Name: Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Scopri metodi per analizzare la fagocitosi dei macrofagi alveolari murini e valutare la clearance batterica polmonare in vivo. Queste tecniche aiutano a studiare le risposte immunitarie contro Pseudomonas aeruginosa.

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Questo lavoro è supportato da grant R01HL116826 a X. Zhao.

Questo protocollo segue le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) della Eastern Virginia Medical School.
1. fluorescente perline fagocitosi
<ol><li>Eutanasia il mouse (C57BL/6J, vecchio 6 settimane, femmina) di CO2 asfissia secondo protocolli IACUC per l'eutanasia etico degli animali.</li>
	<li>Appoggiare il mouse pancia-up su una tavola di dissezione coperta con carta da cucina. Fissare le zampe con le sue membra spread-eagle e gancio una stringa sotto i suoi denti anteriori per tirare la testa indietro in modo che la trachea è ben diritta e livello.</li>
	<li>Bagnato il mouse gola, petto e pancia con etanolo al 70% per disinfettare e prevenire la pelliccia di attaccarsi agli strumenti.</li>
	<li>Usando il forcipe regolare, tirare la pelle in corrispondenza dell'asse del corpo e tagliare con forbici chirurgiche fino alla linea d'asse alla parte superiore della gola.</li>
	<li>Utilizzando l'estremità smussata di forbici chirurgiche standard, allontanare il muscolo e dei tessuti connettivi sulla gola e attentamente utilizzare forbici di primavera (microforbici) per esporre la trachea.</li>
	<li>Accuratamente con le pinze di presa un anello di cartilagine, praticare una piccola incisione (~1.5 mm), utilizzando microforbici, sul viso ventricolo della trachea e inserire una cannula 18 G nella trachea.</li>
	<li>Delicatamente il lavaggio 3 mL di tampone fosfato salino (PBS), 1 mL alla volta. Ogni volta che aspirare delicatamente il liquido nella siringa e reinfuse indietro nel polmone, 3 volte consecutivamente. Dopo aver raccolto il BALF, eseguire dislocazione cervicale per garantire l'eutanasia. Trasferire il PBS raccolto (~2.8 mL), che è il fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF), in una provetta, centrifugare a 1.000 x g per 10 min e raccogliere il pellet. Aggiungere 1 mL di PBS fresco per la provetta e centrifugare a 1.000 x g per 10 min lavare i detriti e raccogliere i macrofagi alveolari pellettati.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2 mL di medium dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% nonheat-inattivato siero bovino fetale (FBS) e macrofagi alveolari primario di cultura nello stesso supporto per 2 giorni su un piatto di vetro-inferiore a 37 ° C in atmosfera umidificata.</li>
	<li>Aspirare i vecchi media, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 2 mL di terreno fresco. Aggiungere perline FITC (granuli di lattice carboxylated, 2 µm di diametro, 50 Perline/cella) e incubare per 1h a 37 ° C in atmosfera umidificata.</li>
	<li>Lavare estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi) per rimuovere cordoni di extracellulare. Immagine 100 cellule in modo casuale e contare le celle con i branelli intracellulare (488 nm). Nota: gli indici fagocitico sono il numero di perle ingeriti diviso per il numero totale dei macrofagi; la percentuale delle cellule fagocitiche è il numero di macrofagi che ingerire almeno un branello diviso per il numero totale di macrofagi16.<ol>
<li>In alternativa, dopo un'incubazione di 1 h con perline, lavare le cellule con 3 mL di PBS ed elaborarli per citometria a flusso per la quantificazione della fagocitosi. Allo stesso modo, è possibile elaborare AMs senza perle come le celle non macchiate o controllo. Calcolare la percentuale di positività e significare l'intensità di fluorescenza, utilizzando software di citometria a flusso, selezionando le opzioni del software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fagocitosi mediata da FcγR e CR
<ol><li>Per l'opsonizzazione, incubare 2 x 108 pecore globuli rossi (SRBCs) con 50 µ l di coniglio anti-SRBC-IgM o 50 µ l di coniglio anti-IgG SRBC per 30 min a temperatura ambiente11.</li>
	<li>Incubare IgM-opsonized SRBCs con 50 µ l di siero umano C5-carenti (C5D) per 30 min a 37 ° C per correggere i frammenti del complemento C3b e C3bi su rivestite con IgM SRBCs.</li>
	<li>Seme dei macrofagi murini cellule (MH-S) (10.000 cellule/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti e incubare durante la notte per ottenere una confluenza di ~ 70%. Aggiungere 100 µ l di 1 x 107/ml opsonized SRBCs in ciascun pozzetto della cellule MH-S e incubare per 1h a 37 ° C. Lavare unbound SRBCs molto rapidamente (~ 1 min) con 100 µ l di tampone di lisi di cloruro di ammonio e potassio (ACK).</li>
	<li>Lisare le cellule con 0,1% SDS e aggiungere 50 µ l di 2,7-diaminofluorene (DAF) contenente perossido di idrogeno 3% e 6 M urea. Misurare l'assorbanza della formazione di emoglobina-catalizzata fluorene blu a 620 nm.</li>
	<li>Determinare il numero di SRBCs con una curva standard a 620 nm assorbanza valori con un numero noto di SRBCs. Allo stesso modo, il processo MH-S cellule incubate con nonopsonized SRBCs da utilizzare come controlli negativi.</li>
</ol>3. PRR-mediata fagocitosi
