Osservazione in tempo reale della DNA Strand Exchange reazione mediata da Rad51
13 febbraio 2019
Fluorescenza risonanza energia basati su trasferimento osservazione in tempo reale sistemi del DNA strand reazione di scambio mediato da Rad51 sono stati sviluppati. Utilizzando i protocolli presentati qui, siamo in grado di rilevare la formazione di intermedi di reazione e loro conversione in prodotti, mentre si analizza anche la cinetica enzimatica della reazione.
Questo metodo può aiutare a decifrare i passaggi nello scambio di filamenti di DNA e rivela i ruoli molecolari di diverse proteine coinvolte nella combinazione durante la riparazione. Con questa tecnica possiamo monitorare lo scambio di filamenti di DNA in tempo reale senza alcuna interruzione della reazione e utilizzare la sala operatoria per determinare la cinetica di ogni fase di reazione. Con alcune piccole regolazioni, questa tecnica può essere applicata per studiare le attività delle proteine purificate di ricombinazione derivate da altre specie, come mammiferi e piante.
A dimostrare la procedura sarà Kentaro Ito, un Post Doc del mio laboratorio. Per iniziare, preparare il buffer di reazione A in base al protocollo di testo. Quindi, aggiungere 36 nanomole 16FA-oligonucleotide al tampone per il test di accoppiamento del DNA.
Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere la proteina RAD-51 a una concentrazione finale di 1,5 micro talpe alla miscela e incubarla a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere la proteina SWI5-SFR1 a una concentrazione finale di 0,15 micro talpe alla miscela e incubarla a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti.
Trasferire 1,5 millilitri della miscela in una cuvetta al quarzo da 1,0 per 1,0 cm contenente un agitatore magnetico. Inserire la cuvetta in uno spettrofluorometro e procedere alla regolazione del regolatore di temperatura e dell'agitatore magnetico. Registrare il cambiamento nell'emissione di fluorescenza FAM a 525 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri a intervalli di un secondo per 100 secondi.
Infine, con una siringa, iniettare IL DNA a doppio filamento etichettato ROX ad una concentrazione finale di 36 nano talpe nella cuvetta. Registrare la variazione dell'emissione di fluorescenza a intervalli di un secondo per 30 minuti. Per confrontare gli spettri di fluorescenza tra i substrati e i prodotti finali, inserire ogni cuvetta contenente i 16 FA-oligonucleotidi con o senza RAD-51 in uno spettrofluorometro e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, registrare l'emissione di fluorescenza FAM a 500-600 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri. Per testare l'effetto di RAD-51 sugli spettri di fluorescenza, aggiungere RAD-51 ad una concentrazione finale di 1,5 micro talpe. E incubare la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Infine, registrare gli spettri di fluorescenza da 500 a 600 nanometri all'eccitazione a 493 nanometri. La massima efficienza FRET si ottiene misurando la massima riduzione dell'intensità di fluorescenza quando tutto il substrato di DNA a singolo filamento viene convertito in DNA a doppio filamento nel saggio di accoppiamento. Oppure misurando l'aumento massimo dell'intensità quando tutto il substrato di DNA a doppio filamento viene convertito in DNA a singolo filamento nel saggio di spostamento.
In entrambi i test, l'aggiunta della proteina RAD-51 non ha influenzato l'emissione di fluorescenza della FAM, o la sua efficienza di tempra da parte delle rocce. Gli effetti delle reazioni spontanee tra i DNA del substrato e il successivo sbiancamento fotografico sono piccoli. Come dimostrano le variazioni trascurabili nell'emissione di FAM senza RAD-51, rispetto alle sostanziali variazioni osservate con RAD-51.
L'aggiunta del complesso SWI5-SFR1 stimola fortemente l'attività di accoppiamento di RAD-51. La reazione di accoppiamento è simulata usando un modello a tre fasi, costituito dalla formazione del primo intermedio a tre filamenti, dalla transizione nel secondo intermedio e dal rilascio del DNA a singolo filamento e dalla formazione dell'etero duplex. Un confronto del modello in tre step con un modello in due step indica che il modello in tre step è più adatto per simulare l'accoppiamento del DNA, senza o con il complesso SWI5-SFR1.
La costante di equilibrio calcolata di ogni fase di reazione, con o senza SWI5-SFR1, mostra che il complesso SWI5-SFR1 non stimola la formazione del primo intermedio a tre filamenti, ma stimola fortemente la transizione tra i due intermedi a tre filamenti e il rilascio di DNA SS. È essenziale verificare che ogni lotto di proteine purificate sia privo di nucleasi e contaminazione da elicase.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'osservazione in tempo reale di reazioni di scambio del filamento del DNA mediate da Rad51 mediante trasferimento di energia di risonanza fluorescente. La tecnica consente la rilevazione di intermedi reattivi e l'analisi della cinetica enzimatica senza interrompere la reazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Biologia molecolare
- Genetica
Sfondo
- Lo scambio di filamenti di DNA è un processo cruciale nella riparazione del DNA.
- Rad51 svolge un ruolo significativo nella ricombinazione omologa.
- Comprendere la cinetica di questa reazione può fornire informazioni sui meccanismi di riparazione del DNA.
- Le tecniche di monitoraggio in tempo reale migliorano lo studio di questi complessi processi biochimici.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema per osservare lo scambio di filamenti del DNA in tempo reale.
