Name: Unanalisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Impara un saggio ad alto contenuto per quantificare il traffico dei recettori AMPA in colture neuronali primarie. Questo metodo misura i cambiamenti dinamici dei pool recettoriali di superficie e interni, offrendo approfondimenti sulla eccitabilità neuronale e potenziali bersagli terapeutici per disturbi neurologici.

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Ringraziamo Zachary Allen per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di Whitehall (Grant 2017-05-35) e Cleon C. Arrington programma ricerca di iniziazione Grant (RIG-93) alla A.M.M. M.A.G e D.W.Y. erano entrambi supportati da una borsa di studio di Georgia State University Neurogenomica 2CI.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la Georgia State University.
1. preparazione dei neuroni Hippocampal primari (in cappa a flusso laminare)
<ol><li>Isolare i neuroni hippocampal primari da giorno postnatale di sesso misto (P) 0-1 topi come precedentemente descritto36.</li>
	<li>Neuroni di piastra a 96 pozzetti poli-D-lisina rivestito di piastre microtiter ad una densità di 2 x 104 cellule per pozzetto.</li>
	<li>Preparare i supporti per nutrire i neuroni con l'aggiunta di 10 mL di 50 x B-27, 5ml di 100 x glutamina, 242 µ l di 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) e 10 µ l di 10 mg/mL Gentamicina a 485 mL di un neurone media (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>I neuroni dell'alimentazione come descritto in precedenza36 rimuovendo la metà (100 µ l) del pre-esistente media (denominato media condizionati, che contiene componenti che supportano la sopravvivenza neuronale) da ciascun pozzetto e sostituendo con 100 µ l di 37 ° C preriscaldato media preparata al punto 1.3 ogni 3-4 giorni. Memorizzare il media condizionati da ogni poppata a 4 ° c al punto 2.3.</li>
</ol>2. misurare il recettore AMPA traffico in risposta a DHPG (in cappa a flusso laminare)
<ol><li>Al giorno In Vitro (DIV) 14, preparare un 500 µ l di soluzione di tetrodotossina (TTX) ad una concentrazione di 2 mM mediante coltura cellulare acqua di grado. Attenzione: TTX è una neurotossina. Maneggiare con cautela ed evitare il contatto con la pelle.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere 100 µ l di ciascun pozzetto della micropiastra 96 pozzetti dei neuroni e i media della piscina.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di soluzione madre TTX a 1 mL dei pool media condizionati dal passaggio 2.2 per creare una soluzione di 4 µM di TTX. Se non c'è abbastanza pool media condizionati, quindi utilizzare alcuni dei supporti archiviati condizionati da passo 1.4.</li>
	<li>Trattare i neuroni con 100 µ l/pozzetto di soluzione 4 µM di TTX dal punto 2.3. Posto la micropiastra in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 4 h.</li>
	<li>Allegare un vetro sterile Pasteur pipetta per una linea di aspirazione e allegare un fine di pipetta 200 µ l sterile per la punta della pipetta. Rimuovere il supporto da ogni bene con attenzione. Evitare di toccare il fondo della micropiastra dove si trovano i neuroni.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di un neurone media temperatura in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 15 min. incubazione in 5% CO2 è comodo ma non necessario.</li>
</ol>3. Immunolabelling (in cappa a flusso laminare)
<ol><li>Preparare una diluizione di 1: 150 dell'anticorpo anti-GluA1 o anti-GluA2 nei mezzi di comunicazione neuronale.</li>
	<li>Rimuovere il supporto di un neurone aggiunto nel punto 2.6. Aggiungere 50 µ l delle soluzioni dell'anticorpo anti-GluA1 o anti-GluA2 ai rispettivi pozzetti per 20 min a temperatura ambiente per consentire il legame dell'anticorpo. Aggiungere 50 µ l di un neurone media dei pozzetti di controllo solo anticorpo secondario.</li>
	<li>Rimuovere le soluzioni di anticorpo aggiunte nel passaggio 3.2. Lavare la micropiastra 3 volte con 100 µ l/pozzetto di temperatura media neuronale per rimuovere eventuali anticorpi non legati.</li>
	<li>Fare una soluzione stock di 50 mM di DHPG in media un neurone o acqua di grado di cultura cellulare. Vortice la soluzione brevemente per sciogliere completamente il DHPG. Preparare questa soluzione fresca lo stesso giorno dell'esperimento. Evitare l'uso di soluzioni vecchi o scongelati.</li>
	<li>Diluire la soluzione di riserva in un neurone media a 1: 500 per fare una soluzione di 100 µM.</li>
	<li>Rimuovere il supporto esistente da ciascun pozzetto. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di riserva di 100 µM DHPG da passo 3.5. Incubare la micropiastra in incubatore a 37 ° C in 5% CO2 per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione DHPG aggiunta nel passaggio 3.6 e aggiungere 100 µ l/pozzetto neuronale media. Ripetere questo passaggio un'altra volta. Posizionare la micropiastra nell'incubatore a 37 ° C in 5% CO2 per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere il saccarosio per rendere la soluzione di saccarosio paraformaldehyde/4% 4% in PBS sullo stesso giorno dell'esperimento. Evitare l'uso di soluzioni vecchi o scongelati. Rimuovere il supporto aggiunto nel passaggio 3,7. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di saccarosio paraformaldehyde/4% 4%. Ripetere i passaggi da 3,6-3,8 per ogni punto di tempo supplementare. Una volta completato, incubare la micropiastra a 4 ° C per 20 min. Attenzione: Gestire scorte di paraformaldeide in una cappa aspirante.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo da passo 3.8 e aggiungere 100 µ l/pozzetto di freddo 1 x DPBS.</li>
	<li>Rimuovere DPBS. Aggiungere 150 µ l/pozzetto blocco buffer (una formulazione di ready-to-use in TBS, fare riferimento alla Tabella materiali) e incubare a temperatura ambiente per 90 min., in alternativa, incubare per una notte a 4 ° C.</li>
</ol>4. l'etichettatura di recettori di superficie
<ol><li>Preparare una diluizione di 1: 1500 di 680RD anticorpo secondario di capra anti-topo IgG in tampone bloccante.</li>
	<li>Rimuovere il tampone bloccante dal punto 3.10. Aggiungere 50 µ l/pozzetto di soluzione di anticorpo secondario e incubare a temperatura ambiente per 60 min. Keep la micropiastra al riparo dalla luce una volta aggiungono gli anticorpi secondari. Assicurati di continuare a proteggere la micropiastra dalla luce durante le incubazioni successive.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal punto 4.2. Aggiungere 100 µ l/pozzetto TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere questo passaggio 4 volte.</li>
	<li>Rimuovere TBS dal punto 4.3. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di saccarosio paraformaldehyde/4% 4% in PBS e incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione dal punto 4.4. Aggiungere 100 µ l/pozzetto TBS e incubare a temperatura ambiente per 5 min, ripetere questo passaggio 2 volte.</li>
