Assemblaggio molecolare navette arricchite reversibilmente attaccato Kinesins
26 gennaio 2019
Presentiamo un protocollo per costruire navette molecolari, dove proteine motrici superficie-aderito chinesina propel microtubuli tintura-etichettati. Interazioni deboli di kinesins con superficie consente loro reversibile attaccamento ad essa. Questo crea un sistema su scala nanometrica che esibisce dinamico montaggio e smontaggio dei suoi componenti, pur mantenendo la sua funzionalità.
Questo protocollo è significativo perché apre le porte a ulteriori indagini nella progettazione di sistemi biologici su scala nanometrica in equilibrio dinamico. Questa tecnica colma parte del divario tra strutture ingegnerizzate e naturali perché consente lo studio di ciò che potremmo chiamare, l'autoguarigione o la sostituzione dinamica dei componenti molecolari. Il consiglio più importante per provare questa tecnica per la prima volta è assicurarsi che lo sperimentatore se ne stia seguendo tutti i protocolli di sicurezza.
In primo luogo, preparare le soluzioni stock come delineato nel protocollo di testo. Pipettare 21,8 microlitri di BRB80 Buffer in un piccolo tubo di microfuga. Aggiungere 1 microliter della soluzione stock di cloruro di magnesio, 1 microliter della soluzione stock GTP e 1,2 microlitri della soluzione stock DMSO per completare la preparazione del buffer di crescita dei microtubuli.
Per iniziare la polimerizzazione dei microtubuli, aggiungere 6,25 microlitri di tampone di crescita dei microtubuli direttamente in un'aliquota di 20 microgrammi di tubulina lofilizzata;etichettata per essere eccitata a 647 nanometri. Vortice a 40 RPS per 5 secondi. Raffreddare l'aliquota sul ghiaccio per 5 minuti.
Quindi, incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Per iniziare la stabilizzazione dei microtubuli, aggiungere 5 microlitri della soluzione di paclitaxel aliquota a 490 microlitri di tampone BRB80. Vortice la soluzione a 30 RPS per 10 secondi.
Una volta che i 45 minuti di incubazione per i microtubuli sono terminati, aggiungere 5 microlitri di quella soluzione al BRB80 e la miscela paclitaxel, per creare la soluzione MT100. In primo luogo, aggiungere 9,0 microlitri della soluzione aliquota di caseina a 291 microlitri di tampone BRB80. Pipettare 83 microlitri della soluzione di caseina BRB80 in un nuovo tubo di micro centrifuga da 6 millilitri.
Aggiungere 1 microlitro di D-glucosio, glucosio ossidasi, catalasi, DTT, fosfato di creatina e fosfochinasi. Quindi, aggiungere 1 microliter della soluzione ATP stock alla soluzione di motilità. Scorrere, o vortice l'aliquota per distribuire in modo omogeneo le sostanze chimiche.
Quindi, aggiungere 1 microliter di soluzione di chinina preparata alla soluzione di motilità, in modo che la concentrazione finale sia di 20 nanomolari. Aggiungere 10 microlitri della soluzione MT100 alla soluzione di motilità. Per le celle di flusso, utilizzare sia un ampio coverslip che un piccolo coverslip.
Risciacquare tutti i copricapo due volte con etanolo e due volte con acqua ultrapura. Sonicare i copripavimenti lavati in acqua ultrapura per 5 minuti. Quindi, asciugare i copricapo in un forno a una temperatura compresa tra 50 e 75 gradi Celsius.
Utilizzare un detergente UV-ozono per trattare un lato di ogni coverlip per 15 minuti a temperatura ambiente e in normali condizioni atmosferiche. Utilizzando una pinzetta, capovolgere ogni coverslip e utilizzare UV-ozono per trattare anche il lato non trattato. Sonicare i copripasci trattati in acqua ultrapura per 5 minuti.
Quindi, asciugarli in un forno a una temperatura compresa tra 50 e 75 gradi Celsius. Successivamente, indossa equipaggiamento protettivo come delineato nel protocollo di testo. Immergere ogni coverslip in soluzione salina per 15 secondi.
