Name: Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Scopri il modello di occlusione dei due vasi nel topo per studiare l'ischemia-riperfusione cerebrale. Questo metodo consente di analizzare il volume dell'infarto e le risposte immunitarie nel cervello ischemico.

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Questo lavoro è stato supportato dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan (più 106-2320-B-038-024, più 105-2221-E-038-007-MY3 e più 104-2320-B-424-001) e Taipei Medical University Hospital (107TMUH-SP-01). Questo manoscritto è stato modificato da Wallace accademico Editing.

Le commissioni di utilizzo di Academia Sinica e Taipei Medical University e istituzionale cura degli animali approvato questo protocollo per l'uso di animali da esperimento.
1. modello MCAO/riperfusione
<ol><li>Fornire i topi con libero accesso all'acqua e chow fino a quando l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Autoclave la chirurgica degli strumenti e igienizzare il tavolo operatorio e attrezzature utilizzando etanolo al 70%. Indossare una mascherina chirurgica e guanti sterili. Utilizzare uno sterilizzatore a secco perlina per sterilizzare gli strumenti chirurgici se gli ambulatori multipli del mouse saranno condotta in un esperimento.</li>
	<li>Anestetizzare un mouse a 12-week-old 8 (massa: 25 – 30 g) utilizzando 0,8% cloralio idrato, tramite un'iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che il mouse anestetizzato non hanno un riflesso pedale (come testate utilizzando un pizzico di punta costante) dopo l'amputate.</li>
	<li>Usare pomata veterinario per prevenire la secchezza dell'occhio per il mouse mentre è sotto anestesia.</li>
	<li>Utilizzare un sistema di pressione sanguigna non invasiva per monitorare la pressione sanguigna del mouse.</li>
	<li>Utilizzare un sistema di monitoraggio fisiologico per controllare la propria temperatura rettale e gas del sangue arterioso. Mantenere la temperatura corporea a 36,5 ± 0,5 ° C.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea il mouse con un antibiotico profilattico (25 mg/kg cefazolina)8.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella posizione supina il termoforo.</li>
	<li>Utilizzare tagliatori elettrici per esporre la pelle dalla rasatura pelliccia del mouse sulla regione ventrale del collo, così come nella regione tra l'occhio destro e l'orecchio destro.</li>
	<li>Usare crema epilatoria per cancellare la pelliccia dal corpo del mouse e disinfettare il sito chirurgico alternando scrbus con povidione-iodio ed etanolo al 70%.</li>
	<li>Usare forbici iris per tagliare un'incisione di 1 cm di lunghezza del midline al collo.</li>
	<li>Utilizzare pinze iris attentamente dissezionare il CCA libero dai nervi vago senza causare danni fisici.</li>
	<li>Utilizzare punti di sutura seta 5-0 per isolare il CCA.</li>
	<li>Fare un'incisione di 0,3 cm nel cuoio capelluto a metà tra l'occhio destro e l'orecchio destro.</li>
	<li>Utilizzare MICROFORBICE per tagliare il muscolo di temporalis per esporre l'osso zigomatico e squamosa.</li>
	<li>Sotto un microscopio per dissezione stereo, è possibile utilizzare un microdrill per creare un foro di diametro di mm 2 direttamente sopra la MCA distale di destra.</li>
	<li>Legare il tronco di destra distale MCA utilizzando una sutura 10 / 0.</li>