- Analizzare i ruoli delle diverse proteine nella reazione.
- Determinare la cinetica di ciascun passaggio del processo di scambio di filamenti del DNA.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del buffer di reazione e degli oligonucleotidi per saggi di appaiamento del DNA.
- Incubazione delle proteine RAD-51 e SWI5-SFR1 con substrati di DNA.
- Utilizzo di un fluorimetro spettrale per monitorare le variazioni di fluorescenza.
- Analisi degli intermedi e dei prodotti di reazione mediante misurazioni dell'emissione di fluorescenza.
Risultati principali
- L'aggiunta di SWI5-SFR1 stimola significativamente l'attività di appaiamento di RAD-51.
- Un modello a tre passaggi si adatta meglio alla simulazione dell'appaiamento del DNA rispetto a un modello a due passaggi.
- Lo studio fornisce dati quantitativi sulla cinetica dello scambio dei filamenti di DNA.
- Misurazioni di fluorescenza hanno indicato effetti minimi derivanti da reazioni spontanee.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato consente un'analisi cinetica dettagliata dello scambio di filamenti del DNA.
- SWI5-SFR1 aumenta l'efficienza di RAD-51 nell'appaiamento del DNA.
- Questa tecnica può essere adattata per lo studio di proteine della ricombinazione di diverse specie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'osservazione in tempo reale dello scambio di filamenti del DNA mediato da Rad51 fornisce un quadro quantitativo per valutare la funzione delle proteine coinvolte nella ricombinazione, supportando la validazione degli obiettivi nelle vie di riparazione del DNA. Il saggio basato sul FRET permette di ridurre il rischio cinetico delle ipotesi meccanicistiche risolvendo intermedi transitori, guidando l'identificazione di composti promettenti per la modulazione della ricombinazione omologa. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando l'attività proteica a risultati funzionali nella riparazione del DNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dello scambio di filamento mediato da Rad51 per convalidare bersagli terapeutici nei percorsi di riparazione del DNA.
- Valore operativo: Permette di risolvere la formazione e la maturazione degli intermedi di DNA a tre filamenti, chiarificando il meccanismo d'azione di proteine accessorie come Swi5-Sfr1.
- Valore predittivo: Supporta la modellizzazione cinetica in tre passaggi, migliorando la fiducia nelle previsioni relative al legame con il bersaglio e alla modulazione del percorso.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di fluorescenza per misurare la cinetica dello scambio di filamento in condizioni proteiche variabili.
- Valore operativo: Stabilisce un formato di saggio omogeneo, basato su soluzione, compatibile con la rilevazione spettrofluorimetrica per lo screening di composti.
- Prontezza del saggio: Permette il monitoraggio in tempo reale senza interruzione della reazione, supportando analisi dose-risposta e analisi temporali per la validazione dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Facilita il confronto interspecie dell'attività delle proteine di ricombinazione, supportando l'estrapolazione da sistemi modello a omologhi umani.
- De-risking meccanicistico: Distingue gli effetti delle proteine accessorie su specifici passaggi della reazione, riducendo l'ambiguità nell'allineamento dei biomarcatori basati sul meccanismo.
- Continuità preclinica: Fornisce un metodo standardizzato per valutare la conservazione funzionale dei regolatori di Rad51 attraverso le specie, orientando la selezione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in cui il profilo cinetico delle proteine di riparazione del DNA orienta le decisioni di avanzamento o interruzione prima dell'investimento preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando in che modo Swi5-Sfr1 stimola la maturazione dell'intermedio e il rilascio di ssDNA nello scambio di filamento mediato da Rad51.
- Screening: Fornisce segnali FRET in tempo reale riproducibili che permettono di confrontare gli effetti di inibitori o attivatori sulla cinetica della reazione.
- Analisi: Fornisce costanti di velocità risolte per singolo passaggio e costanti di equilibrio che consentono il confronto quantitativo tra varianti proteiche o condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Permette la valutazione della conservazione evolutiva applicando il saggio a proteine della ricombinazione di mammiferi e piante.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la caratterizzazione dell'attività ricombinasi, riducendo lo sviluppo ridondante di saggi in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi risolvendo intermedi transitori e definendo i passaggi limitanti della velocità.
- Valore operativo: Fornisce dati cinetici standardizzati e riproducibili mediante monitoraggio in tempo reale della fluorescenza in un formato basato su cuvetta.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto quantificando come le proteine accessorie modulano passaggi specifici dello scambio di filamento, riducendo l'incertezza meccanicistica.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli nella riparazione del DNA in base a profili cinetici quantitativi e dati di conservazione evolutiva, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella purificazione delle proteine, nella spettroscopia di fluorescenza e nell'analisi dei dati cinetici.
- È subordinato all'accesso a uno spettrofluorimetro con controllo termico, agitazione magnetica e capacità di iniezione tramite siringa.
- Necessita di una preparazione standardizzata delle proteine per escludere contaminanti nucleasici ed elicasi che potrebbero alterare l'interpretazione delle reazioni.
- Richiede l'ottimizzazione dell'etichettatura e della concentrazione degli oligonucleotidi per ciascuna specie bersaglio, al fine di garantire segnali FRET rilevabili.
- È limitato ai sistemi in vitro; non tiene conto degli effetti legati al contesto della cromatina o nucleare presenti in vivo.
