Name: Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Scopri un metodo avanzato per rilevare siti di ubiquitinazione proteica mediante arricchimento di peptidi diGly e spettrometria di massa Orbitrap. Questo protocollo migliora la copertura dell'ubiquitinoma.

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Questo lavoro fa parte del progetto "Proteins at Work", un programma del Centro di Proteomica dei Paesi Bassi finanziato dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) nell'ambito della National Roadmap Large-Scale Research Facilities (numero di progetto 184.032.201 ).

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) di Erasmus MC.
1. Preparazione del campione
<ol><li>Cellule coltivate<ol>
<li>Selezionare una linea di interesse cellulare (ad esempio, cellule HeLa o osteosarcoma [U2OS]) e far crescere le cellule nel Minimal Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e 100 unità/mL penicillina/streptomica.</li>
		<li>Per gli esperimenti di proteomica quantitativa, le cellule di coltura nel DMEM mancano di arginina e lisina. Il mezzo deve essere integrato con 10% siero bovino fetale dial (FBS), 100 unità/mL penicillina/streptomicina e alanina-glutamina. Fare due tipi di supporti aggiungendo lisina convenzionale e arginina ('Medio leggero' o lisina-8 (13C6; 15N2) e arginina-10 (13C6; 15N4) ('Pesante' Medio), rispettivamente.</li>
		<li>Gruppi di colture di cellule in Medium chiaro (cioè senza etichetta) e Medium pesante (cioè, etichettato, SILAC) per almeno sei raddoppi prima dell'espansione e del trattamento per assicurarsi che tutte le proteine nella coltura di Medium pesante siano etichettate con isotopo stabile pesante contenenti Aminoacidi.</li>
		<li>Trattare le cellule per 8 h con 10 m dell'inibitore proteasoso bortezomib o un volume equivalente di DMSO come trattamento fittizio. Lavare le cellule con PBS, dissociarle utilizzando l'1% di trypsin/EDTA e pellet le cellule.</li>
		<li>Lyse il pellet cellulare da una piastra di coltura 150 cm2 per condizione testata in 2 mL di ghiaccio-freddo 50 mM Tris-HCl (pH - 8,2) con 0.5% deoxycholate di sodio (DOC). Far bollire il lisato a 95 gradi centigradi per 5 min e sonicare per 10 min (impostando "H" per il sonicatore elencato nella Tabella dei Materiali) a 4 gradi centigradi. Non raccomandiamo l'uso di inibitori della deubiquitinasi come N-ethylmaleimide (NEM), perché questo può introdurre modifiche proteiche indesiderate che possono complicare l'identificazione dei peptidi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tessuto cerebrale del topo in vivo<ol>
<li>Quando si utilizza tessuto in vivo, lisciviare il tessuto in un tampone ghiacciato contenente 100 mM Tris-HCl (pH - 8,5), 12 mM di sodio DOC e 12 mM di sodio N-lauroylsarcosinate17. Sonicare il lisato per 10 min (impostando "H" per il sonicatore elencato nella tabella dei materiali) a 4 gradi centigradi e far bollire il lisato per 5 min a 95 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifica la quantità totale di proteine utilizzando un kit di saggio proteico BCA a assorbimento colorimetrico. La quantità totale di proteine dovrebbe essere di almeno diversi milligrammi per un'immunoprecipitazioni peptide diGly di successo (IP). Per gli esperimenti SILAC si mescolano le proteine etichettate leggere e pesanti in un rapporto 1:1 in base alla quantità totale di proteine.</li>
	<li>Ridurre tutte le proteine utilizzando 5 mM 1,4-dithiothreitol per 30 min a 50 gradi centigradi e successivamente alchilarle con 10 mM di iodoacetamide per 15 min al buio. Eseguire la digestione proteica con Illys-C (rapporto 1:200 enzima-substrato) per 4 h seguita da digestione notturna con trypsina (1:50 rapporto enzima-substrato) a 30 gradi centigradi o a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aggiungere l'acido trifluoroacetico (TFA) al campione digerito ad una concentrazione finale dello 0,5% e centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min al fine di precipitare e rimuovere tutto il detersivo. Raccogliere il supernatante contenente i peptidi per la frazione successiva.</li>
</ol>2. Frazione di peptidi offline
<ol><li>Utilizzare la cromatografia C18 del pH (Rp) alta con materiale polimerico di fase stazionaria (300 , 50 m; vedi Tabella dei materiali) caricato in una cartuccia a colonna vuota per frazionare i peptidi tryptici. La dimensione del letto della fase stazionaria deve essere regolata in base alla quantità di proteina digerire da frazionare. Preparare una cartuccia vuota a colonna da 6 mL (vedi Tabella dei materiali)riempita con 0,5 g di materiale di fase stazionario per 10 mg di digestione proteica. Il rapporto tra proteina e ditore di fase stazionaria dovrebbe essere di circa 1:50 (w/w).</li>
	<li>Caricare i peptidi sulla colonna preparata e lavare la colonna con circa 10 volumi di colonna dello 0,1% TFA, seguiti da circa 10 volumi di colonna di H2O.</li>
	<li>Elutare i peptidi in tre frazioni con 10 volumi di colonna di 10 mM di soluzione di formato di ammonio (pH - 10) con 7%, 13.5% e 50% acetonitrile (AcN), rispettivamente. Lyophilize tutte le frazioni alla completezza.</li>
	<li>Usa gli anticorpi del motivo residuo dell'ubiquitina (K-z-GG) coniugati alle proteine A agarose per l'immunoarricchimento dei peptidi diGly. Poiché l'esatta quantità di anticorpo per lotto di perline è informazioni proprietarie e non divulgate dal produttore, si consiglia di utilizzare la stessa definizione per un lotto di perline come il produttore fa al fine di evitare confusione. Lavare un lotto di queste perline 2x con PBS e dividere il liquame di perline in sei frazioni uguali. Vedere Figura 1 per un sistema sperimentale dettagliato.</li>
