinare se la reazione di attivazione è stata completata, eseguire il test con 10% HCl per la presenza dello ione di Ag+ libero in soluzione. Il test dovrebbe essere negativo (nessun precipitato di AgCl ulteriore dovrebbe formare).</li>
		<li>Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 x g per 10 min e rimuovere il precipitato bianco di AgCl.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro di siringa di 0,2 mm. Testare il surnatante per la presenza di platino applicando 2-3 gocce della soluzione tramite pipetta Pasteur a SnCl2 cristalli. Il test è positivo se il colore del complesso delle coordinate di stagno con platino è giallo/arancione scuro.</li>
		<li>Utilizzare il surnatante con PT attivato per il secondo passaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reazione dell'acido oleico con PT attivato<ol>
<li>Sospendere 94,2 mg di acido oleico (0.333 mmol) in 3 mL di acqua a 60 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 13,3 mg (0.333 mmol) di NaOH in 1 mL di acqua e mescolare con la soluzione di PT attivato dal passaggio 1.1</li>
		<li>Mescolare la reazione per 2 h a 60 ° C e successivamente a temperatura ambiente durante la notte. Il prodotto grezzo è un precipitato oleoso di giallo/marrone.</li>
		<li>Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 x g per 10 min e rimuovere il surnatante. Asciugare il prodotto grezzo a 25 ° C, utilizzando un evaporatore rotante. Purificare il prodotto di diversi lavaggi con acetonitrile. Il colore finale di acids–Pt(II) acido oleico puro coniugato è giallo pallido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sintesi di KYF-Pt-NE e la FITC-labeled Nanoemulsione FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>Sintesi del tripeptide KYF e il tripeptide fluorescente contrassegnati FITC-KYF<ol>
<li>Sintetizzare il KYF utilizzando chimica standard del peptide a stato solido. Utilizzare il seguente standard condizioni di accoppiamento per collegare ogni amminoacido: Wang resina (2,19 mmol), Fmoc protetto amminoacido (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 mmol) e diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Sciogliere gli aminoacidi con TBTU in dimetilformammide (DMF) e DIPEA.</li>
		<li>Immergere 5,7 g di resina di Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol (0,382 meq/g) in 25 mL di DMF per 1 h prima dell'uso.</li>
		<li>DEPROTECT il gruppo amminico dell'aminoacido L-fenilalanina con 15 mL di soluzione al 20% piperidina/DMF per 5 min, scartare il solvente e ripetere il lavaggio con ciclo di 20 min.</li>
		<li>Lavare la resina per 1 min con i seguenti solventi: DMF, alcool isopropilico (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Eliminare il solvente dopo ogni lavaggio.</li>
		<li>Eseguire il test di Kaiser per determinare la presenza di gruppo di2 NH libero sulla resina (Vedi passaggi secondari) e se positivo (il seme di resina è viola), aggiungere l'aminoacido Fmoc-L-tirosina ed eseguire l'accoppiamento durante la notte.<ol>
<li>Preparare Kaiser soluzioni di test in bottiglie separate.</li>
			<li>Sciogliere 5 g di ninidrina in 100 mL di etanolo.</li>
			<li>Sciogliere 80 g di fenolo in 20 mL di etanolo.</li>
			<li>Mescolare 2 mL di soluzione acquosa 0,001 M di cianuro di potassio con 98 mL di piridina.</li>
			<li>Aggiungere 2-3 gocce di ogni Kaiser testare soluzioni campione e calore in acqua bollente per 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>All'accoppiamento riuscito del secondo amminoacido, eseguire il test di Kaiser e se negativo procede con protocollo deprotezione (passaggi 2.1.3 per 2.1.5). Ripetere il processo con l'aminoacido Fmoc-fenilalanina.<ol>
<li>Al accoppiamento di tutti gli aminoacidi, lavare la resina per 1 min con 5 mL di DMF, IPA, DMF, metanolo, diclorometano ed etere etilico, dopo ogni lavaggio scartare il solvente. Salvare la resina per l'ulteriore elaborazione.</li>