<ol><li>Procedura il 1.1-1.9, per l'isolamento e la coltura dei macrofagi alveolari primario del mouse.</li>
	<li>Dopo 2 giorni, rimuovere il supporto, lavare le cellule con 1 mL di PBS e aggiungere 500 µ l di fresco che contenevano Alexa Fluor-488-coniugato zymosan-A bioparticelle (100 particelle/piatto).</li>
	<li>Incubare per 1 h a 37 ° C. Fermare la fagocitosi aggiungendo 500 µ l di PBS ghiacciata.</li>
	<li>Lavare le cellule estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi). Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le cellule estesamente con PBS (1 mL in un momento, per un totale di cinque lavaggi) e mantenere le cellule in 500 µ l di PBS.</li>
	<li>Immagine le cellule sotto contrasto differenziale di interferenza e un canale fluorescente a 488 nm. Contare AMs contenente zymosan-A bioparticelle e determinare la percentuale di fagocitosi.</li>
</ol>4. in Vivo fagocitosi dai macrofagi alveolari
Nota: Inoculare p. aeruginosa GFP su una piastra di agar nutriente e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Il giorno successivo, inoculare la singola Colonia a 2 mL di brodo nutritivo e crescere i batteri a 37° C durante la notte.
<ol><li>Il giorno successivo, anestetizzare i topi con una somministrazione intraperitoneale di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Confermare il corretto amputate tramite una mancanza di risposta per il pizzico di punta.</li>
	<li>Posare il mouse su una tavola piatta con un elastico tra gli incisivi superiori e collocarlo in una posizione semirecumbent (45°) con la superficie ventrale e rostro rivolto verso l'alto. Utilizzando forcipe curvo, ritrarre parzialmente la lingua. Utilizzando un microsprayer, vari amministrare 50 µ l (5 x 106 unità formanti colonie [CFU])17 di p. aeruginosa GFP nei polmoni dei topi anestetizzati.</li>
	<li>Dopo 1 h di infezione, come segue: 1.1-1.7.</li>
	<li>Risospendere le cellule in PBS e citocentrifuga li (1.000 x g, 1 min a temperatura ambiente) su una lastra di vetro.</li>
	<li>Differenzialmente colorare i vetrini cytospin per alveolari macrofagi, neutrofili e linfociti, secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>In modo casuale selezionare 100 AMs, contare l'AMs contenente batteri intracellulari e determinare la percentuale di fagocitosi.</li>
</ol>5. in Vivo batteri Clearance utilizzando p. aeruginosa
<ol><li>Inoculare in p. aeruginosa su una piastra di agar isolamento di p. aeruginosa e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Inoculare la singola Colonia a 2 mL di brodo di Lisogenesi (LB) e crescono i batteri a 37° C durante la notte. Calcolare il CFU, utilizzando la seguente formula. CFU/mL = (numero di colonie x fattore di diluizione) / volume della piastra di coltura. Diluire la cultura con PBS per ottenere il desiderato CFU/mL.</li>
	<li>Nella prova 1, vari iniettare una dose subletale di ~2.5 x 105 CFU/mL p. aeruginosa in anestetizzati wild-type (WT) e TRIM72KO topi, come indicato al punto 4.2. Misurare il peso corporeo al giorno per 6 giorni.</li>
	<li>Nella prova 2, iniettare una seconda dose di p. aeruginosa (5 x 105 CFU/mL) in topi che è sopravvissuto in prova 1 e misurano il peso corporeo per 4 giorni.</li>
	<li>In prova 3, utilizzando un diverso insieme di topi, topi WT e TRIM72KO di iniettare con una dose letale (3 x 107 CFU/mL) di p. aeruginosa e registrare la mortalità entro 2 giorni dall'iniezione. Gli animali che presentano segni di grave stress quali perdita di peso significativa, gobba, anoressia o dispnea sarà valutata dai veterinari che frequentano. Intrattabili animali saranno sacrificati immediatamente.</li>
	<li>Morte o dopo l'eutanasia al giorno 2 dopo l'iniezione, raccogliere il tessuto intero-polmone per la quantificazione degli oneri batterica polmonare all'infezione di picco.</li>
	<li>Per verificare la carica batterica polmonare, aggiungere 200 µ l di soluzione salina normale per i tessuti polmonari e omogeneizzarle, utilizzando un'impostazione precedentemente testata su un omogeneizzatore elettronico che interrompe completamente il tessuto polmonare senza rompere i batteri. Regolare il volume totale dell'omogeneato del polmone a 1 mL e piastra 100 µ l del lisato su piastre di agar Pseudomonas isolamento alle 10 volte diluizioni seriali del polmone.</li>
	<li>Incubare le piastre a 37 ° C per 24 h e conta delle colonie batteriche per determinare il CFU per intero polmone.</li>
</ol>6. elaborazione statistica
<ol><li>Utilizzare di Student t-test per determinare la significatività statistica della differenza tra i due gruppi. Si consideri una differenza statisticamente significativa quando p < 0.05. Tutti i dati sono presentati come mezzi ± errore standard della media (SEM).</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Durante l'esecuzione di una funzione di scambio di gas, il polmone si confronta con insistenza allergeni, agenti patogeni e particelle estranee. AMs rappresentano la prima linea di difesa in virtù della loro funzione principale, vale a dire la fagocitosi. AMs anche coordinare con altre cellule immuni a distruggere gli agenti patogeni e nella risoluzione di infiammazione. Qui, abbiamo descritto metodi per valutare specificamente la fagocitosi di AMs isolato dal polmone del topo. Il protocollo presentato in questo manoscri...