	<li>Sciogliere le tre frazioni di peptide raccolte nel passaggio 2,3 in 1,4 mL di un buffer composto da 50 MM MOPS, 10 mM di fosdio di sodio e 50 mM NaCl (pH 7,2), e far girare verso il basso i detriti.</li>
	<li>Aggiungere i supernatanti delle frazioni alle perle anticorpali diGly e incubare per 2 h a 4 gradi centigradi su un'unità rotatore. Girare verso il basso le perline e trasferire il supernatante in un nuovo lotto di perline anticorpali e incubare di nuovo per 2 h a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Memorizzare i supernatanti per la successiva analisi del proteoma globale (GP).</li>
	<li>Trasferire le perline da ogni frazione in una punta di pipetta da 200 luna dotata di una spina di filtro GF/F per conservare le perline. Mettere la punta della pipetta con le perline in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml dotato di adattatore per la centralità. Lavare le perline 3x con 200 l di tampone IAP ghiacciato e successivamente 3x con 200 l di milliQ H2O. Ruotare la colonna a 200 x g per 2 min prima di ogni fase di lavaggio, ma fare attenzione a non far asciugare la colonna. Elute i peptidi usando 2 cicli di 50 -L di 0,15% TFA.</li>
	<li>Disalare i peptidi utilizzando una punta dello stadio C18 (essenzialmente una punta di pipetta da 200 lun con due dischi C18) e asciugarli fino alla completezza utilizzando la centrifugazione sottovuoto.</li>
</ol>3. Nanoflow LC-MS/MS
<ol><li>Eseguire esperimenti LC-MS/MS su uno spettrometro di massa sensibile accoppiato a un sistema LC a nanoflusso.</li>
	<li>Utilizzate una colonna in-casa di 50 cm in fase invertita di 50 cm con un diametro interno di 75 m imballato con resina CSH130 (3,5 m, 130) ed eluse i tidi con un gradiente del 2-28% (AcN, 0,1% FA) su 120 min a 300 nL/min. In alternativa, utilizzare colonne LC disponibili in commercio con proprietà simili. Mantenere la colonna a 50 gradi centigradi utilizzando un forno a colonna, ad esempio (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Eseguire l'analisi della spettrometria di massa.<ol>
<li>Lo spettrometro di massa deve essere azionato in modalità Diacquisizione dipendente dai dati (DDA). Gli spettri di massa MS1 devono essere raccolti ad alta risoluzione (ad esempio, 120.000), con un'impostazione di destinazione automatica del controllo del guadagno (AGC) di 4E5 e un tempo massimo di iniezione di 50 ms in caso di spettrometro di massa Orbitrap.</li>
		<li>Eseguire prima l'analisi della spettrometria di massa in modalità "Intensità massima prima". In questo modo, lo ione più intenso viene selezionato prima per la frammentazione, poi il secondo più alto, e così via, utilizzando il metodo della velocità massima con un tempo di ciclo totale di 3 s. Successivamente, eseguire un secondo round di analisi DDA MS in modalità "Intensità più bassa prima", in modo che lo ione meno intenso viene selezionato prima, poi il secondo più basso, e così via. Questa strategia garantisce un rilevamento ottimale di peptidi di adessidia molto bassa.</li>
		<li>Filtrare gli ioni precursori in base agli stati di carica (2-7 cariche) e l'assegnazione di picco monoisotopico. Escludere i precursori precedentemente interrogati in modo dinamico per 60 s. Isolare i precursori di peptidi con un filtro di massa quadrupolo impostato su una larghezza di 1,6 Th.</li>
		<li>Raccogliere gli spettri MS2 nella trappola iotaria a un AGC di 7E3 con un tempo massimo di iniezione di 50 ms e un'energia di collisione HCD del 30%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>Analizzare i file raw spettrometria di massa utilizzando un motore di ricerca appropriato come la suite software MaxQuant liberamente disponibile basata sul motore di ricerca Andromeda18,19. In MaxQuant, selezionare le impostazioni predefinite con alcune adattamenti indicate di seguito. Impostare la specificità dell'enzima su trypsin, con il numero massimo di scissioni mancati elevato a tre. Impostare l'acesiglia con un residuo diGly (114.04 Da), ossidazione della methionina e n-terminal e impostare la carbamidomethylation di cisteina come una modifica fissa.</li>
	<li>Eseguire ricerche nel database su un file FASTA contenente sequenze proteiche scaricate, ad esempio, dal repository Uniprot (<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">https://www.uniprot.org/downloads</a>) combinato con un'esca e un database contaminanti comune standard fornito automaticamente da MaxQuant. Impostare il tasso di individuazione falsa (FDR) su 1% e impostare il punteggio minimo per i peptidi modificati (diGly) su 40 (valore predefinito). Escludere i peptidi identificati con un residuo di lisina modificato con diG del terminale C da ulteriori analisi.</li>
	<li>Per l'analisi quantitativa dei file dell'esperimento SILAC, impostare la molteplicità su "2" e ripetere il passaggio 4.2.</li>
	<li>Eseguire tutte le analisi a valle (ad esempio, statistiche, analisi geniali) con il modulo Perseus20 della suite software MaxQuant.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
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<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Il protocollo qui descritto è stato applicato a campioni provenienti da varie fonti biologiche, come cellule coltivate e tessuto in vivo. In tutti i casi abbiamo identificato migliaia di peptidi diGly, a condizione che la quantità totale di ingresso proteica fosse di almeno 1 mg. L'arricchimento con anticorpi specifici è altamente efficiente, dato che solo al massimo 100-150 peptidi diGly molto bassi sono stati identificati da lismi a tutta cellula se non sono state applicate procedure di arricchimento per proteine ubiqu...