			<li>Utilizzare la metà della resina per i passaggi successivi (2.1.7-2.1.9) per modificare il peptide con FITC. Per ottenere non modificato KYF tripeptide, seguire la procedura a partire da 2.1.10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Modificare l'amminoacido N-terminale di KYF KYF-N3 con acido 6-azidohexanoic. A tal fine, mescolare 1 g (0,382 mmol) di KYF Wang resina e 120,1 mg (0.764 mmol) di acido 6-azidohexanoic con 245,2 mg (0.764 mmol) di TBTU e mg 197,1 (1.528 mmol) di DIPEA in 30 mL di DMF. Mescolare la reazione durante la notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ottenere il KYF-FITC dalla sintesi di KYF-N3 con fluoresceina propargile tramite una reazione di clic. A tal fine, è necessario mescolare 253 mg (0.097 mmol) di KYF-N3 Wang resina con 3,78 mg (0,019 mmol) di CuI tinta, 71,9 mg (0.193 mmol) di fluorescina propargile e 2,24 mg (0,017 mmol) di DIPEA. La reazione dovrebbe cambiare colore da verde a marrone.</li>
		<li>Dopo 24 h, lavare la resina per 1 min in alternanza con 5 mL di DMF e IPA cinque volte, acqua tre volte, DMF, metanolo e acqua tre volte e con diclorometano ed etere etilico tre volte. Eliminare il solvente dopo ogni lavaggio.</li>
		<li>Fendere il KYF-FITC o KYF peptide dalla resina con una soluzione di acido trifluoroacetico (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) / h2O al rapporto di 95/2.5/2.5 oltre 3 ore.</li>
		<li>Precipitare il peptide grezzo in un freddo etere etilico, lavare tre volte con etere freddo e quindi asciugare sotto il vuoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintesi di Nanoemulsione FITC-KYF-stabilizzato con PT (FITC-KYF-Pt-NE) e KYF-Pt-NE<ol>
<li>Sciogliere 10 mg (0.0126 mmol) di acido oleico acids–Pt(II) coniugato in 1,5 mL di isopropanolo e posto in una siringa da 5 mL.</li>
		<li>Inserire la siringa con acido oleico acids–Pt(II) coniugato in una pompa a siringa e impostare il flusso a 0,1 mL/min.</li>
		<li>Al fine di sintetizzare la FITC-KYF-Pt-NE, sciogliere 1 mg (0.00105 mmol) di FITC-KYF e 1 mg (0.00219 mmol) di KYF (rapporto molare 1:2 di FITC-KYF:KYF) in 20 mL di acqua e regolare la temperatura della soluzione a 37 ° C. Ricoprono le pareti del contenitore con carta stagnola per evitare photobleaching del fluoroforo FITC. Per sintetizzare il KYF-Pt-NE, sciogliere 2 mg (0.0044 mmol) di tripeptide KYF in 20 mL di acqua e regolare la temperatura della soluzione a 37 ° C.</li>
		<li>Aggiungere il coniugato acido oleico acids–Pt(II) goccia a goccia la soluzione di FITC-KYF/KYF o KYF tripeptide. Eseguire questo passaggio sotto il cofano.</li>
		<li>Agitare la soluzione durante la notte a temperatura ambiente per far evaporare i solventi organici e per consentire l'auto-assemblaggio di FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-Nefi</li>
		<li>Concentrare la FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-NE in un concentratore centrifugo (10K MWCO) e lavare tre volte con 4 mL di acqua nanopure.</li>
		<li>Memorizzare le soluzioni acquose di KYF-Pt-NE e FITC-KYF-Pt-NE a 4 ° C.</li>
		<li>Analizzare per platino contenuto mediante spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), seguito guida48 del produttore.<ol>
<li>Preparare gli standard platino in soluzione di HCl 10% per la curva di taratura (gamma efficace per AAS è tra 100 a 1.200 ppb (parti per miliardo)).</li>
			<li>Sciogliere 50 µ l di soluzione di KYF-Pt-NE da passo 2.2 in 100 µ l di acqua regia (una miscela 3:1 di acido cloridrico concentrato e acido nitrico) e lasciare a temperatura ambiente per una notte. Aggiungere 850 µ l di acqua per raggiungere un volume di campione finale di 1 mL. Analizzare il campione utilizzando AAS. La concentrazione di acido finale dovrebbe essere il 10% in tutti i campioni analizzati.</li>
