Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale

Questo modello di topo di occlusione a due vasi di ischemia cerebrale-riperfusione può indagare la fisiopatologia dell'ictus. Questo modello indurrà un volume infarto stabile della maggior parte del cervello che si infiltra nelle cellule immunitarie nel cervello ischemico e il deficit comportamentale dopo l'ischemia cerebrale-riperfusione. In questo modello, un infarto è causato nelle aree corticali e il tasso di mortalità è basso.

Poiché il modello di riperfusione MCAO di legatura richiede craniotomia per esporre le dimensioni dell'MCA distale, la dimensione può essere facilmente confermata e l'esame se il flusso sanguigno nell'MCAO distale viene interrotto durante la procedura è semplice. Fornire ai topi libero accesso all'acqua e al cibo fino all'intervento chirurgico. Autoclavare gli strumenti chirurgici e utilizzare il 70% di etanolo per sanificare il tavolo e le attrezzature chirurgiche.

Dopo aver anestetizzato un mouse di otto-12 settimane, assicurarsi che non abbia un riflesso del pedale quando testato utilizzando un dito fermo. Utilizzare unguento veterinario per prevenire la secchezza degli occhi mentre il mouse è in anestesia. Per monitorare la pressione sanguigna, rimuovere prima i capelli, quindi utilizzare un sistema di pressione sanguigna non invasivo e un sistema di monitoraggio fisiologico per monitorare la temperatura rettale e i gas arteriosi del sangue.

Iniettare il topo per via sottocutanea con un antibiotico profilattico. Quindi, posizionare il mouse in posizione supina sulla pastiglia riscaldante. Per esporre la pelle, utilizzare le tosaerba elettriche per radere la pelliccia sulla regione del collo ventrale e nella regione tra l'occhio destro e l'orecchio destro.

Cancellare la pelliccia dal corpo dell'animale con crema epilante e disinfettare il sito chirurgico con il 70% di etanolo. Quindi tagliare un'incisione della linea mediana lunga un centimetro al collo usando le forbici dell'iride. Con le flessioni dell'iride, sezionare attentamente la comune arteria carotide libera dai nervi del vago senza causare lesioni fisiche e utilizzare suture di seta 5-0 per isolare l'arteria.

Quindi, usa le forbici dell'iride per fare un'incisione di 0,3 centimetri nel cuoio capelluto nel punto centrale tra l'occhio destro e l'orecchio destro. Usando micro forbici, tagliare il muscolo temporalis per esporre l'osso zigomatico e squamoso. Posizionare il mouse sotto un microscopio stereo sezionato e utilizzare un micro trapano per creare un foro di due millilitri direttamente sull'arteria cerebrale centrale distale sul lato destro.

Utilizzare una sutura 10-0 per ligare il tronco dell'MCA distale sul lato destro e utilizzare una clip di aneurisma nontraumatico per occludere il CCA sul lato destro. Dopo la durata desiderata dell'ischemia, rimuovere la clip di sutura e aneurisma per ripristinare il flusso sanguigno all'MCA e al CCA. Utilizzare una clip di sutura per sigillare l'incisione cutanea sulla testa e sigillare le incisioni della pelle cervicale con colla chirurgica.

Iniettare buprenorfina per via sottocutanea per alleviare il dolore. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 36,5 più o meno 0,5 gradi Celsius sulla pastiglia riscaldante e non lasciare incustodita o restituirla alla compagnia di altri animali fino a quando non viene completamente recuperata dall'anestesia. Infine, posizionare il mouse nella gabbia dell'autoclave in modo che possa accedere liberamente all'acqua e al cibo dopo che si è completamente ripreso.

Usa le forbici dell'iride per fare un'incisione nella pelle della testa del topo anestetizzato e decapitato per esporre il cranio. Quindi utilizzare forbici operative per tagliare la parte anteriore dell'osso frontale e, con le forbici dell'iride, tagliare il cranio lungo la sutura sagittale. Con un rongeur osseo, mettere da parte l'osso frontale e parietale ed esporre il cervello.

Rimuovere il cervello e posizionarlo in una matrice cerebrale del topo. Utilizzare lamette da barba per ottenere fette coronali da due millilitri e posizionarle in tubi da 50 millilitri riempiti con cinque millilitri di 2%TTC. Quando si utilizza la matrice cerebrale del topo per ottenere fette coronali, la dimensione di taglio dovrebbe essere la stessa in cervelli diversi.

La dimensione del taglio influisce sulle dimensioni delle fette cerebrali, che influenzano anche il calcolo delle dimensioni infariche. Macchiare le fette cerebrali con 2%TTC e 1X PBS per 10 minuti a 37 gradi Celsius, quindi risciacquare due volte con 10%formalina. Fissare le fette cerebrali in formalina al 10% a temperatura ambiente per 24 ore.

Dopo aver asciugato le fette cerebrali sulla carta velina per assorbire la formalina in eccesso, disporle su uno scivolo di plastica pulito, orientandole dal rostrale al caudale e coprirle con un altro scivolo di plastica pulito. Eseguire la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner. Capovolgere la diapositiva e scansionare il retro.

Utilizzare il software ImageJ per calcolare l'area di infarto di ogni sezione, aprendo prima il file di immagine e impostando la scala per l'immagine. Quindi usa la selezione a mano libera per selezionare l'area infarct e usa il gestore del ROI delle aree di interesse per misurare l'area di interesse. Infine, sommare le aree infarct per ogni sezione, e moltiplicare il risultato per lo spessore della sezione per stimare il volume totale di infarto, quindi completare l'analisi statistica come descritto nel manoscritto.

L'aumento della durata dell'ischemia durante questa procedura di riperfusione MCAO ha prodotto diversi gradi di volume infarto indotto dall'ischemia e perdita neuronale nella corteccia cerebrale dell'area MCA destra. Inoltre, l'ischemia ha diminuito l'attività locomotoria dell'animale a 48 ore dopo la riperfusione mcao. Dopo l'ischemia cerebrale-riperfusione, una maggior parte delle cellule immunitarie periferiche si è infiltrata nell'emisfero ipsilaterale del cervello ischemico.

Inoltre, quando questo modello di occlusione a due navi è stato confrontato con il modello MCAO, i loro volumi infarto non erano significativamente diversi. Il micro trapano deve essere utilizzato con cura quando si crea un foro nel cranio. Con un'azione inappropriata, facile causare sanguinamento dall'MCA.

L'MCA non deve essere danneggiato e il sanguinamento deve essere evitato prima e dopo la procedura di legatura. L'occlusione MCA e lo stato di riperfusione possono essere controllati dal laser Doppler. Questo metodo può confermare le condizioni del flusso sanguigno di MCA.