Osservazione in tempo reale della DNA Strand Exchange reazione mediata da Rad51
February 13th, 2019
Fluorescenza risonanza energia basati su trasferimento osservazione in tempo reale sistemi del DNA strand reazione di scambio mediato da Rad51 sono stati sviluppati. Utilizzando i protocolli presentati qui, siamo in grado di rilevare la formazione di intermedi di reazione e loro conversione in prodotti, mentre si analizza anche la cinetica enzimatica della reazione.
Questo metodo può aiutare a decifrare i passaggi nello scambio di filamenti di DNA e rivela i ruoli molecolari di diverse proteine coinvolte nella combinazione durante la riparazione. Con questa tecnica possiamo monitorare lo scambio di filamenti di DNA in tempo reale senza alcuna interruzione della reazione e utilizzare la sala operatoria per determinare la cinetica di ogni fase di reazione. Con alcune piccole regolazioni, questa tecnica può essere applicata per studiare le attività delle proteine purificate di ricombinazione derivate da altre specie, come mammiferi e piante.
A dimostrare la procedura sarà Kentaro Ito, un Post Doc del mio laboratorio. Per iniziare, preparare il buffer di reazione A in base al protocollo di testo. Quindi, aggiungere 36 nanomole 16FA-oligonucleotide al tampone per il test di accoppiamento del DNA.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere la proteina RAD-51 a una concentrazione finale di 1,5 micro talpe alla miscela e incubarla a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere la proteina SWI5-SFR1 a una concentrazione finale di 0,15 micro talpe alla miscela e incubarla a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti.
Trasferire 1,5 millilitri della miscela in una cuvetta al quarzo da 1,0 per 1,0 cm contenente un agitatore magnetico. Inserire la cuvetta in uno spettrofluorometro e procedere alla regolazione del regolatore di temperatura e dell'agitatore magnetico. Registrare il cambiamento nell'emissione di fluorescenza FAM a 525 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri a intervalli di un secondo per 100 secondi.
Infine, con una siringa, iniettare IL DNA a doppio filamento etichettato ROX ad una concentrazione finale di 36 nano talpe nella cuvetta. Registrare la variazione dell'emissione di fluorescenza a intervalli di un secondo per 30 minuti. Per confrontare gli spettri di fluorescenza tra i substrati e i prodotti finali, inserire ogni cuvetta contenente i 16 FA-oligonucleotidi con o senza RAD-51 in uno spettrofluorometro e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, registrare l'emissione di fluorescenza FAM a 500-600 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri. Per testare l'effetto di RAD-51 sugli spettri di fluorescenza, aggiungere RAD-51 ad una concentrazione finale di 1,5 micro talpe. E incubare la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Infine, registrare gli spettri di fluorescenza da 500 a 600 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri. La massima efficienza FRET si ottiene misurando la massima riduzione dell'intensità di fluorescenza quando tutto il substrato di DNA a singolo filamento viene convertito in DNA a doppio filamento nel saggio di accoppiamento. Oppure misurando l'aumento massimo dell'intensità quando tutto il substrato di DNA a doppio filamento viene convertito in DNA a singolo filamento nel saggio di spostamento.
In entrambi i test, l'aggiunta della proteina RAD-51 non ha influenzato l'emissione di fluorescenza della FAM, o la sua efficienza di tempra da parte delle rocce. Gli effetti delle reazioni spontanee tra i DNA del substrato e il successivo sbiancamento fotografico sono piccoli. Come dimostrano le variazioni trascurabili nell'emissione di FAM senza RAD-51, rispetto alle sostanziali variazioni osservate con RAD-51.
L'aggiunta del complesso SWI5-SFR1 stimola fortemente l'attività di accoppiamento di RAD-51. La reazione di accoppiamento è simulata usando un modello a tre fasi, costituito dalla formazione del primo intermedio a tre filamenti, dalla transizione nel secondo intermedio e dal rilascio del DNA a singolo filamento e dalla formazione dell'etero duplex. Un confronto del modello in tre step con un modello in due step indica che il modello in tre step è più adatto per simulare l'accoppiamento del DNA, senza o con il complesso SWI5-SFR1.
La costante di equilibrio calcolata di ogni fase di reazione, con o senza SWI5-SFR1, mostra che il complesso SWI5-SFR1 non stimola la formazione del primo intermedio a tre filamenti, ma stimola fortemente la transizione tra i due intermedi a tre filamenti e il rilascio di DNA SS. È essenziale verificare che ogni lotto di proteine purificate sia privo di nucleasi e contaminazione da elicase.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'osservazione in tempo reale delle reazioni di scambio di filamenti di DNA mediate da Rad51 utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza. La tecnica consente il rilevamento di intermedi di reazione e l'analisi della cinetica enzimatica senza interrompere la reazione.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biochimica
- Biologia molecolare
- Genetica
Sfondo
- Lo scambio di filamenti di DNA è un processo cruciale nella riparazione del DNA.
