Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser
28 febbraio 2019
Il successo di un esperimento di cristallografia risolti in tempo ai femtosecondi seriale dipende dalla consegna efficiente dei campioni. Qui, descriviamo protocolli per ottimizzare l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin da un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. La metodologia si basa sull'omogeneizzazione del campione con un romanzo accoppiatore di tre vie e la visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.
Questo protocollo è stato progettato per garantire che i problemi frequentemente riscontrati durante gli esperimenti cristallografici seriali risolti nel tempo non compromettono la qualità dei dati. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è la sua adattabilità ai singoli sistemi cristallini. Il test di estrusione della telecamera ad alta velocità ci consente anche di misurare direttamente la stabilità dell'estrusione.
In primo luogo, caricare 50 microlitri di LCP a base di monooleina cristallina in una siringa da 100 microlitri circa 30 minuti prima dell'iniezione. Per l'iniezione in un ambiente sottovuoto, caricare cinque microlitri di MAG 7.9 e cinque microlitri di paraffina liquida nella parte posteriore di una seconda siringa. Tenendo la siringa verticalmente, espellere le bolle d'aria dalla siringa.
Collegare la siringa con MAG 7.9 e paraffina a un accoppiatore di siringhe standard. E epurare l'aria dall'accoppiatore premendo delicatamente sullo stantuffo fino a quando un piccolo volume della miscela è visibile sulla punta dell'ago dell'accoppiatore. Collegare la siringa campione all'accoppiatore di siringhe che prende l'auto per non introdurre aria nel campione.
Mescolare il lipide e la paraffina passando il campione attraverso l'accoppiatore più volte. Successivamente, caricare 20 microlitri di LCP premiscelato in un'altra siringa da 100 microlitri. Rimuovere la siringa vuota dall'accoppiatore e attaccare l'LCP premiscelato alla siringa contenente cristallo utilizzando un accoppiatore di siringhe standard.
Quindi, passare il campione attraverso l'accoppiatore 100 volte. Per portare il campione nella fase cubica, aggiungere tre microlitri di monooleina e mescolare 50 volte. Ripetere questa procedura solo fino a quando non si è formata una fase trasparente per evitare un eccesso di monooleina.
Come test preliminare per la rigidità e l'estrusione del campione, staccare la siringa vuota dall'accoppiatore della siringa e tenere la siringa verticalmente, spremere una piccola quantità di campionatore attraverso l'accoppiatore. Se il campione estruso forma un cilindro verticale, il campione è pronto per il test di estrusione. Regolare il volume totale del campione a 100 microlitri aggiungendo un LCP più premiscelato.
Attaccare la siringa campione e due siringhe vuote all'accoppiatore a tre siringhe. Mescolare almeno 50 volte passando metà del campione nella seconda siringa e quindi premendo entrambe le metà del campione nella terza siringa contemporaneamente. Posizionare la siringa contenente il campione misto al microscopio stereo per verificare una distribuzione omogenea dei cristalli.
Elimina una pompa HPLC e tutte le linee d'acqua per garantire che le portate siano accurate. Quindi, eliminare lo stadio idraulico dell'iniettore. Successivamente, accendere e collegare la fotocamera al software in dotazione.
Con un video in diretta in esecuzione per un feedback visivo, posiziona la punta dell'ugello al centro del fotogramma e portalo a fuoco con lo stadio a tre assi. Impostare la frequenza fotogrammi sulla fotocamera su 1.000 fotogrammi al secondo. Quindi, impostare la risoluzione su 512 per 512 pixel.
Con il tempo di esposizione ora impostato dalla frequenza fotogrammi, regolare il livello di illuminazione fino a quando l'ugello non è visibile. Riposizionare la punta dell'ugello in modo che sia centrata da sinistra a destra e si trovi nel terzo superiore del telaio. Configurare la fotocamera in modalità time lapse.
Impostare l'intervallo su 30 secondi e le ripetizioni su 40 volte. Impostare la modalità trigger su casuale. E immettere il numero di fotogrammi da registrare a 1.000.
