Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Il nostro metodo aiuta a studiare la cinetica di una formazione complessa proteica. Descrive quanto sia stretto un complesso proteico, e se la formazione del complesso proteico viene interferito da altre proteine. Questa tecnica consente di studiare l'interazione proteina-proteina in modo quantitativo usando la fluorescenza come reporter, il nostro saggio può monitorare l'associazione e la dissociazione di un complesso proteico in tempo reale.

Per iniziare, progettare il test FRET a partire dai dati per il complesso COL1 CAND1 dal database proteico. Caricare la struttura in PyMOL, quindi passare al menu della procedura guidata e utilizzare la funzione di misurazione per stimare la distanza tra il primo amminoacido di CAND1 e l'ultimo amminoacido di COL1. Quindi, caricare lo spettatore di spettri online e visualizzare contemporaneamente gli spettri di eccitazione ed emissione di 7-ammino-4-metilcumarina e FlASH.

AMC è il donatore FRET e FlASH è l'accettore FRET. Preparare le cellule con la proteina donatrice FRET seguendo il protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, purificare il complesso COL1 sortase RBX1 aggiungendo prima 50 millilitri di tampone di lisi a un pellet di cellule E.Coli che esprimono il complesso COL1 sortase RBX1.

Ghiaccio le cellule sul ghiaccio con sonicazione al 50% di ampiezza. Alternare l'alimentazione per tre minuti in modo che sia un secondo su, quindi un secondo di riposo per evitare il surriscaldamento del campione. Trasferire il lysate cellulare risultante in un tubo di centrifugazione da 50 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 25.000 volte g per 45 minuti.

Quindi, aggiungere il supernatante a cinque millilitri di perline di glutatione e incubarli a quattro gradi Celsius per cancellare il lisato cellulare. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela di lisato di perline a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere il supernatante.

Quindi, lavare le perline con 5 millilitri di tampone di lysis senza inibitore della proteasi. Dopo aver centrifugato la soluzione, rimuovere il supernatante. Ora, aggiungere tre millilitri di tampone di lisi alle perline lavate e trasferire il liquame di perline in una colonna vuota.

Alla nuova colonna, aggiungere anche cinque millilitri di tampone di eluizione, quindi incubare la colonna per 10 minuti e raccogliere l'eluito. Quindi, aggiungere 200 microlitri di trombina a cinque milligrammi per millilitro all'eluito dalle perline di glutatione. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius diluire il campione proteico tre volte con tampone A.Caricare il campione proteico in un tampone Una colonna di cromatografia a scambio cationico equilibrato a zero punti cinque millilitri al minuto.

Quindi, aggiungere un gradiente da zero al 50% del tampone B nel tampone A per elutare la proteina con una portata di 1 millilitro al minuto. Successivamente, mettere in comune le frazioni di eluito contenenti la proteina donatrice FRET e concentrarla fino a due punti cinque millilitri utilizzando una membrana di ultrafiltrazione con un cutoff di 30 kilodalton. Ora, aggiungere 7-ammino-4-metilcumarina al c-terminale di COL1 attraverso la transpeptidazione mediata sortase cambiando prima il buffer nel campione di proteina donatrice FRET nel tampone sortase usando una colonna di desalinizzazione.

A tale scopo, equilibrare prima una colonna di desalinizzazione con 25 millilitri di buffer sortase. Quindi, caricare due millilitri punto cinque della soluzione proteica donatrice FRET nella colonna e scartare il flusso attraverso. Successivamente, elutare il campione con tre punti cinque millilitri di tampone sortase e raccogliere il flusso attraverso.

In 900 microlitri dell'eluito aggiungere 100 microlitri di soluzione di sortase purificata micromolare E 10 microlitri di un peptide GGGG-AMC da 25 millimolare. Incubare la miscela di reazione a 30 gradi Celsius al buio durante la notte per generare COL1-AMC-RBX1. A questo punto, caricare tutto il campione nella colonna cromatografia di esclusione delle dimensioni ed eluderlo con un punto cinque volte il volume di colonna del buffer.

Alla fine, raggruppare le frazioni eluate contenenti COL1-AMC-RBX1. Segui il protocollo di testo per preparare la proteina accettore FRET. Molti dei passaggi sono simili alla preparazione delle proteine del donatore FRET.

Una volta terminata, preparare la soluzione FLASH CAND1. In primo luogo, aggiungere un microliter della soluzione FlASH a 50 microlitri della soluzione tetra-cys-CAND1 appena preparata. Mescolare bene le soluzioni combinate e incubare la miscela a temperatura ambiente al buio per una o due ore per formare la soluzione FLASH CAND1.

In 300 microlitri di tampone FRET, aggiungere COL1-AMC-RBX1 ad una concentrazione finale di 70 nanomolare e trasferire la soluzione in una cuvetta. Posizionare la cuvetta nel portacampioni di un fluoriometro. Eccitare il campione con una luce di eccitazione di 350 nanometri e scansionare i segnali di emissione da 400 a 600 nanometri con incrementi di un nanometro.