Lavare le coverlips due volte in toluene e tre volte in metanolo. Utilizzare azoto pressurizzato per asciugare i copricapo. Una volta che i copricapo sono asciutti, tagliare un pezzo di nastro a doppia parte che è di 2 centimetri per 2,5 centimetri.
Tagliare questo pezzo a metà verticalmente in due strisce di 1 centimetro per 2,5 centimetri. Metti il grande copripazzo su un delicato tergicristallo e attacca le strisce del nastro ad esso, per quanto riguarda la lunghezza lungo i bordi per creare un'area di 1 centimetro per 2,5 centimetri tra i pezzi di nastro. Attaccare il piccolo coverslip sopra le strisce di nastro per completare l'assemblaggio della cella di flusso.
In primo luogo, scorrono circa 20 microlitri della soluzione PEG-PPG-PEG nella cella di flusso assemblata. Lasciare assorbire la soluzione sulla superficie per 5 minuti, quindi scambiare questa soluzione con 20 microlitri di tampone BRB80 tre volte facendo scorrere il buffer. Flusso 20 microlitri della soluzione di motilità nella cella di flusso.
Successivamente, sigillare i bordi della cella di flusso con grasso per evitare l'evaporazione se l'esperimento pianificato è più lungo di un'ora. Eseguire l'imaging utilizzando una microscopia a florescence interna totale di tipo oggettivo. Metti una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo.
Quindi, posizionare la cella di flusso sulla piattaforma del microscopio. E portare l'obiettivo fino a quando non ci sarà contatto tra l'olio sull'obiettivo e la cella di flusso. Utilizzare il sistema di copertura interblocco del microscopio per impedire la fuoriuscita di tutta la luce laser.
Quindi, accendi il laser e concentrati sulla superficie inferiore della cella di flusso usando un laser da 642 nanometri per immaginire i microtubuli e un laser da 488 nanometri per immaginire i motori della china GFP. Registra le immagini o i video di interesse. Le immagini possono essere registrate per tutto il tempo in cui c'è motilità nella cella di flusso.
In questo studio viene presentato un sistema attivo su scala nanometrica, che si autoassembla blocchi di costruzione debolmente vincolanti per costruire la propria traccia. Utilizzando la microscopia tirf, i microtubuli scorrevoli sono separatamente immagini dai motori a cinesinina. I microtubuli sono visibili all'eccitazione con un laser da 647 nanometri.
E la chiesina GFP è visibile quando eccitata con un laser da 488 nanometri. Il tempo tra l'eccitazione e la luce rossa e verde era inferiore a un secondo. Come si può vedere, i microtubuli scorrevoli accumulano motori di chinina dalla soluzione e li depositano sulla superficie.
I motori a cinesinina rimangono sulla scia dei microtubuli per un breve periodo di tempo prima di tornare in soluzione. È molto importante avere la corretta concentrazione di reagenti nell'antifadio della soluzione di motilità, altrimenti lo sbiancamento fotografico causerebbe il fallimento dell'esperimento. Questa tecnica apre la strada a un uso più efficiente dei motori proteici nei sistemi di ingegneria su scala nanometrica.
Quindi, consentendo la progettazione e lo studio di nanostrutture più complesse.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la costruzione di shuttle molecolari mediante l'uso di proteine motrici chinesina per spingere microtubuli marcati con un colorante. Il sistema permette un assemblaggio e un disassemblaggio dinamici mantenendo al contempo la funzionalità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biophysica
- Nanotecnologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- I trasportatori molecolari sono essenziali per comprendere i sistemi biologici su scala nanometrica.
- I motori della chinesina facilitano il movimento dei microtubuli nei processi cellulari.
- L'equilibrio dinamico nei sistemi su scala nanometrica può portare a proprietà autoriparanti.
- I protocolli di sicurezza sono fondamentali per condurre esperimenti che coinvolgono questi componenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per lo studio di sistemi a scala nanometrica in equilibrio dinamico.
- Colmare il divario tra strutture biologiche ingegnerizzate e naturali.