	<li>Occludere il CCA di destra utilizzando una clip di aneurysm nontraumatic.</li>
	<li>Dopo 10 o 40 min di ischemia, rimuovere la clip per aneurisma e sutura per ripristinare il flusso sanguigno alla MCA e CCA.</li>
	<li>Utilizzare una clip di sutura per sigillare l'incisione cutanea sulla testa.</li>
	<li>Sigillare le incisioni della pelle cervicale utilizzando una singola sutura seguita da chiusura della pelle del collo con sutura o fiocco9.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,1 mg/kg) per dolore sollievo9.</li>
	<li>Mantenere la temperatura corporea del mouse a 36,5 ± 0,5 ° C il termocuscino finché non ha completamente recuperato dalla anestesia. Non restituire l'animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali, finché non ha completamente recuperato. Non lasciare incustodito l'animale fino a quando non riprende conoscenza sufficiente.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella gabbia in autoclave in modo che può liberamente accedere acqua e chow dopo completamente ha recuperato.</li>
</ol>2. colorazione con cloruro di 2, 3,5-triphenyltetrazolium
<ol><li>Anestetizzare il mouse con 0,8% cloralio idrato tramite un'iniezione intraperitoneale.</li>
	<li>Usare le forbici operative per decapitare l'animale.</li>
	<li>Esporre il cranio utilizzando forbici iris per fare un'incisione nella pelle della testa.</li>
	<li>Usare le forbici operative per tagliare l'anteriore dell'osso frontale.</li>
	<li>Usare forbici iris per tagliare il cranio lungo la sutura sagittale.</li>
	<li>Utilizzare una Pinza ossivora osso per scostare il frontale e l'osso parietale ed esporre il cervello.</li>
	<li>Utilizzare pinze di iris per sezionare il cervello.</li>
	<li>Utilizzare una matrice di cervello di topo e lame di rasoio per ottenere fette coronali di 2 mm.</li>
	<li>Macchia le fette di cervello per 10 min a 37 ° C con 2% 2, 3,5-triphenyltetrazolium cloruro (TTC) in 1x tampone fosfato salino.</li>
	<li>Sciacquare il cervello 2 x con formalina al 10%.</li>
	<li>Difficoltà il cervello in formalina al 10% a temperatura ambiente per 24 h.</li>
</ol>3. misurazione della dimensione di infarto
<ol><li>Organizzare le sezioni su uno scivolo di plastica pulito e orientare le sezioni da rostral alla caudale.</li>
	<li>Eseguire la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner. Posizionare un righello metrico e assicurarsi che è visibile nell'immagine scansionata. Capovolgere la diapositiva e scansione lato inverso.</li>
	<li>Calcolare l'area di infarto di ogni sezione utilizzando il software ImageJ.<ol>
<li>Aprire il file di immagine e impostare la scala per l'immagine.</li>
		<li>Utilizzare selezione a mano libera per selezionare l'area di infarto.</li>
		<li>Utilizzare le aree di interesse (ROI) manager per misurare l'area di interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sommare le aree di infarto per ogni sezione e moltiplicare il risultato per lo spessore di sezione per stimare il volume di infarto totale.</li>
</ol>4. elaborazione statistica
<ol><li>Utilizzare GraphPad Prism 6 per determinare la significatività statistica con di Student t-test. Nota: Le barre di errore nei grafici bar rappresentano errori standard della media (SEMs).</li>
	<li>Uso G * potenza 3,1 per calcolare la dimensione del campione adeguata ed eseguire un analisi di potenza di10.</li>
</ol>

