Metodo di impalamento dei microelettrodi per registrare il potenziale della membrana da un'arteria cerebrale media cannulata

Questo protocollo può essere utilizzato per misurare il potenziale di membrana dei vasi sanguigni normali e masi e per valutare gli agenti farmacologici che modulano il potenziale della membrana, il tono vascolare e il flusso sanguigno. I potenziali di membrana generati da questa tecnica sono vicini all'intervallo fisiologico poiché i muscoli lisci vascolari all'interno di un vaso sono in un sincrezio. Prima di iniziare la procedura, posizionare un amplificatore elettrometro differenziale a doppio canale vicino alla camera del contenitore nella posizione desiderata.

Utilizzare un cavo BNC-BNC per collegare l'uscita del canale amplificatore A o B all'ingresso del canale del digitalizzatore. Montare la sonda nel micromanipolatore e ruotare il micromanipolatore verso il microscopio e il miografo su un tavolo privo di vibrazioni. Posizionare le manopole e gli interruttori sulla parte anteriore dell'amplificatore nelle posizioni appropriate per l'esperimento, come descritto nel manuale.

Quindi collegare il terreno del bagno al terreno del circuito dell'amplificatore con un elettrodo appropriato e assicurarsi che la gabbia sia messa a terra sul telaio dell'amplificatore. Per preparare i microelettrodi in vetro borosilicato, utilizzare un estrattore standard per ottenere un cono corto, graduale, da otto a 10 millimetri con un diametro inferiore a un micrometro, looping due volte per resistenze più elevate e punte più piccole. Utilizzare una siringa in microfibra per riempire il microelettrodo con cloruro di potassio trimolare, ritraendo lentamente lo stantuffo durante l'iniezione per consentire al fluido di riempirsi e prevenire la formazione di bolle all'interno del microelettrodo.

Posizionare il microelettrodo completamente caricato sul supporto del microelettrodo e spingere con attenzione ma fermezza il gambo dell'elettrodo nel supporto attraverso il foro annoiato. Rimuovere il liquido in eccesso con un tessuto da laboratorio e collegare l'assieme del supporto dell'elettrodo alla sonda dell'amplificatore. Eseguire un test dell'elettrodo per misurare la resistenza dell'elettrodo.

Quindi aprire il software di registrazione, assegnare un nome al file e salvare il file per l'analisi futura. Successivamente, sciacquare la camera del miografo con acqua distillata più volte prima di caricare la camera con cinque millilitri di normale soluzione fisiologica di sale, o PSS. Utilizzando una siringa da cinque o 10 millilitri, riempire sia le cannule di vetro che i tubi collegati con PSS normale filtrato senza introdurre bolle d'aria e utilizzare forcette smussate per fare un mezzo nodo in due suture di nylon monofilamento 10-0.

Quindi, utilizzando le forcep di dissezione sotto un microscopio a dissezione, posizionare i nodi di sutura parzialmente chiusi su entrambe le cannule leggermente lontano dalle punte. Per l'isolamento dell'arteria cerebrale media, utilizzare forbici e forcep a molla per identificare e sezionare un segmento non trasfebbato dell'arteria cerebrale centrale, con un diametro interno di 100-200 micrometri, del cervello del topo. Utilizzare forcep fini per montare l'arteria cerebrale centrale sulle cannule di vetro e stringere le suture per fissare l'arteria alla cannula.

Chiudere la cannula distale in modo che non ci sia alcun flusso all'interno dell'arteria e collegare la pipetta di afflusso a un serbatoio di PSS. Visualizza l'arteria cerebrale centrale cannulata utilizzando una telecamera del dispositivo ad accoppiamento di carica montata su un microscopio invertito e un software di imaging. Impostare la lunghezza assiale dell'MCA su una lunghezza approssimativa in modo che non appaia né rigida né flaccide.

Equilibrare la soluzione da bagno con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Immergere il terreno dell'amplificatore nel PSS del miografo. Illuminare la camera del recipiente e visualizzare la punta del microelettrodo nella soluzione da bagno attraverso il microscopio.

Usando il micromanipolatore, spostare la punta del microelettrodo vicino alla parete esterna del vaso sanguigno e iniziare la registrazione. Spostare lentamente la punta del microelettrodo verso la nave, mirando al centro della nave. Quando la punta arriva in prossimità del vaso, far avanzare l'elettrodo in avanti in un movimento rapido per impalare la membrana del muscolo.

Una volta penetrata la membrana, si possono osservare cambiamenti nel potenziale della membrana. Non toccare il micromanipolatore una volta che la membrana è stata impastata. Una volta registrati i potenziali cambiamenti della membrana, utilizzare il manipolatore per rimuovere il microelettrodo in un movimento rapido e interrompere la registrazione prima di salvare i file di dati.

L'impalamento è considerato un successo quando c'è una rapida deflessione verso valori negativi, il potenziale della membrana è stabile per un minimo di 30 secondi e la tensione ritorna bruscamente a zero millivolt al momento della rimozione dell'elettrodo. Dopo un'impalazione di successo e una stabilizzazione potenziale della membrana, i farmaci di interesse possono essere perfusi nel bagno e possono essere registrati cambiamenti nel potenziale della membrana. In questo esperimento rappresentativo, la perfusione con cloruro di potassio depolarizzò la membrana di circa sei millivolt, mentre la perfusione con un attivatore dipendente dal calcio di grandi canali di potassio attivati dal calcio conduttivo iperpolarizzò la membrana di quasi quattro millivolt.

La cosa più importante da ricordare è tirare microelettrodi altamente resistenti che hanno un cono corto e graduale con un diametro inferiore a un micrometro.