			<li>Registrare la lettura della concentrazione di Pt in ppb e calcolare il contenuto di platino finale del campione (l'account per la diluizione del campione e volume iniziale di Nanoemulsione).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. confocale Imaging di assorbimento cellulare di FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>6 linee cellulari di cancro ovarico (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G ed ES2), di semi in 4 piatti confocale pozzo-camera alla densità di 4.7 x 104 cellule per camera e pre-cultura durante la notte a 37 ° C.</li>
	<li>Dopo 24 h, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tampone fosfato (PBS) e incubare con FITC-KYF-Pt-NE nel mezzo di coltura cellulare (Vedi punto 6.1 per cella linea dettagli specifici) per 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte con PBS.</li>
	<li>Fissare le cellule con metanolo freddo per 5 min a-20 ° C e lavare tre volte con 1 mL di PBS.</li>
	<li>Permeabilize le cellule con 1 mL di 0.1% Triton-X per 10 min a temperatura ambiente e lavare tre volte con 1 mL di PBS.</li>
	<li>Incubare le cellule per 90 min con LAMP1 anticorpo coniugato con Alexa Fluor 647 (1 mL) alle 01:50 diluizione in PBS a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule 3 volte con PBS.</li>
	<li>Diluire la soluzione di riserva DAPI (1 mg/mL) a 1 mg/mL in PBS. Aggiungere 1 mL della soluzione diluita per ogni camera, quindi incubare per 15 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 3 volte con PBS.</li>
	<li>Montare le lamelle su una diapositiva utilizzando il mezzo di montaggio.</li>
	<li>Immagine le celle utilizzando il microscopio confocale cellule vive a lunghezza d'onda di eccitazione di 405 nm, 488 nm e 633 nm. Impostare i parametri di rilevamento come segue: potere del laser da 0,2% e non più di 1%, Pinole 1 ariose unità, guadagno master 650-750, offset digitale 0.</li>
	<li>Aprire l'immagine nel software di imaging. In immagine visualizzata, selezionare grafica e selezionare Inserisci barra della scala, inserire la barra di scala per l'immagine.</li>
</ol>4. drug Release studi
<ol><li>Effettuare gli studi di rilascio del farmaco in PBS. Regolare i valori di pH di tre buffer di PBS a 7,4, 6.8 e 5.0 rispettivamente.</li>
	<li>Diluire 5 μL di KYF-Pt-NE in 180 μL di tampone PBS pH appropriato, trasferimento a 3,5 tazza di dialisi mini MWCO kDa e incubare a 37 ° C in PBS.</li>
	<li>Rimuovere il tampone da ogni tre tubi di dialisi mini a 2, 4, 6, 24, 48 e 140 h e misurare le concentrazioni di platino di AAS. Preparare tutti i campioni secondo passo 2.2.8 ma regolare il volume finale del campione a 500 µ l.</li>
</ol>5. metodi di coltura cellulare
<ol><li>Linee cellulari di cultura A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 nel medium di coltura cellulare (DMEM) completati con 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) o con 15% (TOV - 21G, OV-90) siero bovino fetale (FBS), con L-Glutammina e penicillina/streptomicina. Crescere in tutte le cellule in un 5% di CO2, atmosfera satura di acqua a 37 ° C.</li>
	<li>Cellule di seme 3 x 105 in ogni piastra a 96 pozzetti e pre-cultura durante la notte per gli esperimenti in vitro di incubazione. Preparare le soluzioni KYF-Pt-NE, cisplatino e carboplatino in acqua. Regolare la concentrazione di PT in KYF-Pt-NE per abbinare la concentrazione di carboplatino e cisplatino per ogni linea cellulare. Incubare per 72 ore a 37 ° C.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, valutare la vitalità cellulare utilizzando un saggio colorimetrico (il saggio di proliferazione delle cellule di MTT). Brevemente, rimuovere il mezzo e aggiungere 110 μL di 10% MTT in mezzo ad ogni pozzetto ed incubare per 2 ore a 37 ° C. Quindi aggiungere detersivo di 100 μL in ogni pozzetto e incubare per 5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Verifica l'assorbanza a 570 nm utilizzando il lettore di piastre. Analizzare i risultati usando l'analisi statistica con Z-test e P-test.</li>
</ol>