AMs sono i fagociti residenti principali negli alveoli in fase di riposa e uno dei principali attori della risposta immunitaria innata attraverso il riconoscimento e interiorizzazione degli agenti patogeni per via inalatoria e particelle estranee1,2. È stato segnalato che AMs sono essenziali per la rapida clearance di molti agenti patogeni polmonari come p. aeruginosa e Klebsiella polmonite3,4, quindi una carenza nella fagocitosi AM si traduce spesso in respiratoria infezioni, come la polmonite acuta, che causano più alti tassi di mortalità e morbosità.
AMs anche avviare le risposte infiammatorie innate nel polmone con la produzione di citochine e chemochine come TNF-α e IL-1 β, quale area interattiva con altre cellule dell'ambiente alveolare per produrre chemochine e reclutare infiammatori neutrofili, monociti, e cellule immuni adattive nel polmone5. Per esempio, IL-1 β prodotto da AMs aiuta per innescare il rilascio di neutrofili chemochina CXCL8 da cellule epiteliali6. Inoltre, AMs contribuiscono alla fagocitosi di apoptotic leucociti polimorfonucleari (PMNs), di che conduce alla perdita sostenuta di enzimi intracellulari da PMNs mancato il tessuto circostante, con conseguente danno tissutale e l'infiammazione prolungata 7 , 8 , 9.
Fagocitosi di AMs sono mediato da un diretto riconoscimento di pattern molecolari associati alla superficie dell'agente patogeno da recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) dell'AMs o dall'associazione di agenti patogeni opsonized con i recettori immuni effettrici dell'AMs 10. per quest'ultimo, AMs può riconoscere i bersagli opsonized con immunoglobuline (IgG) attraverso i loro recettori Fcy (FcγR) o gli agenti patogeni rivestiti con frammenti di complemento, C3b e C3bi, attraverso i loro recettori del complemento (CR)11. Tra i recettori del complemento, il CR della superfamiglia delle immunoglobuline (CRIg) è espressa selettivamente nel tessuto macrofagi12, e una recente scoperta ha evidenziato il ruolo di CRIg nella fagocitosi AM nel contesto della polmonite di p. aeruginosa 13.
Molti studi originali utilizzano metodi per valutare la fagocitosi del macrofago per descrivere i meccanismi molecolari del macrofago funzione14,15. Tuttavia, i metodi come fagocitosi in vivo richiedono una precisa quantificazione della fagocitosi. Qui, riassumiamo una metodologia dettagliata per fagocitosi sia in vitro che in vivo utilizzando isotiocianato di fluorescina (FITC)-microsfere di vetro e proteina di p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), rispettivamente. Inoltre, spieghiamo il metodo della differenziazione fra PRR-, CR- e fagocitosi mediata da FcγR. Infine, segnaliamo un metodo per caratterizzare lo spazio batterico nel topo rispetto alla polmonite di p. aeruginosa .