La coniugazione dell'ubiquitina alle proteine le segna per la degradazione da parte del proteasome ed è un processo cruciale nella proteostasi. Il gruppo carboxyl c-terminale di ubiquitina forma un legame isopeptide con la lisina-aminogruppo della proteina bersaglio1,2. Inoltre, l'ubiquitina può essere collegata ad altri moduli di ubiquitina, con conseguente formazione di strutture omogenee (cioè, K48 o K11) o ramificate (cioè strutture di polianiquitina eterogenee o miste)1,3. La funzione più nota dell'ubiquitina è il suo ruolo nella degradazione proteasomica, mediato dalla poliubiquitina legata al K48. Tuttavia, è diventato chiaro che sia la mono- che la poliubiquitinazione svolgono anche ruoli in molti processi che sono indipendenti dalla degradazione da parte del proteasome. Per esempio, le catene legate al K63 hanno ruoli non degradanti nel traffico intracellulare, nella degradazione lsosomica, nella segnalazione della chinasi e nella risposta al danno del DNA4,5. Gli altri sei tipi di collegamento sono meno abbondanti e i loro ruoli sono ancora in gran parte enigmatici, anche se stanno emergendo le prime indicazioni sulle loro funzioni nella cellula, in gran parte a causa dello sviluppo di nuovi strumenti per consentire il rilevamento specifico del collegamento6,7.
La spettrometria di massa è diventata uno strumento indispensabile per le analisi del proteoma e al giorno d'oggi migliaia di proteine diverse da praticamente qualsiasi fonte biologica possono essere identificate in un singolo esperimento. Un ulteriore strato di complessità è presentato da modifiche post-traduzionali (PTM) di proteine (ad esempio, fosforolalazione, metilazione, acetilazione e ubiquitinazione) che possono modulare l'attività delle proteine. L'identificazione su larga scala delle proteine che portano il PTM è stata resa possibile anche dagli sviluppi nel campo della spettrometria di massa. La stoichiometria relativamente bassa dei peptidi con PTM rispetto alle loro controparti non modificate presenta una sfida tecnica e le fasi di arricchimento biochimico sono generalmente necessarie prima dell'analisi della spettrometria di massa. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati diversi metodi di arricchimento specifici per l'analisi dei PTM.
A causa dei molteplici ruoli dell'ubiquitinazione proteica nella cellula, c'è una grande domanda per lo sviluppo di metodi analitici per il rilevamento di siti di ubiquitinazione sulle proteine8. L'applicazione di metodi spettrometrici di massa ha portato ad un'esplosione del numero di siti di ubiquitinazione identificati nelle proteine della mosca della frutta, del topo, dell'uomo e del lievito9,10,11,12,13,14. Un passo importante è stato rappresentato dallo sviluppo di strategie di arricchimento basate sull'immunoprecipitazioni a livello di peptide utilizzando anticorpi diretti contro il motivo residuo di K-e-GG (chiamato anche 'diglycine' o 'diGly'). Questi peptidi diGly sono prodotti sulla digestione di proteine ubiquitinate utilizzando la trypsina come proteasi15,16.
Qui, presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato per arricchire per peptidi diGly utilizzando l'immunopurificazione e la successiva rilevazione da parte della spettrometria di massa Orbitrap. Utilizzando una combinazione di diverse modifiche dei flussi di lavoro esistenti, specialmente nelle fasi di preparazione del campione e spettrometria di massa, ora possiamo identificare regolarmente più di 23.000 peptidi diGly da un singolo campione di cellule HeLa trattate con un proteasome inibitore e 10.000 dollari da cellule HeLa non trattate. Abbiamo applicato questo protocollo a lisati sia da etichettatura isotoma sia non etichettata che stabile con aminoacidi nella coltura cellulare (SILAC) etichettati cellule HeLa così come a campioni endogeni come il tessuto cerebrale.
Questo flusso di lavoro presenta una preziosa aggiunta al repertorio di strumenti per l'analisi dei siti di ubiquitinazione al fine di scoprire il profondo ubiquitinome. Il protocollo seguente descrive in dettaglio tutti i passaggi del flusso di lavoro.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditioeritritolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Dischi ottadecilici</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>prodotto fuori produzione presso Supelco; CDS Analytical è il nuovo produttore (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr><tr><td>Formiato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 resina, 3,5 &mu; m, 130 & Aring;</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F tappo filtro</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lisina, Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lisina-8 (13C6; 15N2), Arginina-10 (13C6; 15N4)Cambridge</td> <td>Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>Forno NanoLC</td><td>Design MPI, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Spettrometro di massa Lumos</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &Aring;, 50 &; m) particelle polimeriche a fase inversa</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitina Remnant Motif (K-&epsilon;-GG) Kit</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td><td>Waters</td><td>WAT036790</td><td>Rimuovere il materiale tC18 dalla cartuccia prima di riempire la cartuccia con PLRP-S</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, Trattato TPCK</td><td>ThermoFisher</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di siti di ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