Ora, caricare il serbatoio con 20 microlitri del campione di prova e attaccare l'ugello capillare. Attaccare il serbatoio riempito all'iniettore. Quindi, collegare la linea del gas alla porta sull'ugello e avviare il flusso di gas.
In seguito, avviare contemporaneamente la pompa e la registrazione della fotocamera. Monitorare l'estrusione fino a quando la pressione della pompa non aumenta bruscamente verso l'ora di fine prevista. Quindi, interrompere la registrazione, spegnere la pompa e sfogare la pressione del sistema aprendo la valvola di scarico.
In seguito, aprire il file video con il software di analisi e calibrare gli strumenti di misurazione. Trova un fotogramma nel video in cui è visibile una feature tracciabile nell'estrusione. Registrare il numero di fotogramma.
Quindi, sposta il video su un fotogramma in cui la stessa funzione è visibile ma si è spostata dalla sua posizione nel passaggio precedente. Registrare il numero di fotogramma. Utilizzando lo strumento di misurazione della linea retta, misurare la distanza dal punto iniziale e finale della feature tramite la misura di analisi.
Ripeti i passaggi precedenti alcune volte per ogni segmento del video. Infine, tracciare la serie di dati. Il materiale di partenza ideale per la procedura qui descritta sono le alte densità di microcristalli incorporati in un mezzo portante viscoso per l'iniettore.
I cristalli proteici sono stati utilizzati per raccogliere i dati TRSFX sulla rodopsina dei batteri pompati protonicamente, che hanno rivelato i cambiamenti ultra veloci che si verificano dopo l'assorbimento del fotone. Dopo la preparazione del campione con un accoppiatore a tre, l'ispezione visiva del materiale nella siringa mostra omogeneità del campione. E le immagini al microscopio possono confermare la densità dei cristalli.
Il campione è in fase cubica quando il mezzo di erogazione è chiaro e viscoso. Le miscele torbidi sono un'indicazione che il campione si trova in una spugna o in una fase lamellare, ma non sono conclusive in quanto un'alta densità cristallina può oscurare la chiarezza dell'LCP. Un test a bassa pressione per identificare la fase della spugna può essere eseguito allontanando lo stantuffo della siringa dal campione.
Durante il test del getto, il campione dovrebbe estrudere una lunga colonna continua di LCP che si muove a una velocità quasi costante. I campioni eseguiti in modalità gocciolante indicano che la viscosità è troppo bassa. I dati provenienti da campioni che formano una colonna devono mostrare che l'estrusione rimane al di sopra di una velocità minima dettata dai parametri sperimentali.
Dopo l'ottimizzazione utilizzando questo protocollo, i dati cristallografici seriali di risoluzione del tempo possono essere raccolti presso una struttura esperta. Ciò rivelerà i cambiamenti conformazionali nell'intera proteina mentre svolge la sua funzione.
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Panoramica
Questo protocollo descrive metodi per ottimizzare l'estrusione di microcristalli di batteriorodopsina per la cristallografia seriale a femtosecondi risolta nel tempo. Si sottolinea l'importanza della somministrazione e della stabilità del campione per garantire dati di alta qualità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Cristallografia
- Biophysica
- Biologia Strutturale
Sfondo
- La cristallografia seriale risolta nel tempo è fondamentale per lo studio dei processi dinamici.
- Una consegna efficiente del campione è essenziale per esperimenti di successo.
- Gli iniettori microestrusori ad alta viscosità possono presentare difficoltà nella manipolazione del campione.
- Tecniche di visualizzazione, come telecamere ad alta velocità, vengono utilizzate per monitorare la stabilità del campione.
Scopo dello studio
- Sviluppare protocolli che migliorino l'estruzione di microcristalli.
- Individuare e risolvere problemi comuni negli esperimenti di cristallografia risolta nel tempo.
- Garantire l'adattabilità a diversi sistemi cristallini.
Metodi Utilizzati
- Omospezzionamento del campione mediante un innovativo raccordo a tre vie.
