Misurazione altamente sensibile della permeabilità glomerare nei topi con Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nefrologia sul ruolo della permeabilità glomerulare nella malattia renale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che piccoli e transitori aumenti della permeabilità glomerulare vengono rilevati utilizzando un tracciante etichettato con piombo fluorescente. Dopo l'anestesia, posizionare un catetere urinario nel topo femmina.

Posizionare il mouse in recumbency dorsale. Stringi l'addome inferiore e trova l'ostio uretrale. Ottenere la parte plastica del catetere di un angiocatetere da 22 G e lubrificarla con gel di xilocaina.

Utilizzare l'indice sinistro per posizionare un'attenta tensione sull'addome inferiore e introdurre il catetere di tre millimetri nell'ostio uretrale mentre si corre parallela all'asse uretrale distale. Girare la parte superiore dell'angiocatetere di 180 gradi mantenendo la punta all'interno dell'ostium uretrale e mantenendo l'asse dell'uretra. Quindi, introdurre il catetere sette millimetri più avanti nel topo in modo che sia posto all'interno della vescica.

Posizionare un tubo marrone da 1,5 millilitri sopra la parte superiore dell'angiocatetere per raccogliere l'urina. Applicare un millilitro dello 0,9% di cloruro di sodio per via sottocutanea per migliorare la produzione di urina. Radere il collo del topo e posizionarlo in recumbency con la testa verso il chirurgo.

Iper estendere la testa del mouse con un nastro adesivo. Disinfettare il collo con il 70% di isopropanolo. Usando una pinzetta e un paio di forbici fai un'incisione cutanea di cinque millimetri sotto la mascella.

Tagliare la pelle di circa un centimetro nella direzione dello sterno fino a raggiungere il centro dello sterno. Usa un paio di forbici. Sezionare con cura la pelle sul lato destro del collo.

Fai un'incisione rettangolare della pelle a destra per esporre il tessuto molle del collo. Fare attenzione a non danneggiare la vena giugulare. Utilizzare un paio di forbici e una pinzetta per fissare i lembi della pelle con due morsetti.

Usando la punta della pinzetta fine, esporre con cura la vena giugulare con una preparazione smussata. Se necessario, rimuovere il tessuto con forbici fini. Evitare lesioni ai rami delle vene.

Posizionare e chiudere una legatura con un filo di seta nella parte distale della vena giugulare visibile che si trova verso la testa del topo. Fissare il filo di seta con un nastro adesivo per mettere tensione sulla legatura. Ciò garantisce una leggera tensione sulla vena giugulare.

Preparare una legatura intorno alla parte prossimale della vena giugulare. Successivamente, riempire il catetere con la soluzione di equilibrazione e fusione. Fissare il catetere con un nastro in modo che il catetere allinei la vena giugulare.

Controllo delle bolle per evitare l'embolia dell'aria. Sollevare la vena giugulare con pinzette fini nel luogo di inserimento. Allineare il tubo parallelo alla vena giugulare e forare la vena giugulare mirando al lume.

Inserire per circa due o quattro millimetri paralleli all'asse della vena giugulare. Evitare movimenti vivaci. Chiudere la legatura per fissare il catetere.

Controllare la tenuta della legatura visualizzando attentamente attraverso il microscopio. Metti un tampone umido sul luogo dell'intervento. Posizionare il polsino della coda nella parte inferiore della coda del topo mentre il mouse giace in recumbency dorsale.

Avviare le misurazioni e ripeterle dieci volte per punto di tempo. Se le misurazioni della pressione sanguigna non sembrano corrette e vengono prodotti dati falsi, regolare la posizione del polsino della coda. Prima della fase di equilibrazione, cambiare il tubo di raccolta urinario e posizionarlo sul ghiaccio.

Piegare un tampone e metterlo intorno al catetere del piccolo vaso che viene introdotto nella vena giugulare. Posizionare un morsetto sul tampone per abolire il flusso sanguigno retrogrado o l'embolia dell'aria. Collegare un ago da 27 G con una siringa millilitro riempita con il bolo FITC fino all'estremità del catetere del piccolo vaso.

Aprire il morsetto e applicare il bolo FITC da 100 microliter. Chiudere nuovamente il morsetto e collegare il catetere più grande con il catetere più piccolo. Riaprire il morsetto e avviare la pompa della siringa con una portata di 0,008 millilitri al minuto.

Continuare l'infusione per 60 minuti. In questa fase, vengono studiati i farmaci efficaci sulla selettività glomerulare del perm. Cambiare il punto di tempo del tubo urinario zero minuto in un altro tubo marrone da 1,5 millilitri.

Mettere un tampone attorno al catetere del piccolo recipiente e scollegare il grande catetere dal catetere del piccolo vaso. Riempire la siringa con la soluzione sperimentale di fase. Posizionarlo nella pompa della siringa e lasciare funzionare la pompa per infusione in modo che il catetere di grandi dimensioni sia riempito con la soluzione di fase sperimentale.

Ricollegare i cateteri evitando l'embolia dell'aria e riaprire il morsetto. Avviare la pompa della siringa alla portata di 0,008 millilitri al minuto. Continuare a eseguire la pompa della siringa per 60 minuti e raccogliere l'urina all'interno del tubo urinario in seguito.

Posizionare il tubo delle urine sul ghiaccio. In questo studio, la scansione a fluorescenza dell'urina nativa del topo mostra un picco a 395 nanometri. Il polisucrose FITC 70 ad una concentrazione di 40 microgrammi per millilitro nelle urine del topo mostra una fluorescenza massima a 525 nanometri.

L'urina di topo non disturba la misurazione della fluorescenza della polisucrose FITC 70. Al ricovero di 525 nanometri aumentando le concentrazioni di polisucrose FITC 70 mostra un aumento dell'intensità di fluorescenza. Questo metodo è anche in grado di rilevare differenze nella permeabilità glomerulare.

Le colonne bianche rappresentano i livelli di polisucrose FITC 70 prima dell'inizio della stimolazione dell'angiotensina II nella fase sperimentale. Dopo dosaggi per 60 minuti, la permeabilità glomerulare è aumentata rispetto al gruppo di controllo. angiotensina II lavare fuori diminuzione permeabilità glomerulare.

I livelli di polisucrose 70 FITC sono diminuiti dopo altri 60 minuti di stimolazione dell'angiotensina II o 60 minuti di lavaggio dell'angiotensina II. L'aumento della permeabilità glomerulare dovuto all'angiotensina II potrebbe essere bloccato da un bloccante del recettore dell'angiotensina II. La pressione sanguigna monitorata con il metodo del polsino della coda non mostrava differenze significative tra il controllo e i gruppi trattati con angiotensina II.

Durante il tentativo di questa procedura è importante evitare l'embolia dell'aria quando si cambiano le soluzioni per infusione.