</ol>5. la popolazione di recettori interiorizzato di etichettatura
<ol><li>Preparare TBS contenente 0,2% saponina. Vortice la soluzione brevemente per sciogliere completamente la polvere di saponina. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 µm per rimuovere eventuali particelle che potrebbero causare auto-fluorescenza.</li>
	<li>Aggiungere 150 µ l TBS contenente 0,2% saponina e incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di saponina dal punto 5.2 e aggiungere 150 µ l/pozzetto tampone bloccante. Incubare a temperatura ambiente per 90 min.</li>
	<li>Preparare una diluizione di 1: 1500 di anticorpo secondario IgG anti-topo di 800CW asino in tampone bloccante.</li>
	<li>Rimuovere il tampone bloccante dal punto 5.3 e aggiungere 50 µ l/pozzetto di soluzione di anticorpo secondario. Incubare a temperatura ambiente per 60 min.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l/pozzetto TBS e incubare a temperatura ambiente per 5 min, ripetere questo passaggio altre 4 volte.</li>
</ol>6. imaging e analisi
<ol><li>Immagine la micropiastra a 96 pozzetti utilizzando un laser infrarosso imaging sistema secondo le istruzioni del produttore. Impostare la risoluzione di scansione a 84 µm, la qualità di scansione medium ed il fuoco offset secondo l'altezza di base della micropiastra 96 pozzetti utilizzata. Fare clic sul pulsante di menu "Image Studio" → Esporta → immagine per Media digitali → esportare immagini ad una risoluzione di 300 dpi, in formato TIFF.</li>
	<li>Scarica immagine J "Fiji" presso https://imagej.net/Fiji/Downloads</li>
	<li>Apri immagine in immagine J "Fiji". Dividere i canali di colore facendo clic sul menu "Immagine" Canali di colore → Split.</li>
	<li>Aprire il gestore di ROI da "Analizzare" → "strumenti". La casella "etichette" in gestione ROI per etichettare i cerchi con i numeri.</li>
	<li>In rosso canale (680 nm recettore della superficie della piscina), selezionare la regione di interesse (ROI) selezionando lo strumento cerchio e disegnare un cerchio che con precisione si inserisce il primo pozzo. Premere Ctrl + T.</li>
	<li>Trascinate il cerchio alla successiva bene e premere Ctrl + T. Repeat fino a quando tutti i pozzetti sono cerchiati.</li>
	<li>Il direttore di ROI, fare clic su "Misura". Selezionare i valori che vengono visualizzati e li copia su un foglio di calcolo.</li>
	<li>Clicca sul canale verde (la 800 piscina interna recettore nm) e quindi recepire il ROIs selezionato dal passaggio 6.6 all'immagine. Il direttore di ROI, fare clic su "Misura". Selezionare i valori che vengono visualizzati e li copia su un foglio di calcolo.</li>
	<li>Calcolare che i valori di densità media integrato dal secondario solo controllo pozzi. Sottrarre i valori di densità integrata per ogni pozzo sperimentale dai valori di densità media secondaria controllo integrato unico per il pool di recettore di superficie. Ripetere questo passaggio per la piscina interna del ricevitore.</li>
	<li>Calcolare i cambiamenti nell'espressione del recettore di superficie utilizzando Rs/rt, dove Rs rappresenta la densità integrata di recettori di superficie e Rt rappresenta la densità integrata di recettori di superficie + densità integrata di recettori interni.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I recettori AMPA sono un sottotipo di recettore di glutammato ionotropici che è integrale per funzioni neuronali che comprendono la formazione della sinapsi, stabilità di sinapsi e plasticità sinaptica. Rottura del recettore AMPA è legata a molteplici disturbi neurologici24 e sono considerati attraenti droga obiettivi40. Ad esempio, studi hanno dimostrato che uno dei segni più precoci di malattia di Alzheimer (AD) è la perdita di sinapsi e ridotto sinaptica AMPA receptor livelli41,42. Intrigante, aggiunta di oligomeri di ß-amiloide altera espressione di recettore AMPA contenenti GluA1 superficie alle sinapsi43. Ulteriormente, lo status epilepticus giù-regola GluA2 mRNA e proteina in neuroni ippocampali precede la loro morte44. Nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS), TAR DNA-binding protein (TDP-43) patologia, un'anomalia molecolare ALS-specifici, è stato collegato a inefficiente GluA2 Q/R sito-RNA editing45.
Il dosaggio di traffico del recettore AMPA ad alto contenuto fornisce un mezzo efficace per misurare le variazioni di massa nei profili di traffico di recettore all'interno di una rete neuronale in risposta a vari fattori, che consumano molto meno tempo e materiali rispetto ai metodi alternativi. Una singola micropiastra a 96 pozzetti fornisce numerosi pozzi per eseguire più tecnico replica e controlla per diverse condizioni sperimentali nello stesso piatto. La densità di placcatura basso di 2 x 104 cellule/pozzetto rispetto la densità di cellule/pozzetto di 5 x 105 riduce significativamente il numero di animali e materiali richiesti per ogni esperimento (Figura 1). Lo scanner ad infrarossi può immagine 96 pozzetti fino a sei alla volta. Il dosaggio può essere modificato anche per una micropiastra 384 pozzetti46, che diventa in particolare prezioso se il test viene eseguito su campioni preziosi che sono difficili da ottenere o sono costosi da cultura (campioni ad esempio umani e cellule staminali pluripotenti indotte). Il dosaggio intero può essere completato e analizzato lo stesso giorno, che consente di risparmiare tempo prezioso (Figura 1).
Per completamento riuscito ed efficace del dosaggio, devono essere considerati alcuni punti. In primo luogo, è importante preparare la soluzione DHPG nello stesso giorno del trattamento del neurone. Non riutilizzare o congelare scorte DHPG. Il saccarosio di paraformaldehyde/4% del 4% in soluzione PBS dovrebbe anche essere fatta fresco lo stesso giorno dell'esperimento. In secondo luogo, pozzetti di controllo trattati con TTX solo o veicolo sono tenuti a garantire che gli effetti osservati sono specifici per il trattamento. È anche fondamentale per includere pozzi trattati con solo gli anticorpi secondari al controllo per fluorescenza di fondo prodotto da legame non specifico. Si noti che la seconda fase di fissazione (seguente sbiaditura di anticorpi secondari) è la chiave per ridurre gli effetti di sfondo di anticorpo secondario e ottenere l'etichettatura efficace delle subunità del recettore.
Compromessi né limitazioni, come con qualsiasi metodo, esistano. Questo test non fornisce risoluzione unicellulare (o subcellulare) e non consente il monitoraggio in tempo reale del recettore traffico come altri metodi32,33,35. Inoltre, cura adeguata deve essere preso durante la fase di permeabilizzazione dei neuroni, come questo metodo sarà sensibile per la fuoriuscita di componenti intracellulari in caso di sovra-permeabilizzazione.