La modifica post-traduzionale delle proteine da parte della piccola ubiquitina proteica è coinvolta in molti eventi cellulari. Dopo la digestione trittica delle proteine ubiquitinate, i peptidi con un residuo di diglycine coniugato al gruppo di amminomido epsilon della lisina ('K-z-diglycine' o semplicemente 'diGly') possono essere utilizzati per rintracciare il sito di modifica originale. L'immunopurificazione efficiente dei peptidi diGly combinata con il rilevamento sensibile mediante spettrometria di massa ha portato a un enorme aumento del numero di siti di ubiquitinazione identificati fino ad oggi. Abbiamo apportato diversi miglioramenti a questo flusso di lavoro, tra cui la frazione offline ad alta fase inversa di peptidi prima della procedura di arricchimento e l'inclusione di impostazioni di frammentazione peptide più avanzate nel multipolo di routing io. Inoltre, la pulizia più efficiente del campione utilizzando un tappo basato su filtro al fine di mantenere le perline anticorpali si traduce in una maggiore specificità per i peptidi diGly. Questi miglioramenti si traducono nella rilevazione di routine di più di 23.000 peptidi diGly da cellule tumorali cervicali umane (HeLa) lismi cellulari su inibizione proteasoso nella cellula. Mostriamo l'efficacia di questa strategia per un'analisi approfondita dei profili ubiquitinomi di diversi tipi di cellule e di campioni in vivo, come il tessuto cerebrale. Questo studio presenta un'originale aggiunta alla cassetta degli attrezzi per l'analisi dell'ubiquitinazione delle proteine per scoprire l'ubiquitimo cellulare profondo.