Gli autori non hanno un conflitto di interessi di divulgare.

Fasi critiche nella sintesi Nanoemulsione includono il rapporto molare dei substrati di regolazione, mantenendo il controllo di tasso di flusso e temperatura durante l'aggiunta di acido oleico acids–Pt(II), fornire tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e purificare il prodotto utilizzando un colonna di concentratore centrifugo. Questi parametri influenzano le dimensioni e la morfologia di KYF-Pt-NE; Pertanto, è particolarmente importante mantenere il corretto rapporto molare e regolare correttamente le condizioni sin...

Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'ingegneria di nanoparticelle per applicazioni biomedicali come consegna della droga e bioimmagini1,2,3,4. La multifunzionalità dei sistemi basati su nanoparticelle richiede spesso incorporando più componenti all'interno di una formulazione. I mattoni che si basano sui lipidi o polimeri spesso differiscono in termini di loro proprietà fisico-chimiche nonché loro biocompatibilità e biodegradabilità, che alla fine potrebbe influenzare la funzione della nanostruttura1, 5,6. Materiali biologicamente derivate, quali proteine e peptidi, hanno da tempo riconosciute come promettente componenti di nanostrutture multifunzionale a causa della loro sequenza flessibilità7,8. Peptidi assemblarsi in architetture supramolecolari altamente ordinate formando elicoidale nastri9,10, impalcature fibroso11,12e molti altri, aprendo così la strada alla costruzione nanostrutture ibride basate su biomolecole utilizzando un ascendente approccio13.
Peptidi sono stati esplorati per applicazioni in medicina e biotecnologia, soprattutto per la terapia anticancro14 e malattie cardiovascolari15 anche per quanto riguarda lo sviluppo antibiotico16,17, metabolica disturbi18e infezioni19. Ci sono oltre un centinaio di piccole-peptide terapeutica in fase di test clinici20. Peptidi sono facili da modificare e veloce di sintetizzare a basso costo. Inoltre, sono biodegradabili, che facilita notevolmente il loro applicazioni biologiche e farmaceutiche21,22. L'utilizzo di peptidi come componenti strutturali comprende l'ingegneria di nanoparticelle reattive, peptidici e idrogel depositi per rilascio controllato23,24,25,26 , 27, biosensori peptidici28,29,30,31o dispositivi bio-elettroniche32,33,34. Cosa importante, sono stati trovati anche brevi peptidi con due o tre residui dell'amminoacido che includono fenilalanina per guidare l'auto-assemblaggio elabora35,36,37 e creare emulsioni stabilizzate38 .
Farmaci a base di platino, a causa della loro alta efficacia, sono utilizzati in molti regimi di trattamento del cancro, sia da solo che in combinazione con altri agenti39,40. Composti del platino inducono danni al DNA formando legami incrociati monoadducts e intrastrand o interstrand. Le lesioni di Pt-DNA sono riconosciute dal macchinario cellulare e, se non riparato, portano all'apoptosi cellulare. Il meccanismo più importante, che contribuisce alla morte della cellula tumorale, PT è l'inibizione della trascrizione del DNA41,42. Tuttavia, i benefici della terapia di platino sono diminuiti di tossicità sistemica di PT che provoca gravi effetti collaterali. Questo porta a più basso dosaggio clinica di PT43, che si traduce spesso in concentrazioni sub-terapeutiche di platino raggiungendo il DNA. Di conseguenza, la riparazione del DNA che segue contribuisce alla sopravvivenza della cellula tumorale e l'acquisizione di resistenza Pt. La chemio-resistenza del platino è un problema importante nella terapia anticancro e la causa principale del trattamento fallimento44,45.
Abbiamo sviluppato una stabile irraggiungibili che incapsula l'agente PT al fine di fornire un effetto di schermatura nella circolazione sistemica e per diminuire gli effetti collaterali indotti da Pt II. Il sistema si basa su un nucleo di acido oleico acids-Pt(II) stabilizzato con un tripeptide KYF per formare una Nanoemulsione (KYF-Pt-NE)46. Gli elementi costitutivi di KYF-Pt-NE, gli aminoacidi del tripeptide, come pure l'acido oleico, hanno lo status di generalmente riconosciuti come sicuri (GRAS) con la Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE viene preparato utilizzando un metodo di nanoprecipitazione47. In breve, il coniugato acids-Pt(II) oleico è disciolto in un solvente organico e quindi aggiunto goccia a goccia di una soluzione acquosa di KYF (Figura 1) a 37 ° C. La soluzione è agitata per diverse ore consentire l'auto-assemblaggio di KYF-Pt-NE. La Nanoemulsione è concentrata in 10 kDa concentratori centrifughi e lavati tre volte con acqua. La modificazione chimica di KYF con un fluoroforo permette la sintesi di fluorescente FITC-KYF-Pt-NE adatto per imaging biomedico.