L'entità e la dinamica temporale dell'eccitabilità neuronale dipende in larga misura la disponibilità e la composizione delle popolazioni di recettore di superficie che trasduce segnali elettrochimici. Considerando che la sintesi di nuovi recettori (o subunità del recettore) è generalmente un processo energeticamente costoso e meno relativamente lungo, un host di macchinario cellulare dedicato alla endo - ed esocitosi dei recettori esistenti forniscono un mezzo per loro inserimento veloce e rimozione da e verso la membrana1. Pertanto, oltre la regolazione trascrizionale e traslazionale dei recettori, traffico di posttranslational recettore è un importante modulatore dell'eccitabilità neuronale.
Plasticità sinaptica, o la forza mutevole delle connessioni tra i neuroni con esperienza, è pensata per formare la base dell'apprendimento e della memoria2,3. Il rafforzamento e l'indebolimento delle sinapsi nel corso del tempo, chiamate Long-term potentiation (LTP) e depressione a lungo termine (LTD), rispettivamente, può essere modulate attraverso il traffico di recettori per l'acido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) 4 , 5. recettori AMPA sono eterotetrameri composto da quattro subunità (GluA1-4) e mediare la maggior parte della trasmissione sinaptica eccitatoria rapida in cervello6. Così, l'eccitabilità del neurone è in gran parte una funzione della quantità di recettori AMPA sulla superficie postsinaptica disponibile deve essere attivato da glutammato. LTD è comunemente associato con un aumento in endocytosis del ricevitore AMPA, considerando che LTP è principalmente associato con un aumento nell'esocitosi del recettore AMPA. Postsinaptica espressione di superficie dei recettori AMPA richiede endosomal consegna alle proteine esocitotico, dove la fusione con la membrana plasmatica quindi avviene in un modo dipendente dal calcio7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. esistono anche una serie di meccanismi che regolano l'endocitosi del recettore AMPA di attività-dipendente. Un esempio di questo è via IEG Arc/Arg3.1 (Arc). Tra le altre funzioni15, Arc è noto per mediare recettore metabotropico del glutammato (mGluRs)-dipendente LTD promuovendo endocitosi del recettore AMPA attraverso i suoi partner di associazione, che includono le proteine endocitiche AP-2, endophilin-3 e dinamina-2 16 , 17 , 18 , 19, alle rivestite di clatrina pozzi20,21. Interiorizzato i recettori AMPA possono essere riciclati torna alla membrana plasmatica o destinati alla degradazione22,23.
D'importanza, la composizione in subunità dei recettori AMPA contribuisce al loro traffico dinamiche24. Di grande rilevanza è il dominio intracellulare C-terminale delle subunità, dove si verifica la maggior parte delle modifiche di posttranslational e interazioni correlate a traffico della proteina. GluA1 e GluA4 contenenti subunità dei recettori AMPA sono particolarmente suscettibili di essere trafficate alla superficie delle cellule durante LTP, in parte a causa della presenza dei loro ligandi PDZ, sequenze di aminoacidi di ~ 90 che promuovono la membrana ancoraggio tramite interazioni con vari PDZ dominio-contenente proteine25,26. D'altra parte, i recettori AMPA contenente GluA2 e mancanza di GluA1 o GluA4 tendono ad essere vittime della tratta costitutivamente, ma si accumulano intracellulare con attività sinaptica27. GluA2 subunità subiscono RNA editing che, oltre a promuovere la conservazione nel reticolo endoplasmatico28, rende il poro del canale impermeabile a calcio29, implicando ulteriori specifiche subunità traffico come un mediatore chiave di un neurone omeostasi e plasticità. Interessante, la rottura della degradazione ubiquitina-dipendente Arc ha dimostrata di aumentare GluA1 endocitosi e aumentare l'espressione di superficie di GluA2 contenenti subunità dei recettori AMPA dopo induzione del mGluRs-LTD con il selettivo gruppo I mGluRs agonista (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), indicando che resta ancora molto da imparare per quanto riguarda i meccanismi e il ruolo di specifiche subunità AMPA receptor traffico30.
Metodi per osservare i cambiamenti nell'espressione dei recettori di superficie sono spesso ingombrante, che richiede tempo, o introdurre inutili confonde. Saggi basati su biotina sono un approccio pervasivo e commercialmente disponibile. Purificazione di affinità dei recettori di superficie biotinilati rappresenta uno di questi esempi, tuttavia la necessità di eseguire l'elettroforesi richiede una grande quantità di materiale campione e può rendere un proibitivamente lungo la proiezione di trattamenti multipli 31di processo. Estensioni di questo test, dove vengono eseguite molteplici punti di tempo di etichettatura e immunoprecipitazione per quantificare la degradazione graduale di un segnale iniziale, allo stesso modo trascurano l'aggiunta di nuovo — o riciclati — recettori alla cella superficiale e solo esacerbano il tempo e le richieste di materiale.
Altri approcci fanno uso di costrutti chimerici o l'aggiunta di tag fluorescente per osservare del ricevitore traffico32, a volte usando live cell imaging33,34. Mentre potenzialmente potente, questi disegni possono influenzare i modelli di traffici normali di recettori a causa di mutazioni o drammatici cambiamenti nel peso molecolare introdotto in queste proteine. L'uso di coloranti che etichettano compartimenti subcellulari mirando a basso pH34,35 sono aspecifici e fare distinzione tra diversi compartimenti intracellulari importanti per ricevitore traffico (ad es.. i lisosomi e proteosomi) difficile. Infine, l'uso della microscopia confocale per visualizzare la colocalizzazione dei recettori con indicatori connessi con il traffico e il degrado, quali proteine endosomal o clatrina, fornendo al contempo potenzialmente utile spaccato localizzazione specifica con risoluzione subcellulare, sono tempo, laborioso e costoso a causa della necessità di analizzare singolarmente ogni cella e il requisito della confocale o microscopia di Super-risoluzione.
Qui, dimostriamo un saggio di traffico ad alto contenuto del ricevitore che è compatibile con colture neuronali primarie preparazioni30. Questo metodo etichette separatamente le piscine di superficie e intracellulare del recettore dei neuroni fissi, che consente la presentazione di dati come un rapporto di superficie normalizzata o densità recettoriale interiorizzato la densità complessiva per quel recettore. La natura ad alto contenuto di questo metodo è ideale per lo screening di più trattamenti e/o genotipi in un breve lasso di tempo e richiede competenze di incubazione di coltura e l'anticorpo cella solo standard.
Brevemente, neuroni primari sono coltivati in piastre microtiter standard da 96 pozzetti e quindi trattati come dettato dal disegno sperimentale, incubati con anticorpi primari, lavati e fisso. Le cellule sono poi incubate con un anticorpo secondario per etichettare i ricevitori di superficie, seguiti da un altro punto di fissazione. Si verifica quindi la permeabilizzazione e un secondo anticorpo secondario è usato per etichettare piscine interna del ricevitore. Infine, le cellule sono Imaging utilizzando uno scanner a infrarossi micropiastra fluorescente per quantificare la densità integrata di ogni popolazione del ricevitore. Figura 1 riassume la nostra analisi ad alto contenuto rispetto ad un dosaggio di biotinilazione tradizionale.
Mentre il protocollo offerto qui è ottimizzato e specifico per il recettore AMPA traffico in colture di neuroni hippocampal primari, questa procedura potrebbe, in teoria, essere esteso e adattata per diversi recettori in una varietà di tipi cellulari.