Le proteine ubiquitinate lasciano un residuo di diglicina 114.04 Da sul residuo lisina bersaglio quando le proteine vengono digerite con la trypsina. La differenza di massa causata da questo motivo è stata usata per riconoscere inmodo inequivocabile il sito di ubiquitinazione in un esperimento di spettrometria di massa. La strategia che qui descriviamo è un metodo all'avanguardia per l'arricchimento e la successiva identificazione dei peptidi diGly da parte del nanoflusso LC-MS/MS (<stron...

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

La modifica post traslazione delle proteine da parte della piccola proteina ubiquitina è coinvolta in molti eventi nella cellula. Questo studio presenta un'aggiunta originale alla cassetta degli attrezzi per l'analisi dell'ubiquitinazione proteica. Utilizziamo tecniche di arricchimento e spettrometria di massa per scoprire l'ubiquitinoma profondo.Abbiamo apportato diversi miglioramenti all'analisi dei peptidi digli che provengono da proteine ubiquitinate. Questi includono il frazionamento peptidico grezzo prima dell'arricchimento e l'applicazione di impostazioni di frammentazione peptidica più avanzate nell'Orbitrap. Nel complesso ciò si traduce in una maggiore copertura dell'ubiquitinoma.Diversi aspetti del protocollo sono difficili da descrivere a parole. La visualizzazione di alcuni passaggi chiave è essenziale per poter ripetere queste analisi da parte di diversi operatori in un laboratorio diverso. La procedura sarà dimostrata da Karel Bezstarosti, che è un tecnico senior nel mio laboratorio.Inizia preparando cellule coltivate o tessuto cerebrale del topo per l'esperimento. Se si lavora con le cellule, silyse il pellet cellulare da una piastra di coltura quadrata di 150 centimetri in due millilitri di ghiaccio freddo, 50 millimolare Tris HCL con 0,5% di deossicholato di sodio. Far bollire il lysate a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi sonicarlo a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Se si utilizza tessuto cerebrale di topo in vivo, lisciviarlo in un tampone ghiacciato contenente Tris HCL 100 millimolare, 12 deossicole di sodio millimolare e 12 millimolare di sodio N-lauroilsarcosinato. Sonicare il lysate per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi far bollire per cinque minuti a 95 gradi Celsius. Successivamente, quantificare la quantità totale di proteine utilizzando un kit di dosaggio proteico BCA di assorbimento calorimetrico, che dovrebbe essere di almeno diversi milligrammi per un'immunoprecipitazione peptidica diGly di successo. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le proteine etichettate leggere e pesanti in un rapporto uno a uno in base alla quantità totale di proteine.Ridurre tutte le proteine con cinque DTT millimolare per 30 minuti a 50 gradi Celsius. E successivamente alchilati con 10 millimolare iodoacetamide per 15 minuti al buio. Quindi eseguire la digestione proteica con Lys-C per quattro ore.E la digestione della triptina durante la notte a 30 gradi Celsius, o a temperatura ambiente. Il giorno successivo, dividere il campione in due tubi Eppendorf a due millilitri e aggiungere TFA al campione digerito a una concentrazione finale dello 0,5% Centrifugarlo a 10.000 volte G per 10 minuti per precipitare e rimuovere tutto il detersivo. Raccogliere il peptide contenente supernatante per il successivo frazionamento.Utilizzare cromatografia ad alta fase inversa di pH C18 per frazionare i peptidi triptici. Preparare una cartuccia vuota a colonna di sei millilitri riempita con 0,5 grammi di materiale di fase stazionaria per circa 10 milligrammi di digestione proteica. Caricare i peptidi sulla colonna preparata e lavarli con circa 10 volumi di 0,1%TFA, seguiti da 10 volumi di acqua.Elute i peptidi in tre frazioni utilizzando 10 volumi di colonna di formato ammonio millimolare con sette, 13,5 e 50% acetonitrile, rispettivamente. Quindi, litolizzare tutte le frazioni. Un lotto di anticorpi del motivo residuo di ubiquitina coniugati con la proteina A liquami di perline di agarosio è diviso in sei frazioni uguali.Sciogliere le tre frazioni peptidiche in base alle direzioni del manoscritto e far girare i detriti. Aggiungere i supernaganti delle tre frazioni al liquame delle perline mantenendo le altre tre frazioni sul ghiaccio. E incubarli per due ore a quattro gradi Celsius su un'unità rotatoria.Quindi, gira giù per le perline. Trasferire il supernatante in un nuovo lotto di perline. E ripetere l'incubazione con le restanti tre frazioni di liquami di perline.Conservare i supernatanti per la successiva analisi globale del proteoma. E trasferire le perline su 200 punte di pipetta in microliter dotate di tappo filtrante GFF. Mettere le punte in tubi da 1,5 millilitri dotati di un adattatore per punta di centrifuga e lavare le perline tre volte con 200 microlitri di tampone IAP