Quindi, in 300 microlitri di tampone FRET, aggiungere sia COL1-AMC-RBX1 che FlASH-CAND1 a una concentrazione finale di 70 nanomolari. Eccitare il campione con una luce di eccitazione di 350 nanometri e scansionare i segnali di emissione da 400-600 nanometri con incrementi di un nanometro. Impostare la luce di eccitazione a 350 nanometri e utilizzare un filtro passa banda che consente a 450 nanometri di far passare la luce di emissione e blocca la luce di emissione da 500 a 650 nanometri.

Con le valvole campione in posizione di riempimento collegare una siringa da tre millilitri riempita d'acqua. Quindi, lavare le due siringhe campione con acqua spostando l'unità della siringa campione su e giù più volte, scartando l'acqua al termine. Quindi, collegare una siringa da tre millilitri riempita con tampone FRET.

Lavare le due siringhe campione con il tampone FRET spostando più volte l'unità della siringa campione su e giù, scartando l'acqua al termine. Ora, collegare una siringa da tre millilitri e caricare la prima siringa campione, la siringa A, con 100 nanomolari COL1-AMC-RBX1 nel buffer FRET. Quindi ruotare la valvola del campione nella posizione di azionamento Inoltre, collegare una siringa da tre millilitri alla siringa B e caricare la siringa B con 100 nanomolari di FlASH CAND1 nel buffer FRET e ruotare la valvola nella posizione di azionamento.

Aprire il pannello di controllo in fase di acquisizione nel software e registrare l'emissione di COL1-AMC nel corso di 60 secondi. Quindi, fai un solo colpo. Adatta la diminuzione e i segnali fluorescenti misurati nel tempo da ogni colpo a una singola curva esponenziale.

Lavare il sistema come mostrato in precedenza e quindi aggiungere una soluzione di 100 nanomolari COL1-AMC-RBX1 e 100 nanomolare FlASH CAND1 nel tampone FRET nella siringa A.Collegarlo al sistema mentre è in posizione di riempimento Carica la siringa A e quindi ruotare la valvola del campione nella posizione di azionamento. Quindi, caricare una soluzione di Skp1-Skp2 nella siringa B.Collegarla al sistema mentre è in posizione di riempimento. Caricare la siringa B e quindi ruotare il campione nella posizione di azionamento.

Nel software, vai ad acquisire e aprire il pannello di controllo. Impostare il programma per registrare l'emissione di COL1-AMC in 30 secondi. Allora fai un solo colpo.

I segnali di fluorescenza aumentano nel tempo dopo aver miscelato le soluzioni dalla siringa A e dalla siringa B.Quando 70 nanomolari ciascuno di COL1-AMC e FlASH CAND1 sono stati miscelati per generare FRET, due picchi di emissione erano presenti negli spettri di emissione. E il picco di COL1-AMC è diventato più basso, e il picco di FlASH CAND1 è diventato più alto. Quando il CAND1 a tutta lunghezza è stato utilizzato per FRET, il picco del donatore ha mostrato una riduzione del 10% dell'intensità.

Tuttavia, quando CAND1 con la sua prima elica troncata è stata utilizzata, la riduzione dell'intensità di picco del donatore è stata aumentata al 30% suggerendo una maggiore efficienza FRET Per confermare che i cambiamenti del segnale erano il risultato di FRET tra COL1-AMC e FlASH CAND1, il FRET del donatore è stato mescolato con CAND1 senza etichetta in eccesso noto come Chase nell'accettore. Di conseguenza, il picco del donatore è stato completamente ripristinato e il picco dell'accettore è stato ridotto. Qui è mostrato un grafico del valore K medio osservato con la concentrazione CAND1 a seguito dell'analisi di regressione lineare.

Per misurare la costante costante del complesso, 50 nanomolari COL1-AMC sono stati utilizzati in una serie di costanti di velocità di dissociazione osservate sono state misurate mescolando 50 nanomolari COL1-AMC con concentrazioni crescenti di FLASH CAND1. Simile alla misurazione della costante on, la costante di dissociazione osservata di COL1 e CAND1 è stata trovata monitorando il ripristino del segnale del donatore nel tempo sul fluorometro a flusso interrotto. Qui il segnale del donatore è aumentato rapidamente e ha rivelato un valore K osservato di punto zero quattro al secondo.

Al contrario, quando il buffer è stato aggiunto al complesso preassemblato, non è stato osservato alcun aumento del segnale che suggerisca che la dissociazione rapida di COL1 CAND1 sia stata innescata da Skp1 Skp2. Assicurarsi di ridurre al minimo la quantità di luce a cui sono esposte le proteine donatore e accettore. Cerca di tenere i fluorofori al buio il più possibile.