<table><tbody><tr><td>Millipore EMD Millipore</td> <td>monoclonale di topo (RH95) anti-GluA1 N-terminale</td><td>Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale di topo (6C4) anti-GluA2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-topo di capra (H+L)</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Asino anti-Topo IgG (H+L)</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15</td><td></td></tr><tr><td>(RS)-3,5-DHPG</td><td>Tocris Bio-Techne</td><td>Cat#0342</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotossina Citrato (TTX)</td><td>Tocris Bio-Techne</td><td>Cat#1069</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina Bromidrato (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#P7280-5X5MG</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>ACROS Organics</td><td>Cat# 419231000</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B-27 (50x), Integratore</td> di Glutamax <td>Gibco</td><td>Cat#17504044</td><td></td>Senza Siero</tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>Cat#35050061</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deossiuridina (FUDR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#F0503</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (10 mg/mL)</td><td>Gibco</td><td>Cat#15710064</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, grado EM, purificato</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>Cat#19210</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio (EP/BP/NF)FisherScientific</td><td></td> <td>Cat#S2500GM</td><td></td></tr><tr><td>Tampone bloccante Odyssey (TBS)</td><td>Li-COR</td><td>Cat#927-50003</td><td>Indicato come "Blocking Buffer" nel protocollo</td></tr><tr><td>Cell Culture Grade Water</td><td>HyClone</td><td>Cat#SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcio, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>Cat#14190250</td><td></td></tr><tr><td>Terreno neurobasale, meno rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>Cat#12348017</td><td>Indicato come "terreno neuronale" nel protocollo</td></tr><tr><td>Filtri per siringa da 28 mm di diametro, 0,2 &; m Membrana SFCA a pori, sterile</td><td>Corning</td><td>Cat#431219</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Micropiastre in polistirene con fondo nero/trasparente</td><td>Corning</td><td>Cat#3603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just ImageJ)</td><td>NIH</td><td>http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285</td><td></td></tr><tr><td>sistema di imaging Odyssey CLx</td><td>Li-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio ampa traffico recettoriale