<table><tbody><tr><td>Ago 18-G</td><td>Nipro Medical&nbsp;</td><td>CI+1832-2C</td><td>Biologia molecolare grado</td></tr><tr><td>2,7-diamminofluorene (DAF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>Biologia molecolare grado</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>Piastra a</td></tr><tr><td>96 pozzetti</td> di grado analitico <td>Corning</td><td>3603</td><td>Tampone</td></tr> di <tr><td>lisi ACK</td> di grado di biologia cellulare <td>Life Technologies</td><td>A10492</td><td>Grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td> Siero carente <td>di grado</td></tr><tr><td>C5</td> di biologia molecolare<td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>Reagente biochimico</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Citocentrifuga Cytospin 4</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 Numero 11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Terreni di coltura cellulare</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Grado di biologia cellulare</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Grado di biologia cellulare</td></tr><tr><td>Flusso Citometro</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Software</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>Adatto per la dissezione di animali da laboratorio</td></tr><tr><td>Perle di lattice carbossilato FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>Grado di biologia cellulare</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>Adatto per&nbsp; saggi di infezione cellulare</td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Siringa ad alta pressione</td> per biologia cellulare <td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>Adatto per l'uso su animali da laboratorio</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Microscopio a</td></tr><tr><td>fluorescenza invertita</td> per grado analitico <td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina Cloridrato</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td>Grado farmaceutico</td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff Macchie</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>Biologia cellulare</td></tr><tr><td>grado LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td>Biologia molecolare grado</td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427</td><td>Biologia molecolare grado</td></tr><tr><td>MicroSprayer Aerosolizer</td><td>Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td>Adatto per l'uso su animali da laboratorio</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagente grado</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Biologia cellulare grado</td></tr><tr><td>coniglio anti-SRBC-IgG&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Adatto per immuno-saggi</td></tr><tr><td>coniglio anti-SRBC-IgM&nbsp;</td><td>Cedarline Laboratories</td><td>CL9000-M</td><td>Adatto per immuno-saggi</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>Adatto per la dissezione di</td></tr><tr><td>animali da laboratorio Laringoscopio per piccoli animali</td><td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>Adatto per uso su animali da laboratorio</td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Forbici a molla di grado analitico</td></tr><tr><td>(Med)</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>15012-12</td><td>Adatto per la dissezione di animali da laboratorio</td></tr><tr><td>Forbici a molla (piccole)</td> <td>Strumenti per la scienza fine</td><td>91500-09</td><td>Adatto per la dissezione di animali da laboratorio</td></tr><tr><td>globuli rossi di pecora (SRBC)&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>SRBC lavati e conservati</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Xilazina di grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td></td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-110-20</td><td>Grado farmaceutico</td></tr></tbody></table>