- Rad51 svolge un ruolo significativo nella ricombinazione omologa.
- Comprendere la cinetica di questa reazione può fornire informazioni sui meccanismi di riparazione del DNA.
- Le tecniche di monitoraggio in tempo reale migliorano lo studio di questi complessi processi biochimici.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un sistema per osservare lo scambio di filamenti di DNA in tempo reale.
- Analizzare i ruoli di diverse proteine nella reazione.
- Determinare la cinetica di ogni fase nel processo di scambio di filamenti di DNA.
Metodi utilizzati
- Preparazione di buffer di reazione e oligonucleotidi per saggi di accoppiamento del DNA.
- Incubazione delle proteine RAD-51 e SWI5-SFR1 con substrati di DNA.
- Utilizzo di uno spettrofluorimetro per monitorare i cambiamenti di fluorescenza.
- Analisi di intermedi e prodotti di reazione attraverso misurazioni di emissione di fluorescenza.
Risultati principali
- L'aggiunta di SWI5-SFR1 stimola significativamente l'attività di accoppiamento di RAD-51.
- Un modello a tre fasi si adatta meglio alla simulazione di accoppiamento del DNA rispetto a un modello a due fasi.
- Lo studio fornisce dati quantitativi sulla cinetica dello scambio di filamenti di DNA.
- Le misurazioni di fluorescenza hanno indicato effetti minimi dalle reazioni spontanee.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato consente un'analisi cinetica dettagliata dello scambio di filamenti di DNA.
- SWI5-SFR1 migliora l'efficienza di RAD-51 nell'accoppiamento del DNA.
- Questa tecnica può essere adattata per studiare proteine di ricombinazione di varie specie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Real-time observation of DNA strand exchange mediated by Rad51 provides a quantitative framework for evaluating recombination protein function, supporting target validation in DNA repair pathways. The FRET-based assay enables kinetic de-risking of mechanistic hypotheses by resolving transient intermediates, informing lead identification for modulators of homologous recombination. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking protein activity to functional DNA repair outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Rad51-mediated strand exchange to validate therapeutic targets in DNA repair pathways.
- Operational Value: Resolves formation and maturation of three-strand DNA intermediates, clarifying mechanism of action for accessory proteins like Swi5-Sfr1.
- Predictive Value: Supports three-step kinetic modeling that improves confidence in target engagement and pathway modulation predictions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts to measure strand exchange kinetics under varying protein conditions.
- Operational Value: Establishes a homogeneous, solution-based assay format compatible with spectrofluorometric detection for compound screening.
- Assay Readiness: Enables real-time monitoring without reaction disruption, supporting dose-response and time-course analyses for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Facilitates cross-species comparison of recombination protein activity, supporting extrapolation from model systems to human homologs.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes effects of accessory proteins on specific reaction steps, reducing ambiguity in mechanism-based biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Provides a standardized method to assess functional conservation of Rad51 regulators across species, informing target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where kinetic profiling of DNA repair proteins informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how Swi5-Sfr1 stimulates intermediate maturation and ssDNA release in Rad51-mediated strand exchange.
- Screening: Delivers reproducible, real-time FRET signals that enable comparison of inhibitor or activator effects on reaction kinetics.
- Analytics: Provides step-resolved rate constants and equilibrium constants that allow quantitative comparison of protein variants or conditions.
- Translational Research: Enables assessment of evolutionary conservation by applying the assay to recombination proteins from mammals and plants.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing recombinase activity, reducing redundant assay development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving transient intermediates and defining rate-limiting steps.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible kinetic data through real-time fluorescence monitoring in a cuvette-based format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying how accessory proteins modulate specific steps of strand exchange, reducing mechanistic uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets based on quantitative kinetic profiles and evolutionary conservation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence spectroscopy, and kinetic data analysis.
- Dependent on access to a temperature-controlled spectrofluorometer with magnetic stirring and syringe injection capability.
- Necessitates standardized protein preparation to exclude nuclease and helicase contaminants that could confound reaction interpretation.
- Requires optimization of oligonucleotide labeling and concentration for each target species to ensure detectable FRET signals.
- Limited to in vitro systems; does not capture chromatin or nuclear context effects present in vivo.