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Traffico dei recettori a e dalla superficie delle cellule postsinaptico è un meccanismo importante da cui neuroni modulano la loro reattività a stimoli diversi. I recettori α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic di acido (AMPA), che sono responsabili della trasmissione sinaptica eccitatoria rapida nei neuroni, sono vittime della tratta da e verso la superficie postsinaptica per modificare dinamicamente l'eccitabilità neuronale. Traffico di recettore AMPA è essenziale per la plasticità sinaptica e può essere interrotta nella malattia neurologica. Tuttavia, gli approcci prevalenti per quantificare il traffico recettoriale ignorano piscine intero del ricevitore, sono eccessivamente tempo - e laborioso, o potenzialmente interferire con i normali meccanismi traffici e pertanto complicano l'interpretazione dei dati risultanti. Presentiamo un'analisi ad alto contenuto per la quantificazione delle popolazioni di recettore AMPA sia interne che superficiali in colture di neuroni ippocampali primarie utilizzando dual immunolabeling fluorescente e uno scanner infrarosso fluorescente micropiastra a 96 pozzetti. Questo approccio facilita il rapido di screening di massa interiorizzato e densità di recettori di superficie, riducendo al minimo il materiale campione. Tuttavia, il nostro metodo ha limitazioni nell'ottenere risoluzione cella singola o conducendo live cell imaging. Infine, questo protocollo può essere favorevole ad altri recettori e tipi differenti delle cellule, forniti di ottimizzazione e le rettifiche corrette.