<ol><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+treatment%2C+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).</li>
<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8 (7), 401-410 (2012).</li>
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<li>Wang, S., Zhang, H., Dai, X., Sealock, R., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+architecture+underlying+variation+in+extent+and+remodeling+of+the+collateral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic architecture underlying variation in extent and remodeling of the collateral circulation.</a> Circulation Research. 107 (4), (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il modello di mouse MCAO/riperfusione è un modello animale comunemente impiegato per imitare l'ischemia transitoria in esseri umani. Questo modello animale può essere applicato ai ceppi di topi transgenici e knockout per studiare la patofisiologia del colpo. Diversi passaggi nel protocollo sono particolarmente critiche. (1) il microdrill deve essere utilizzato con attenzione quando si crea un buco nel cranio, con azione inappropriati facilmente causando sanguinamento da MCA. (2) la MCA non deve essere danneggiato e lo sp...

Modello del topo di ischemia-riperfusione cerebrale è uno degli approcci sperimentali più ampiamente usati per studiare la fisiopatologia della indotta da ischemia cerebrale lesioni1. Perché l'ischemia-riperfusione cerebrale attiva il sistema immunitario periferico, le cellule immuni periferiche infiltrano nel cervello ischemico e causano danno neuronale2. Così, un modello del mouse affidabile e riproducibile che imita ischemia-riperfusione cerebrale è necessaria per capire la patofisiologia del colpo.
I topi C57BL/6J (B6) sono il ceppo più comunemente utilizzato negli esperimenti di corsa perché essi possono facilmente essere geneticamente manipolati. Sono disponibili due modelli comuni di MCAO/riperfusione che imitano la condizione di ischemia-riperfusione cerebrale. Il primo è il modello del filamento intraluminal di MCAO prossimale, dove un filamento di silicio è impiegato per via intravascolare occludere il flusso di sangue nel MCA; il filamento d'occlusione viene successivamente rimosso per ripristinare il flusso di sangue3. Una durata breve occlusione si traduce in una lesione della regione subcortical, mentre una più lunga durata di occlusione provoca infarti nelle zone corticali e subcortical. Il secondo modello è il modello di legatura di MCAO distale, che coinvolge extravascular legatura del MCA e CCA per ridurre il flusso di sangue attraverso la MCA, dopo che il flusso sanguigno è ripristinato attraverso la rimozione della sutura e aneurysm clip4. In questo modello, un infarto è causato nelle aree corticali, e il tasso di mortalità è basso. Poiché la legatura del modello MCAO/riperfusione richiede craniectomy per esporre il sito del MCA distale, il sito può essere facilmente confermato e che esamina se il flusso di sangue nel MCA distale è interrotta durante la procedura è semplice.
B6 topi mostrano notevoli variazioni nell'anatomia del loro cerchio di Willis; Questo potrebbe influenzare il volume di infarto dopo ischemia-riperfusione cerebrale5,6,7. Attualmente, questo problema può essere superato attraverso la legatura del distale MCA8. In questo studio, si stabilisce un metodo per occludendo il flusso di sangue MCA e abilitazione riperfusione dopo un predeterminato periodo di ischemia. Occlusione del due-vaso del modello di ischemia-riperfusione cerebrale induce ischemia transitoria del territorio attraverso la legatura del MCA distale di destra e destra CCA, MCA con flusso sanguigno ripristinato dopo un certo periodo di ischemia. Questo modello MCAO/riperfusione induce un infarto di dimensione stabile, una massa di cervello-infiltrazione di cellule immunitarie nel cervello ischemico e un deficit comportamento dopo ischemia-riperfusione cerebrale4.

<table><tbody><tr><td>Rongeur osseo</td><td>Diener</td><td></td><td>Friedman</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma</td><td>B-044</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>Sigma</td><td>1097603</td><td></td></tr><tr><td>cloralio idrato</td><td>Sigma</td><td>C8383</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td></td></tr><tr><td>Tosatrici elettriche</td><td>Petpro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>Sigma</td><td>F5304</td><td></td></tr><tr><td>Germinatore sterilizzatore a secco per perline</td><td>Braintree Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze per iride</td><td>Karl Klappenecker</td><td></td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Forbici per iride</td><td>Diener</td><td></td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Forbici per iride STR</td><td>Karl Klappenecker</td><td></td><td>11 cm</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>Stoelting</td><td>FOREEDOM K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forbici-Vannas</td><td>HEISS</td><td>H-4240</td><td>lama 7mm, 8 cm</td></tr><tr><td>Matrice cerebrale</td><td>del topo World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di pressione sanguigna non invasivo</td><td>Muromachi</td><td>MK-2000ST</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative STR</td><td>Karl Klappenecker</td><td></td><td>14 cm</td></tr><tr><td>Sistema di monitoraggio fisiologico</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasoio lame</td><td>Scaldaroditori Stoelting sempre pronti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoelting</td><td></td><td>53810</td><td>Termoforo</td></tr><tr><td>Clip per sutura</td><td>Pinzette stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>IDEALTEK</td><td></td><td>No.3</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>15672</td><td>Colla chirurgica</td></tr><tr><td>10-0 sutura</td><td>UNIK</td><td>NT0410</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Trifeniltetrazolio cloruro</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr></tbody></table>