ghiacciato, seguiti da tre lavaggi con acqua purificata a freddo ghiacciato.Ruotare le colonne a 200 volte G per due minuti tra un lavaggio e l'altro, assicurandosi di non lasciare asciugare la colonna. Dopo il lavaggio finale, elutare i peptidi con due cicli a 50 microlitri dello 0,15%TFA. Desalt i peptidi con una punta dello stadio C18 e asciugarli con centrifugazione sottovuoto.Eseguire esperimenti LC-MS/MS su uno spettrometro di massa sensibile accoppiato a un sistema LC a nanoflusso. La colonna è impostata secondo le indicazioni manoscritte e conservata a 50 gradi Celsius. Utilizzare lo spettrometro di massa in modalità di acquisizione dipendente dai dati.Raccogli gli spettri di massa MS1 ad alta risoluzione con un'impostazione di destinazione controllata dal guadagno automatizzato di 4E5 e un tempo massimo di iniezione di 50 millisecondi. Eseguire l'analisi della spettrometria di massa nella prima modalità più intensa, utilizzando il metodo della velocità massima con un tempo di ciclo totale di tre secondi. Quindi eseguire un secondo ciclo di analisi DDA MS nella prima modalità meno intensa, che garantirà il rilevamento ottimale di peptidi a bassa abbondanza.Filtrare gli ioni precursori in base ai loro stati di carica e all'assegnazione del picco monoisotopico. Ed escludere dinamicamente i precursori interrogati in precedenza per 60 secondi. Isolare i precursori peptidici con un filtro di massa quadrupolo impostato su una larghezza di 1,6 Thomson.Quindi raccogli gli spettri MS2 nella trappola ionica con un controllo automatico del guadagno di 7E3 con un tempo massimo di iniezione di 50 millisecondi e un'energia di collisione HCD del 30%Analizza i file grezzi della spettrometria di massa utilizzando un motore di ricerca appropriato, come la suite software MaxQuant liberamente disponibile basata sul motore di ricerca Andromeda. Aprire MaxQuant e selezionare i file di dati non elaborati appropriati. Impostare il numero di processori e fare clic sulla scheda parametri specifici del gruppo.Selezionare la digestione e consentire tre scollatura persa. Quindi selezionare le modifiche e aggiungere digly alle modifiche delle variabili. Selezionare la scheda parametri globali e aggiungere il database di sequenza proteica corretto.Lasciare le altre impostazioni come predefinite e premere Start per eseguire la ricerca nel database. Per l'analisi quantitativa dei file di esperimento SILAC, impostare la molteplicità su due e selezionare le etichette degli amminoacidi pesanti. Al termine della ricerca, importare i file di testo in Perseo.Questo protocollo è stato utilizzato per identificare i siti di ubiquitinazione nelle proteine provenienti da cellule coltivate e materiale in vivo rilevando peptidi diGly con nanoflusso LC-MS/MS. Diversi miglioramenti sono stati apportati al protocollo esistente che ha portato a un maggior numero di peptidi digly rilevati. Un frazionamento grezzo in tre frazioni è stato eseguito prima dell'immunoprecipitazione.Una delle frazioni contiene il peptide diGly trittico modificato K48 di ubiquitin, che è caratterizzato da un ampio picco nel cromatogramma LC. Inoltre, il regime di frammentazione peptidica è stato regolato per combinare le corse LC-MS con i primi e più bassi regimi di frammentazione più alti e più bassi nella procedura di analisi dei dati, che ha prodotto più di 4.000 peptidi diGly unici aggiuntivi. Più di 23.000 peptidi diGly possono essere regolarmente identificati da un singolo campione di cellule HeLa trattate con un inibitore del proteasome.Di tutti i peptidi diGly identificati su tre schermi biologici replicati, più di 9.000 erano presenti in tutti e tre, mentre più di 17.000 erano presenti in almeno due repliche su tre. Il numero di identificazioni peptidiche è altamente dipendente dalla quantità di materiale in ingresso. Un numero approssimativo di peptidi digli identificati può essere previsto a seconda del materiale di partenza, ma questi numeri sono solo stime e dipenderanno anche dal tipo di spettrometro di massa utilizzato.Quando si effettua questo protocollo, l'esperienza precedente con i metodi di proteomica basati sulla spettrometria di massa e la manipolazione e l'analisi di quantità di campioni minuti sarebbe certamente vantaggiosa. Il software MaxQuant potrebbe essere sostituito da qualsiasi altro algoritmo di ricerca di database. Può essere utilizzato anche un diverso tipo di spettrometro di massa.I risultati in termini di identificazioni peptidiche possono differire leggermente, ma questo è tipico per qualsiasi saggio di proteomica a base di spettrometria di massa. L'ubiquitina è importante nel progresso della degradazione mediata delle proteine, ma svolge anche un ruolo in molti altri processi nella cellula. Una conoscenza più profonda dell'ubiquitina come modifica post traslazione è fondamentale per comprenderne meglio la funzione.