Arco/Arg3.1 accelera endocitosi del recettore AMPA attraverso l'interazione con AP-2, endophilin-3 e dinamina 216,18 seguendo mGluRs attivazione37. In Arc knock-in mouse (ArcKR), Lisine 268 e 269 nella proteina Arc sono mutati ad arginina, che interferisce con arco ubiquitinazione. Questo altera il proteasoma-dipendente fatturato di Arc e prolunga la sua emivita in neuroni21,30. In questo esperimento, la persistenza dell'arco nel regolare il traffico di recettore AMPA è stata esaminata usando l'analisi di traffico del recettore AMPA ad alto contenuto. I neuroni sono stati trattati con l'antagonista di Na+ TTX, che inibisce i potenziali di azione e riduce l'arco livelli38, seguita da DHPG, che induce la traduzione di Arc e ubiquitinazione37,39. Sia in superficie che in piscine interiorizzate di GluA1 - (Figura 2A) e subunità del recettore AMPA contenenti GluA2 (Figura 3A) sono state misurate a 5 e 15 min dopo interruzione di DHPG. Questo particolare esperimento usato tecniche tre replicati da 3 esperimenti indipendenti. Neuroni di ArcKR ha mostrato GluA1 endocytosis aumentato quando trattati con DHPG rispetto ai neuroni WT, un effetto che non è stato visto quando i neuroni sono stati trattati con TTX solo (Figura 2B). Espressione di superficie di subunità GluA2 è stata aumentata significativamente in breve tempo punti rispetto ai neuroni WT (Figura 3B), che indica un potenziale di sostituzione di subunità30. Alcuni pozzi sono stati trattati con anticorpi secondari solo al controllo per fluorescenza di fondo causato da legame non specifico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig1.jpg"> Figura 1: confronto del test traffico ad alto contenuto del recettore AMPA per il dosaggio di biotinilazione recettore. Il dosaggio di traffico ad alto contenuto consuma meno tempo e risorse rispetto al dosaggio standard biotinylation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig2.jpg"> Figura 2: superficie e interni popolazioni delle subunità del recettore AMPA GluA1 in neuroni ippocampali WT e ArcKR. (A) superficie (sGluA1) e subunità dei recettori AMPA contenenti GluA1 interiorizzate (iGluA1) in neuroni ippocampali WT e ArcKR a 5 e 15 min dopo interruzione di DHPG. Rispetto al WT, ArcKR i neuroni hanno una diminuzione ulteriore nel sGluA1-contenente AMPA receptor piscina 5 e 15 min dopo interruzione di DHPG. (B) grafico rappresenta superficie fluorescenza normalizzata per l'intensità di fluorescenza totale. I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando un one-way ANOVA, test t accoppiato e spaiata dello studente. p ≤ 0.05; n = 3 replicati tecnici da 3 esperimenti indipendenti. I valori rappresentano la media ± SEM Questa figura è stata modificata dalla parete, M. J. et al 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59048/59048fig3.jpg"> Figura 3: superficie e interni popolazioni delle subunità del recettore AMPA GluA2 in neuroni ippocampali WT e ArcKR. (A) la stessa condizione sperimentale come nella figura 2. Rispetto al WT, ArcKR i neuroni hanno un aumento nella piscina del recettore AMPA sGluA2-contenente 5 min dopo interruzione di DHPG. (B) grafico rappresenta superficie fluorescenza normalizzata per l'intensità di fluorescenza totale. I confronti statistici sono stati effettuati usando il One-way ANOVA, test t accoppiato e spaiata dello studente. p ≤ 0.05; n = 3 replicati tecnici da 3 esperimenti indipendenti. I valori rappresentano la media ± SEM Questa figura è stata modificata dalla parete, M. J. et al 201830. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59048/59048fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Eccitabilità di un neurone può essere modulata attraverso un processo dinamico di endo - ed esocitosi dei ricevitori ionotropici eccitanti del glutammato. Descritto qui è un test accessibile, ad alto contenuto per la quantificazione del recettore di superficie e interno popolazione piscine.

Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...