occlusione del vaso due mouse modello di ischemia-riperfusione cerebrale

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In questo studio, un modello di topo di occlusione dell'arteria cerebrale centrale (MCA) è impiegato per studiare il ischemia-riperfusione cerebrale. Un modello del topo riproducibili e affidabili è utile per studiare la fisiopatologia dell'ischemia-riperfusione cerebrale e determinazione potenziali strategie terapeutiche per i pazienti con ictus. Variazioni nell'anatomia del circolo di Willis di C57BL/6 topi colpisce il loro volume di infarto dopo lesione cerebrale indotta da ischemia. Gli studi hanno indicato che l'occlusione distale del MCA (MCAO) possa superare questo problema e sfociare in una dimensione di infarto stabile. In questo studio, stabiliamo un modello murino di occlusione del due-vaso di ischemia-riperfusione cerebrale mediante l'interruzione del flusso sanguigno per la MCA giusto. Abbiamo distalmente legare la MCA destra e dell'arteria carotica comune di destra (CCA) e ripristinare il flusso sanguigno dopo un certo periodo di ischemia. Questa lesione di ischemia-riperfusione induce un infarto di dimensione stabile ed un deficit comportamento. Cellule del sistema immunitarie periferico infiltrano cervello ischemico entro il periodo di infiltrazione 24h. Inoltre, la perdita di un neurone nella zona corticale è minore per un periodo più lungo di riperfusione. Pertanto, questo modello di occlusione del due-vaso è adatto per indagare la risposta immunitaria ed il recupero di un neurone durante il periodo di riperfusione dopo ischemia cerebrale.

Questa procedura MCAO/riperfusione prodotto un infarto corticale nelle vicinanze del MCA giusto e ha causato un deficit comportamento. Diversi gradi di volume di infarto indotto da ischemia (Figura 1AB) e la perdita di un neurone (Figura 1D) sono stati creati nella corteccia cerebrale di zona MCA a destra attraverso un aumento nella durata di legatura. Questo MCAO/riperfusione diminuita attività ...

Un modello murino di ischemia-riperfusione cerebrale è istituito per studiare la patofisiologia del colpo. Abbiamo distalmente legare l'arteria cerebrale centrale di destra e l'arteria carotica comune di destra e ripristinare il flusso sanguigno dopo 10 o 40 min di ischemia.

Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

Questo modello di topo di occlusione a due vasi di ischemia cerebrale-riperfusione può indagare la fisiopatologia dell'ictus. Questo modello indurrà un volume infarto stabile della maggior parte del cervello che si infiltra nelle cellule immunitarie nel cervello ischemico e il deficit comportamentale dopo l'ischemia cerebrale-riperfusione. In questo modello, un infarto è causato nelle aree corticali e il tasso di mortalità è basso.Poiché il modello di riperfusione MCAO di legatura richiede craniotomia per esporre le dimensioni dell'MCA distale, la dimensione può essere facilmente confermata e l'esame se il flusso sanguigno nell'MCAO distale viene interrotto durante la procedura è semplice. Fornire ai topi libero accesso all'acqua e al cibo fino all'intervento chirurgico. Autoclavare gli strumenti chirurgici e utilizzare il 70% di etanolo per sanificare il tavolo e le attrezzature chirurgiche.Dopo aver anestetizzato un mouse di otto-12 settimane, assicurarsi che non abbia un riflesso del pedale quando testato utilizzando un dito fermo. Utilizzare unguento veterinario per prevenire la secchezza degli occhi mentre il mouse è in anestesia. Per monitorare la pressione sanguigna, rimuovere prima i capelli, quindi utilizzare un sistema di pressione sanguigna non invasivo e un sistema di monitoraggio fisiologico per monitorare la temperatura rettale e i gas arteriosi del sangue.Iniettare il topo per via sottocutanea con un antibiotico profilattico. Quindi, posizionare il mouse in posizione supina sulla pastiglia riscaldante. Per esporre la pelle, utilizzare le tosaerba elettriche per radere la pelliccia sulla regione del collo ventrale e nella regione tra l'occhio destro e l'orecchio destro.Cancellare la pelliccia dal corpo dell'animale con crema epilante e disinfettare il sito chirurgico con il 70% di etanolo. Quindi tagliare un'incisione della linea mediana lunga un centimetro al collo usando le forbici dell'iride. Con le flessioni dell'iride, sezionare attentamente la comune arteria carotide libera dai nervi del vago senza causare lesioni fisiche e utilizzare suture di seta 5-0 per isolare l'arteria.Quindi, usa le forbici dell'iride per fare un'incisione di 0,3 centimetri nel cuoio capelluto nel punto centrale tra l'occhio destro e l'orecchio destro. Usando micro forbici, tagliare il muscolo temporalis per esporre l'osso zigomatico e squamoso. Posizionare il mouse sotto un microscopio stereo sezionato e utilizzare un micro trapano per creare un foro di due millilitri direttamente sull'arteria cerebrale centrale distale sul lato destro.Utilizzare una sutura 10-0 per ligare il tronco dell'MCA distale sul lato destro e utilizzare una clip di aneurisma nontraumatico per occludere il CCA sul lato destro. Dopo la durata desiderata dell'ischemia, rimuovere la clip di sutura e aneurisma per ripristinare il flusso sanguigno all'MCA e al CCA. Utilizzare una clip di sutura per sigillare l'incisione cutanea sulla testa e sigillare le incisioni della pelle cervicale con colla chirurgica.Iniettare buprenorfina per via sottocutanea per alleviare il dolore. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 36,5 più o meno 0,5 gradi Celsius sulla pastiglia riscaldante e non lasciare incustodita o restituirla alla compagnia di altri animali fino a quando non viene completamente recuperata dall'anestesia. Infine, posizionare il mouse nella gabbia dell'autoclave in modo che possa accedere liberamente all'acqua e al cibo dopo che si è completamente ripreso.Usa le forbici dell'iride per fare un'incisione nella pelle della testa del topo anestetizzato e decapitato per esporre il cranio. Quindi utilizzare forbici operative per tagliare la parte anteriore dell'osso frontale e, con le forbici dell'iride, tagliare il cranio lungo la sutura sagittale. Con un rongeur osseo, mettere da parte l'osso frontale e parietale ed esporre il cervello.Rimuovere il cervello e posizionarlo in una matrice cerebrale del topo. Utilizzare lamette da barba per ottenere fette coronali da due millilitri e posizionarle in tubi da 50 millilitri riempiti con cinque millilitri di 2%TTC. Quando si utilizza la matrice cerebrale del topo per ottenere fette coronali, la dimensione di taglio dovrebbe essere la stessa in cervelli diversi.La dimensione del taglio influisce sulle dimensioni delle fette cerebrali, che influenzano anche il calcolo delle dimensioni infariche. Macchiare le fette cerebrali con 2%TTC e 1X PBS per 10 minuti a 37 gradi Celsius, quindi risciacquare due volte con 10%formalina. Fissare le fette cerebrali in formalina al 10% a temperatura ambiente per 24 ore.Dopo aver asciugato le fette cerebrali sulla carta velina per assorbire la formalina in eccesso, disporle su uno scivolo di plastica pulito, orientandole dal rostrale al caudale e coprirle con un altro scivolo di plastica pulito. Eseguire la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner. Capovolgere la diapositiva e scansionare il retro.Utilizzare il software ImageJ per calcolare l'area di infarto di ogni sezione, aprendo prima il file di immagine e impostando la scala per l'immagine. Quindi usa la selezione a mano libera per selezionare l'area infarct e usa il gestore del ROI delle aree di interesse per misurare l'area di interesse. Infine, sommare le aree infarct per ogni sezione, e moltiplicare il risultato per lo spessore della sezione per stimare il volume totale di infarto, quindi completare l'analisi statistica come descritto nel manoscritto.L'aumento della durata dell'ischemia durante questa procedura di riperfusione MCAO ha prodotto diversi gradi di volume infarto indotto dall'ischemia e perdita neuronale nella corteccia cerebrale dell'area MCA destra. Inoltre, l'ischemia ha diminuito l'attività locomotoria dell'animale a 48 ore dopo la riperfusione mcao. Dopo l'ischemia cerebrale-riperfusione, una maggior parte delle cellule immunitarie periferiche si è infiltrata nell'emisfero ipsilaterale del cervello ischemico.Inoltre, quando questo modello di occlusione a due navi è stato confrontato con il modello MCAO, i loro volumi infarto non erano significativamente diversi. Il micro trapano deve essere utilizzato con cura quando si crea un foro nel cranio. Con un'azione inappropriata, facile causare sanguinamento dall'MCA.L'MCA non deve essere danneggiato e il sanguinamento deve essere evitato prima e dopo la procedura di legatura. L'occlusione MCA e lo stato di riperfusione possono essere controllati dal laser Doppler. Questo metodo può confermare le condizioni del flusso sanguigno di MCA.

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Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale

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