- Esplorare l'autoassemblaggio e la motilità di microtubuli spinti da motori chinesina.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del buffer per la crescita dei microtubuli e delle soluzioni di stabilizzazione.
- Assemblaggio delle cellule di flusso utilizzando coprioggetti trattati.
- Acquisizione di immagini mediante microscopia a fluorescenza a riflessione totale.
- Registrazione della motilità dei microtubuli e dei motori chinesina.
Risultati principali
- I microtubuli sono stati correttamente visualizzati e si è dimostrato che accumulano motori chinesina.
- Il sistema ha dimostrato un assemblaggio e un disassemblaggio dinamici dei componenti.
- Concentrazioni corrette dei reagenti erano fondamentali per prevenire lo sbiancamento fotoindotto.
- La tecnica consente la progettazione di nanostrutture più complesse.
Conclusioni
- Questo protocollo facilita lo studio di sistemi a scala nanometrica con proprietà dinamiche.
- Migliora la comprensione delle interazioni molecolari nei sistemi ingegnerizzati.
- I risultati aprono la strada a future ricerche nel campo della nanotecnologia e della biofisica.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente lo studio di sistemi dinamici su scala nanometrica in cui componenti molecolari si assemblano e disassemblano in equilibrio, offrendo un modello per la riduzione del rischio meccanicistico nella validazione precoce di bersagli. Mimando il trasporto biologico mediante proteine motrici reversibilmente legate, esso garantisce un'elevata affidabilità predittiva nei saggi di screening che richiedono un movimento sostenuto e riproducibile. Il sistema fornisce una piattaforma rilevante per le malattie per valutare gli effetti dei composti sulla dinamica del citoscheletro, senza immobilizzazione permanente.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione delle proteine motrici e della dinamica delle interazioni con i microtubuli in condizioni quasi fisiologiche.
- Valore operativo: Permette l'assemblaggio reversibile e rinnovabile di complessi attivi per cicli ripetuti di test.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una lettura quantitativa del movimento dei microtubuli e del reclutamento dei motori mediante microscopia TIRF.
- Valore operativo: Permette la rilevazione in tempo reale, basata su marcatori, sia delle proteine di carico che dei motori proteici nello stesso saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella i meccanismi di trasporto del citoscheletro rilevanti per le vie patologiche delle malattie neurodegenerative e proliferative.
- Valore operativo: Consente la valutazione delle variazioni indotte da composti nella motilità e nella cinetica del distacco dei motori molecolari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui l'interazione con la proteina bersaglio e gli esiti funzionali sono prioritari rispetto all'ottimizzazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi riguardo alle interazioni tra motori e carichi e la modulazione dei percorsi.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili del movimento, essenziali per la validazione dei risultati positivi.
- Analisi: Permette di correlare il tempo di permanenza del motore sulla superficie con la velocità dei microtubuli e la lunghezza del percorso.
- Ricerca traslazionale: Si collega a modelli preclinici di difetti nel trasporto assonico attraverso letture funzionali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare per testare diversi tipi di proteine motrici o composti associati ai microtubuli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica separando il legame del motore dall'ancoraggio permanente alla superficie.
- Valore operativo: Garantisce la stabilità del saggio mediante il continuo rifornimento di motori attivi dalla soluzione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di tipo go/no-go fornendo dati funzionali dinamici basati sull'equilibrio.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio di bersagli coinvolti nei percorsi di trasporto intracellulare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella purificazione delle proteine, nella manipolazione dei microtubuli e nella microscopia TIRF.
- Presuppone l'accesso a microscopi a fluorescenza dotati di eccitazione a doppio laser e controllo ambientale.
- Necessita di una passivazione superficiale standardizzata e di un assemblaggio accurato della cella a flusso per ridurre al minimo il legame non specifico.
- Implica l'ottimizzazione delle concentrazioni di motori molecolari e microtubuli per mantenere un equilibrio dinamico.
- È limitato dai rischi di fotodegradazione se i reagenti antifade non sono formulati con precisione.