Qui dimostriamo un saggio di traffico di recettori ad alto contenuto compatibile con la preparazione primaria della coltura neuronale. Questo metodo etichetta separatamente la superficie come pool di recettori inter cantina di neuroni fissi. Consentire la presentazione dei dati come rapporto tra la superficie normalizzata o la densità internata del recettore alla densità complessiva di tale recettore.Il saggio di traffico di alti contenuti e recettori fornisce un mezzo efficace per misurare i cambiamenti di massa nei profili di traffico dei recettori all'interno di una rete neurale in risposta a vari fattori. Consumare molto meno tempo e materiali rispetto ai metodi alternativi. Le interruzioni e il traffico di precettori sono stati collegati a molteplici disturbi neurologici e sono considerati obiettivi interessanti per la terapia farmacologica.Ad esempio, studi hanno mostrato che uno dei primi segni del morbo di Alzheimer è la perdita sinaptica e le piscine sinaptiche e precetcettiche diminuite. Questa tecnica richiede molti passaggi diversi di varia difficoltà. Soprattutto perché maneggiare la piastra del pozzo 96 e manipolare i pozzi può rivelarsi difficile per qualcuno senza esperienza.E poiché i risultati dell'esperimento sono altamente sensibili alla manipolazione impropria, è utile visualizzare i vari passaggi eseguiti. Istruttore Per iniziare, nutrire i neuroni nella piastra del pozzo 96 rimuovendo 100 microlitri dei supporti preesistenti da ogni pozzo. E sostituirlo con 100 microlitri di supporti pre-riscaldati a 37 gradi Celsius.Ogni tre o quattro giorni. Un giorno in vitro 14, utilizzare un multi-pipet per rimuovere 100 microlitri di supporti da ogni pozzo e mettere in comune il supporto. Aggiungere due microlitri di soluzione TTX Stock a un millilitro del supporto condizionato in pool per creare una soluzione micromolare a quattro micromolari di TTX.Trattare i neuroni in ogni pozzo con 100 microlitri di quattro soluzione TTX micromolare. Se non è disponibile un numero sufficiente di supporti di condizione in pool, aggiungere alcuni dei supporti memorizzati in precedenza. Incubare in un incubatore di CO2 al 5% a 37 gradi Celsius per quattro ore.Successivamente rimuovere il TTX esistente contenente il supporto e aggiungere 200 microlitri di mezzi neuronali pre-riscaldati e incubare la micro piastra a temperatura ambiente per quindici minuti. Per prima cosa rimuovere il supporto neuronale dalla micro piastra. Aggiungere cinquanta microlitri della soluzione anticorpale anti gluA1 o anti gluA2 ai pozzi corrispondenti della micro piastra.Aggiungere cinquanta microlitri di mezzi neuronali all'anticorpo secondario solo pozzi di controllo. Incubare a temperatura ambiente per venti minuti per consentire il legame anticorpale. Successivamente rimuovere i supporti esistenti dai pozzi.Lavare la micro piastra tre volte con 100 microlitri di mezzi neuronali a temperatura ambiente per pozzo per rimuovere eventuali anticorpi non vincolati. Quindi aggiungere 100 microlitri 100 micromolari di soluzione stock DHPG ad ogni pozzo. Incubare in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per dieci minuti.Rimuovere quindi la soluzione DHPG e aggiungere 100 microlitri di mezzi neuronali a ciascun pozzo. Ripetere questo processo una seconda volta. Quindi incubare nell'incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Il giorno dell'esperimento preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% e 4% di saccarosio NPBS. Rimuovere il supporto da ogni pozzo e sostituirlo con 100 microlitri della soluzione di paraformaldeide e saccarosio. Ripetere questo processo per ogni punto di tempo di addizione.Incubare la micro piastra a 4 gradi Celsius per venti minuti. Quindi rimuovere il fissatore e aggiungere 100 microlitri di DPBS ad ogni pozzo. Rimuovere il DPBS e aggiungere 150 microlitri di buffer di blocco a ciascun pozzo.Incubare a temperatura ambiente per novanta minuti. Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere 50 microlitri della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente per sessanta minuti mantenendo la piastra protetta dalla luce.Rimuovere la soluzione anticorpale e aggiungere 100 microlitri di TBS ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo processo, rimuovendo il supporto dai pozzi aggiungendo TBS e incubando a temperatura ambiente altre quattro volte.Successivamente, rimuovere il TBS dalla micro piastra. Aggiungere 100 microlitri di una soluzione di paraformaldeide al 4% e 4% di saccarosio in PBS a ciascun pozzo. Incubare a temperatura ambiente per quindici minuti.Rimuovere la soluzione di paraformaldeide e aggiungere 100 microlitri di TBS in ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo passaggio due volte in più. Preparare innanzitutto una soluzione di TBS contenente 2%saponina e vortice la soluzione brevemente per sciogliere completamente la polvere di saponina.Utilizzando un filtro a 2 micrometri, filtrare la soluzione per rimuovere eventuali particelle che potrebbero causare autofluorescenza. Aggiungere 150 microlitri di questa soluzione di saponina al 2% ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per quindici minuti. Quindi rimuovere la soluzione di saponina e aggiungere 150 microlitri di tampone di blocco ad ogni pozzo.Incubare a temperatura ambiente per novanta minuti. Successivamente rimuovere il tampone di blocco e aggiungere cinquanta microlitri della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente per sessanta minuti.Quindi aggiungere 100 microlitri di TBS ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo processo aggiungendo TBS e incubando a temperatura ambiente altre quattro volte. Utilizzando un sistema di imaging laser a infrarossi, l'immagine della microschedre da 96 pozzi secondo le istruzioni dei produttori.Impostare la risoluzione di scansione su 84 micrometri. La qualità della scansione a medio e l'offset di messa a fuoco in base all'altezza di base della microstra di 96 pozzi utilizzata. Fare clic sul pulsante del menu Image Studio, esportare l'immagine per i supporti digitali ed esportare le immagini con una risoluzione di 300 dpi in formato TIFF.Aprite l'immagine in ImageJ Fiji. Dividere i canali di colore facendo clic sul menu immagine e quindi colorare, dividere i canali. Quindi apri il gestore del ROI da analisi, strumenti.Selezionare la casella per le etichette nel gestore del ROI, per classificare i cerchi con i numeri. Nel canale 6 80, o rosso, selezionare la regione di interesse selezionando lo strumento cerchio e disegnando un cerchio che si adatta accuratamente al primo pozzo. Quindi premere CTRL più T, trascinando il cerchio al pozzo successivo.Ripetere questo processo fino a quando tutti i pozzi non sono cerchiati. Dal gestore del ROI fare clic su misura. Selezionare i valori visualizzati e copiarli in un foglio di diffusione.Fare quindi clic sul canale verde e trasporre le ROM selezionate nell'immagine. Dal gestore del ROI fare clic su misura. Selezionare i valori visualizzati e copiarli in un foglio di diffusione.Successivamente calcola le modifiche dell'espressione del recettore della superficie come delineato nel protocollo di testo. In questa procedura la persistenza dell'arco nella regolazione del traffico del recettore ampa viene esaminata utilizzando il traffico e il dosaggio del recettore degli amplificatori ad alto contenuto. I neuroni sono trattati con il bloccante del canale sodio-ioni TTX che inibisce i potenziali d'azione e riduce i livelli di arco.Seguito dal DHPG che induce la traduzione e l'ubiquitinazione dell'arco. Sia le piscine superficiali che internezzate di gluA1 e gluA2 contenenti subunità del recettore apa sono state misurate a cinque e quindici minuti dopo il lavaggio dhpg. I neuroni ArcKR mostrano un aumento dell'endositosi gluA1 se trattati con DHPG, rispetto ai neuroni di tipo mentre.Questo effetto non si vede quando i neuroni vengono trattati solo con TTX. L'espressione superficiale della subunità gluA2 è aumentata significativamente in brevi punti di tempo rispetto ai neuroni di tipo wile. Indica una potenziale sostituzione della subunità.Assicurarsi che le cellule siano paraformaldeide fissa illiquide deve essere preparato fresco il giorno dell'esperimento. Le cellule devono essere riparato dopo l'etichettatura per i recettori superficiali. Altri metodi come la microscopia confocale saranno in grado di fornire una risoluzione a singola cellula per caratterizzare ulteriormente i cambiamenti correlati nella struttura neuronale e nella localizzazione del recettore.Interrompere la dinamica temporale dell'arco altera il traffico di recettori ampa in risposta a MgluR mediato LTD. Le direzioni future saranno misurare il traffico di recettori ampa in risposta ad altri stimoli. Questo saggio può essere adattabile ad altri tipi di cellule, trattamenti e recettori, a condizione che la procedura sia accuratamente regolata e adeguatamente convalidata.È necessario fare attenzione a garantire che densità cellulari, tempi di trattamento, passaggi di fissazione, passaggi di permeabilizzazione e selezioni di reagenti siano ottimizzati il sistema di interesse. Per un completamento efficace ed efficiente del saggio è importante preparare la soluzione DHPG e la soluzione di paraformaldeide 4%, 4% di saccarosio il giorno dell'esperimento. Il controllo ben trattato con vakeel o TTX è necessario per garantire che gli effetti osservati siano specifici del trattamento.È anche fondamentale includere pozzi trattati con solo gli anticorpi secondari per il controllo della fluorescenza di fondo prodotti da attacchi non specifici.