<table><tbody><tr><td>2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU)</td><td>ANASPEC INC.:</td><td>AS-20376</td><td></td></tr><tr><td>Piatto confocale a camera a 4 pozzetti</td> SPPS <td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526</td><td></td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>dell'acido 6-bromoesanoico</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>24477</td><td>Modifica a scatto per il peptide</td></tr><tr><td>A2780</td><td>Generosamente curato dal professor John Martignetti del Mount Sinai Hospital</td><td></td><td>Linea cellulare per il cancro ovarico</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure</td><td>Thermo Fisher</td><td>D11901</td><td>sistema di filtrazione dell'acqua</td></tr><tr><td>BUCHI rotavapor R-3</td><td>Buchi</td><td>Z568090</td><td>Per la rimozione del solvente e l'essiccazione del campione</td></tr><tr><td>Centrifuga 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811F</td><td>Per la separazione del complesso di platino</td></tr><tr><td>Cis-diclorodiammina platino (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>test in vitro</td></tr><tr><td>CP70</td><td>Generosamente curato dal professor John Martignetti del Mount Sinai Hospital</td><td></td><td>Linea cellulare per il cancro ovarico</td></tr> Bagno <tr><td>d'acqua digitale</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>Per il riscaldamento di terreni per colture cellulari</td></tr><tr><td>Diffusione dinamica della luce (DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>Per le misure delle dimensioni delle nanoparticelle</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>linea cellulare di cancro ovarico</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys (Boc) -OH 99,79%</td> <td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe Resina di alcool 4-alcossibenzilico (0,382 meq/g),</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>HERACELL 150i Incubatore a CO2</td><td>Thermo Scientific Incubatore Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa ad alta pressione</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>Per l'aggiunta di complessi di platino nella sintesi di nanoparticelle</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante/agitatore</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Per l'agitazione e il riscaldamento</td></tr> <tr><td>del campioneAnticorpo LAMP-1 (coniugato con Alexa Fluor 647)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>Per imaging</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilammina (DIPEA)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>005027</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Ninidrina 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10409</td><td>Kaiser test</td></tr><tr><td>Acido</td><td>oleico Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01421</td><td>Per la sintesi del complesso di platino</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>Linea cellulare di carcinoma ovarico</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Per il lavaggio cellulare</td></tr><tr><td>Terreno di montaggio Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Test Kaiser</td></tr><tr><td>Acido fosfotungstico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A248-25</td><td>colorante negativo per TEM</td></tr><tr><td>Piperidina 99%</td><td>BTC</td><td>219260-2.5L</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Platinum AAS standard soultion</td><td>Alfa Aesar</td><td>88086</td><td>1000ug/ml per curva</td></tr><tr><td>di calibrazione Propargyl bromuro 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>Per la modifica alchino della fluoresceina</td></tr><tr><td>Cabina biologica scientifica</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Bio-hood per coltura cellulare</td></tr><tr><td>Sistema per vuoto autopulente</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>Pompa per vuoto rotavapor</td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>Attivazione del cisplatino</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Linea cellulare di cancro ovarico</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>Per la sintesi del complesso di platino</td></tr><tr><td>Cloruro</td> <td>di stagno (II)Sigma Aldrich</td><td></td><td>208256 Test per la presenza di platino</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>Linea cellulare di cancro ovarico</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico 99% (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano (TIPS)</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Per l'imaging</td></tr><tr><td>Polvere di uranina 40%</td><td>Fisher Scientific S25328A</td><td></td><td>Per la modifica alchinica della fluoresceina</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td><td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>Per il lavaggio e la condensazione delle nanoparticelle</td></tr><tr><td>VWR Microscopio invertito VWR</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>Per il monitoraggio delle colture cellulari</td></tr></tbody></table>