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Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in...

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

In questo video, dimostriamo l'immunoprecipitazione dei fosfopeptidi basata su anticorpi da una miscela di peptidi. I fosfopeptidi arricchiti sono concentrati sotto vuoto e conservati per l'analisi a valle.

Arricchimento di fosfopeptidi: una tecnica di immunoprecipitazione basata su anticorpi per separare specifici peptidi fosforilati da miscele di peptidi complessi

Questo video descrive un metodo per estrarre e purificare peptidi ubiquitinilati contenenti residui di peptidi di-glicina da una miscela di peptidi complessi. Il metodo presentato può aiutare a identificare i siti di ubiquitinazione originali nella proteina.

Estrazione basata sull'immunoaffinità di peptidi ubiquitinilati: una tecnica per estrarre selettivamente peptidi marcati con ubiquitina da frazioni peptidiche purificate

Questo protocollo descrive una procedura per estrarre e arricchire fosfopeptidi da linee cellulari di carcinoma della prostata o tessuti per un'analisi della phosphoproteome via basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

L'ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

L'ubiquitinazione è un regolatore critico delle funzioni intracellulari delle proteine. Qui descriviamo due metodi di lisi cellulare per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato nelle cellule dei mammiferi e confrontiamo la loro efficacia nell'analisi dei livelli di ubiquitinazione. La sovraespressione proteica nelle cellule di HEK293T è stata indotta tramite trasfezione transitoria, mentre proteine ubiquitinate sono state rilevate tramite analisi western blot.

Strategie comparative per il rilevamento dell'ubiquitinazione nei lisati cellulari di mammiferi utilizzando SMAD2/SMURF2 come modello

Scopri un metodo avanzato per rilevare siti di ubiquitinazione proteica mediante arricchimento di peptidi diGly e spettrometria di massa Orbitrap. Questo protocollo migliora la copertura dell'ubiquitinoma.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

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