- Test con telecamera ad alta velocità per misurare la stabilità dell'estrusione.
- Preparazione del LCP a base di monooleina cristalladene in siringhe.
- Iniezione in un ambiente sotto vuoto con componenti liquidi specifici.
Risultati principali
- Il metodo consente la misurazione diretta della stabilità dell'estrusione.
- È stata dimostrata l'adattabilità a diversi sistemi cristallini.
- Dati di alta qualità possono essere ottenuti senza compromettere l'integrità del campione.
Conclusioni
- Una consegna ottimizzata del campione è fondamentale per il successo degli esperimenti di cristallografia.
- I protocolli sviluppati possono essere applicati a diverse configurazioni sperimentali.
- I futuri lavori potrebbero concentrarsi su un'ulteriore affinamento di questi metodi per applicazioni più ampie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Ottimizzare l'estrazione ad alta viscosità di microcristalli è fondamentale per massimizzare il rendimento dei dati e le informazioni strutturali nella cristallografia seriale a femtosecondi risolta nel tempo (TR-SFX) presso i laser a raggi X. Una somministrazione affidabile del campione influenza direttamente l'affidabilità predittiva degli studi sulle strutture proteiche dinamiche, sostenendo la fase iniziale della scoperta e la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica. Questa metodologia consente flussi di lavoro ad alta produttività e riproducibili, essenziali per far progredire i portafogli di scoperta di farmaci guidati dalla biologia strutturale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei cambiamenti conformazionali delle proteine a seguito dell'attivazione, fornendo informazioni per la validazione del bersaglio.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica fornendo dati strutturali ad alta risoluzione e risolti nel tempo.
- Facilita la previsione affidabile nella progettazione di farmaci basata sulla struttura, garantendo qualità e riproducibilità dei dati.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni omogenei di microcristalli ad alta densità per flussi di lavoro TR-SFX successivi.
- Standardizza le condizioni di estrusione e somministrazione, migliorando la riproducibilità del saggio e l'output quantitativo.
- Permette lo screening scalabile ad alto rendimento della dinamica strutturale delle proteine in condizioni controllate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea istantanee strutturali a stati proteici rilevanti per la malattia, al fine di scoprire biomarcatori con applicazioni traslazionali.
- Garantisce continuità dagli studi meccanicistici nella fase di scoperta alla validazione preclinica di bersagli molecolari.
- Riduce il rischio nel progresso dei candidati chiarificando i meccanismi strutturali dinamici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di estrusione ottimizzato si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, supportando la TR-SFX dalla verifica iniziale delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione meccanicistica.
- Biologia della Scoperta: Consente test robusti delle ipotesi sulla funzione proteica mediante analisi strutturale risolta nel tempo.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili dell'estrusione per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Analisi: Permette la misurazione diretta della stabilità dell'estrusione e dell'omogeneità del campione mediante imaging ad alta velocità.
- Ricerca Translazionale: Collega i dati strutturali dinamici a meccanismi rilevanti per le malattie, quando supportati dal sistema proteico.
- Riutilizzo Aziendale: Un protocollo adattabile supporta una gamma di sistemi di microcristalli e configurazioni sperimentali in diverse strutture.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sui bersagli proteici.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione e il trattamento del campione, migliorando la riproducibilità e la scalabilità.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'efficienza nell'uso del capitale garantendo dati strutturali di alta qualità.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata rispetto al rischio, basata su informazioni strutturali dinamiche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in cristallografia, preparazione dei campioni e analisi di immagini ad alta velocità.
- Necessita dell'accesso a dispositivi di iniezione specializzati, telecamere ad alta velocità e software analitici per il monitoraggio dell'estrusione.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale delle procedure di miscelazione e di estrusione dei campioni per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a diversi sistemi di microcristalli mediante modifiche delle procedure in base alle proprietà del campione.
- I limiti pratici includono la sensibilità alla viscosità del campione e la necessità di compatibilità del dispositivo di iniezione specifica per ogni struttura.