nanoemulsione tripeptide-stabilizzato di acido oleico

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Descriviamo un metodo per produrre una Nanoemulsione composto da un nucleo di acids-Pt(II) acido oleico e un rivestimento (KYF) di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE incapsula PT al 10% in peso, ha un diametro di 107 ± 27 nm e una carica negativa di superficie. KYF-Pt-NE è stabile in acqua e in siero ed è biologicamente attivo. La coniugazione di un fluoroforo di KYF permette la sintesi di una Nanoemulsione fluorescente che è adatto per l'imaging biologico. La sintesi del Nanoemulsione viene eseguita in un ambiente acquoso e le forme di KYF-Pt-NE via auto-assemblaggio di un peptide KYF breve e un coniugato acido oleico acids-platinum(II). L'auto-assemblaggio processo dipende la temperatura della soluzione, il rapporto molare dei substrati e la portata dell'aggiunta del substrato. Passi fondamentali includono mantenendo il tasso ottimale di agitazione durante la sintesi, permettendo un tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e pre-concentrando la Nanoemulsione gradualmente in un concentratore centrifugo.

Immagine rappresentante TEM di KYF-Pt-NE preparato usando questo protocollo è mostrato nella Figura 2A. KYF-Pt-NEs sono sferici in morfologia, ben dispersero e di dimensioni uniformi. Il diametro del nucleo di KYF-Pt-NEs, misurata direttamente da tre immagini TEM con un minimo di 200 misure effettuate, è 107 ± 27 nm. Il diametro idrodinamico di KYF-Pt-NE, analizzato usando la spettroscopia luce dinamica (DLS), è stato trovato per essere 240 nm con un indice d...

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per sintetizzare una Nanoemulsione di un coniugato acido oleico acids-platinum(II) stabilizzato con un tripeptide di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Le forme di Nanoemulsione in condizioni blande sintetiche tramite auto-assemblaggio del KYF e il coniugato.

Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Data l'ampia gamma di brevi sequenze peptidiche, questo metodo può essere esteso a molti altri progetti di nanoparticelle. La modifica peptidica può rendere il sistema adatto a scopi diagnostici. L'incapsulamento del platino anti-cancro in farmaci con agente stabilizzante biodegradabile a bassa tossicità è altamente rilevante per le applicazioni farmaceutiche.Gli studi preliminari in vivo con cancro alle ovaie sono promettenti e saranno ulteriormente studiati. Per iniziare, sospendere 50 milligrammi di cisplatino in quattro millilitri di acqua ultra pura a 60 gradi Celsius. Aggiungere la soluzione di nitrato d'argento per quanto riguarda la goccia alla soluzione di cisplatino e mescolare la miscela a 300-400 giri/min per due ore a 60 gradi Celsius al buio.Successivamente, utilizzare il 10% in peso acido cloridrico per confermare che non ci sono ioni d'argento liberi in soluzione. Se non si forma cloruro d'argento aggiuntivo all'aggiunta di acido cloridrico, centrifugare la miscela a 3.220 volte la gravità per 10 minuti. Decantare il supernatante e filtrarlo attraverso un filtro siringa da 0,2 micrometri.Quindi, testare il filtrato per il platino applicando da due a tre gocce a 10 due cristalli di cloruro. Il platino è presente se la sospensione diventa marrone scuro o arancione. Successivamente, aggiungere 13,3 milligrammi di idrossido di sodio in un millilitro d'acqua in sospensione di 94,2 milligrammi di acido oleico in tre millilitri di acqua a 60 gradi Celsius.Mescolare la miscela per due ore a 60 gradi Celsius. Quindi, spegnere il fuoco e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 16-24 ore per ottenere il prodotto grezzo come precipitante oleoso giallo-marrone. Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 volte la gravità per 10 minuti e rimuovere il supernatante.Asciugare i prodotti su un evaporatore rotativo a 25 gradi Celsius. Sospendere il prodotto grezzo in cinque millilitri di acetonitrile vortice e recuperando il prodotto mediante centrifugazione. Ripetere questo processo di lavaggio almeno altre due tre volte per ottenere il coniugato puro di acido oleico platino II come solido giallo pallido.In primo luogo, immergere 5,7 grammi di resina Wang funzionalizzata A L-fenilalanina protetta da Fmoc in 25 millilitri di dimetilformamide per un'ora. Quindi, immergere la resina in 15 millilitri di piperidina al 20% in DMF per cinque minuti mentre si trema a 80 giri/min per de-proteggere l'ammina. Scolare la resina e ripetere la deprotezione per 20 minuti.Lavare la resina con DMF e alcol isopropile in seguito. Una volta confermata la deprotezione, aggiungere L-tirosina TBTU e DIPEA protetti da Fmoc e agitare la miscela per 16-24 ore per eseguire l'accoppiamento. Lavare la resina con DMF e alcol isopropile.Eseguire il test Kaiser e continuare con la protezione e il lavaggio come descritto in precedenza. Coppia e de-proteggere Fmoc protetto lisina allo stesso modo. Lavare la resina con DMF, IPA, metanolo, diclorometano e etere dietile in seguito.Mettere da parte un grammo di resina portante KYF per la modifica FITC. Immergere la resina rimanente in acido trifluoroacetico al 95%. 2,5% di triisopropilsilano e 2,5% di acqua per tre ore per scindere il tripeptide dalla resina.Precipitare il peptide grezzo con etere dietile raffreddato a 20 gradi Celsius. Lavare il precipitato tre volte con centrifugazione in porzioni da 30 a 40 millilitri di etere dietile freddo e asciugarlo sotto vuoto. Quindi, mescolare il grammo rimanente di resina KYF con 120,1 milligrammi di acido 6-acetoesanoico in 30 millilitri di DMF con TBTU e DIPEA.Agitare la miscela per 16-24 ore a temperatura ambiente per ottenere il tripeptide modificato azide. Quindi, combinare 253 milligrammi di questa resina con 3,78 milligrammi di rame solido(I)ioduro 71,9 milligrammi di propargil florisean e 2,24 milligrammi di DIPEA. Lasciare reagire la miscela tremando per 24 ore.Quindi, lavare accuratamente la resina portante KYF modificata FITC. Scindere il KYF modificato FITC dalla resina e purificarlo allo stesso modo del tripeptide non modificato. Per iniziare a preparare la nanoemoulsione, sciogliere 10 milligrammi dell'acido oleico platino II coniugato in 1,5 millilitri di IPA.Disegna questa soluzione in una siringa da 5 millilitri, attacca un ago calibro 20 e monta la siringa su una pompa per siringhe sopra l'area di reazione. Impostare la pompa della siringa su 0,1 millilitri al minuto. Per una nanoemulsione con KYF modificato FITC, sciogliere un milligrammo di KYF modificato FITC e un milligrammo di KYF non modificato in 20 millilitri di acqua.Per una nanoemulsione con KYF non modificato, sciogliere invece due milligrammi di KYF in 20 millilitri di acqua. Riscaldare la soluzione KYF modificata o non modificata FITC a 37 gradi Celsius. Assicurarsi che la soluzione KYF si mescola a circa 400 giri/min e che la siringa sia allineata alla soluzione.Quindi, avviare la pompa della siringa per iniziare ad aggiungere l'acido oleico platino due coniugati goccia saggio. Una volta aggiunto il coniugato, ridurre la velocità di agitazione a 150 giri/min e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Continuare a mescolarlo per 16-24 ore.Quindi, concentrare la nanoemulzione in un'unità filtrante centrifuga da 10.000 Dalton. Lavare la nanoemulsione in un'unità filtrante centrifuga tre volte con quattro porzioni milliliter di acqua ultrapura. E poi conservarlo come una soluzione acquosa a quattro gradi Celsius.Il prodotto finale è opalescente per le nanoparticelle KYF e fluorescente per nanoparticelle modificate fitc. Le goccioline in una nanoemulsione preparata con KYF non modificato erano sferiche, ben disperse e di dimensioni relativamente uniformi. Basati su immagini di microscopia elettronica a trasmissione, i nuclei avevano un diametro di circa 107 nanometri.La nanoemulsione modificata dal FITC, che appare qui in verde, potrebbe entrare nelle cellule di varie linee cellulari tumorali ovariane. Mentre il diametro idrodinamico di entrambe le formulazioni è aumentato durante quattro mesi di stoccaggio in acqua, le dimensioni complessive sono state preservate. Inoltre, dopo una giornata di incubazione nel siero bovino fetale non è stata osservata alcuna opsonizzazione dell'emulsione.Il rilascio di platino dall'emulsione è stato più lento a pH 7.4 con solo il 20,8% del platino rilasciato dopo quattro ore. Il rilascio di platino accelerò con la diminuzione del pH. La nanoemulsione rivestita di KYF contenente platino ha ridotto la vitalità di queste linee cellulari tumorali ovariane in misura molto maggiore di quella raggiunta dal carboplatino, l'analogo clinicamente rilevante.La nanoemulsione ha anche mostrato una riduzione di vitalità paragonabile o maggiore rispetto alla cisplatino in cinque delle sei linee cellulari. La nanoemulsione rivestita di KYF ha costantemente indotto una riduzione di vitalità paragonabile o maggiore rispetto al solo coniugato di platino II dell'acido oleico. Questo è un metodo semplice ed efficiente per incapsulare le terapie idrofobiche all'interno dell'impalcatura della nanoparticella di base tripeptide.I peptidi corti sono biodegradabili e hanno una bassa tossicità, che è significativa per la medicina e la biotecnologia. Eseguire questa procedura sotto la cappa dei fumi per evitare l'esposizione a solventi organici. L'acido oleico di platino e le nanoemulsioni di platino KYF hanno proprietà anti-cancro e quindi devono essere maneggiate con particolare cura.Questo metodo è semplice in termini di bassa attività filabilator e attrezzature, tuttavia si basa sulla corretta applicazione della strategia di sintesi e dei concetti chimici sottostanti. Il nostro metodo può essere esteso per fornire altre piccole molecole di farmaci. Il nucleo della nanoparticella è costituito da acido oleico e quindi è adatto per l'incapsulamento di agenti idrofobici.