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L'attivazione persistente del inibitori G recettori accoppiati alla proteina provoca sensibilizzazione della segnalazione ciclasi ciclasi. Per identificare le vie molecolari essenziali, sono necessari approcci nonbiased, tuttavia, questa strategia richiede lo sviluppo di una base cellulare scalabile saggio cAMP sensibilizzazione. Qui, descriviamo un test di sensibilizzazione per la piccola molecola e lo screening siRNA.

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Qui mostriamo l'uso di colorante fluorescente Alexa accoppiato ad α-bungarotossina per misurare GABA A localizzazione superficiale recettore e endocitosi nei neuroni dell'ippocampo. Attraverso l'uso di costrutti recanti un breve tag extracellulare che lega α-bungarotossina, analisi di proteine ​​di membrana plasmatica traffico endocitico può essere raggiunto.

L&#39;utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di facilitare lo studio dei recettori NMDA (NMDAR) a scala più ampia e consentire l'esame degli effetti modulatory di piccole molecole e le loro applicazioni terapeutiche.

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

Qui, abbiamo descritto un metodo di imaging ad alto contenuto per quantificare il trasporto dei mutanti di rodopsina associata alla retinite pigmentosa. Un'analisi dei punteggi multiplo-lunghezza d'onda è stata utilizzata per quantificare proteina rhodopsin sulla superficie delle cellule o in tutta la cella.

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Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Le interazioni di GPCR-z-arrestin sono un campo emergente nella scoperta di farmaci GPCR. Metodi accurati, precisi e facili da impostare sono necessari per monitorare tali interazioni nei sistemi viventi. Mostriamo un saggio di complemento strutturale per monitorare le interazioni di GPCR-arresto-arresto in celle viventi in tempo reale, e può essere esteso a qualsiasi GPCR.

Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci

Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.

Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

È stato sviluppato un protocollo migliorato per un saggio di mobilizzazione del calcio con cellule endoteliali, utilizzato per identificare ligandi di recettori attivati dalla proteasi (PAR). Il nuovo protocollo riduce il tempo totale di analisi di 90-120 minuti e produce curve concentrazione-risposta riproducibili.

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Impara un saggio ad alto contenuto per quantificare il traffico dei recettori AMPA in colture neuronali primarie. Questo metodo misura i cambiamenti dinamici dei pool recettoriali di superficie e interni, offrendo approfondimenti sulla eccitabilità neuronale e potenziali bersagli terapeutici per disturbi neurologici.

Un'analisi ad alto contenuto per monitoraggio AMPA traffico recettoriale

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