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Phase-shift nanoemulsioni (PSNE) può essere vaporizzato con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità per migliorare il riscaldamento localizzato e migliorare la termoablazione nei tumori. In questa relazione, la preparazione di PSNE stabile con una distribuzione di dimensione stretta è descritto. Inoltre, l'impatto di PSNE vaporizzato su ultrasuoni-mediata ablazione è in tessuti che imitano fantasmi.

Sintesi di fase-shift nanoemulsioni con distribuzioni di dimensioni strette per vaporizzazione Droplet acustico e Bubble-enhanced Ultrasound-mediata Ablazione

Descriviamo la produzione e la caratterizzazione di nanoparticelle e microparticelle composte da acido poli(lattico-co-glicolico) utilizzando la vitamina E-TPGS come emulsionante. Variando i parametri di formulazione come la concentrazione dell'emulsionante, è possibile produrre nanoparticelle con diametri medi che vanno da 220 nm a 1,98 μm.

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Sono descritte le fasi cruciali di polimerizzazione anionica vivente di etere fenil glicidil (PheGE) di glicole metossi-polietilene (MPEG-b -PPheGE). Le micelle copolimero a blocchi risultanti (BCMS) sono stati caricati con doxorubicina 14% (% in peso) e rilascio prolungato di farmaci oltre 4 giorni sotto fisiologicamente è stato ottenuto relative condizioni.

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Per somministrare farmaci antitumorali ai siti tumorali con elevata specificità ed effetti collaterali ridotti, sono necessari nuovi metodi basati su nanoparticelle. Qui, descriviamo micelle reticolate disolfuro che possono essere facilmente preparate mediante ossidazione mediata da perossido di idrogeno e sono in grado di dissociarsi in modo efficiente in un ambiente tumorale riducente per rilasciare carichi utili.

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Liposomi contenenti anfifili catena singola, particolarmente gli acidi grassi, presentano proprietà distinti rispetto a quelli contenenti diacylphospholipids a causa delle proprietà chimiche uniche di singola catena anfifili. Qui descriviamo le tecniche per la preparazione, la purificazione e uso dei liposomi composto in parte o la totalità di questi anfifili.

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Assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo su chip per la bioingegneria

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico (RA) incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Aggiungendo l'artrite reumatoide approvata dalla FDA alla nanoemulsione, le sIgA antigene-specifiche sono state promosse nella vagina e nell'intestino tenue dopo l'iniezione intramuscolare della nanoemulsione.

Acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose specifiche per le OVA

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Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico

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