fagocitosi del macrofago alveolare e la clearance di batteri nei topi

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

I macrofagi alveolari (ma) guardia spazio alveolare del polmone. Fagocitosi di AMs svolge un ruolo critico nella difesa contro l'invasione di agenti patogeni, la rimozione delle cellule morte o particelle estranee e nella risoluzione della risposta infiammatoria e rimodellamento del tessuto, i processi che sono mediati dai vari recettori di superficie di L'AMs. Qui, segnaliamo i metodi per l'analisi della funzione fagocitica di AMs utilizzando saggi in vitro e in vivo e strategie sperimentali per differenziare il modello riconoscimento del recettore - complemento recettore- e Fc gamma ricevitore-mediata fagocitosi. Infine, si discute un metodo per stabilire e caratterizzare un modello di polmonite di p. aeruginosa nei topi per valutare la clearance batterica in vivo. Questi saggi rappresentano i metodi più comuni per valutare le funzioni AM e possono anche essere utilizzati per studiare la funzione del macrofago e lo spazio batterico in altri organi.

Abbiamo effettuato prima l'esperimento per analizzare fagocitosi da mouse primario AMs. Nel corso di tutte le analisi, abbiamo confrontato AMs isolati da topi WT e TRIM72KO . Come illustrato nella Figura 1A, microscopia di fluorescenza ha rivelato che fagocitosi di FITC-vetro perline da mouse AMs primario si verifica dopo 1 h di incubazione. Figura 1 B Mostra l'analisi della fagocitosi...

Qui segnaliamo i metodi comuni per analizzare la funzione fagocitica dei macrofagi alveolari murini e lo spazio batterico dal polmone. Questi metodi di studio in vitro fagocitosi dei branelli di isotiocianato di fluorescina e fagocitosi in vivo di Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Inoltre descriviamo un metodo per l'eliminazione di p. aeruginosa nei topi.

Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa è un agente patogeno di livello BSL-2. Ricordarsi di seguire tutte le pratiche di sicurezza di livello BSL-2 durante la manipolazione di questo organismo. Qui dimostreremo l'isolamento delle cellule primarie, la fagocitosi in vitro e l'analisi delle vie fagocitiche, la fagocitosi in vivo e la valutazione della clearance batterica nei topi.Una consegna intratracheale riuscita richiede pratica da padroneggiare. Assicurarsi che il microsprayer sia caricato correttamente, che l'ago sia tra le due pieghe vocali e che la velocità dello stantuffo sia adeguatamente controllata. Iniziare fissando il mouse in posizione supina con gli arti sparsi su un pannello di dissezione coperto da tovaglioli di carta e agganciando una corda sotto i denti anteriori per ritrarre la testa in modo che la trachea sia posizionata dritta e livellata.Disinfettare il mouse con il 70% di etanolo e utilizzare forcep regolari per estrarre la pelle sulla linea centrale del corpo. Usa le forbici chirurgiche per tagliare la pelle dall'addome alla parte superiore della gola. Utilizzare l'estremità smussata delle forbici chirurgiche standard per sezionare attentamente il muscolo della gola e i tess

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui, descriviamo i protocolli per la raccolta murini macrofagi alveolari, che risiedono le cellule immunitarie innate nei polmoni, e di esaminare la loro attivazione in risposta a co-coltura con nanoparticelle polianidride.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

I macrofagi hanno un ruolo centrale nella omeostasi e patologia in molti tessuti. Il protocollo presentato qui descrive i metodi per esaurire i...

Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

Fonte: Nagre, N., et al. Macrofagi alveolare, fagocitosi e eliminazione dei batteri nei topi. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra la valutazione della fagocitosi mediata dai recettori del complemento utilizzando globuli rossi di pecora opsonizzati con IgM e complemento, seguita dalla loro acquisizione da parte dei macrofagi del topo. L'entità della fagocitosi viene quantificata midendo un prodotto cromogenico blu formato tramite ossidazione catalizzata dall'emoglobina del diaminofluorene.

Modellazione della fagocitosi mediata dal complemento utilizzando globuli rossi opsonizzati in vitro

Prendiamo una coltura aderente di macrofagi murini.Tratta bene il test con un buffer contenente Wnt5A, una molecola di segnalazione, e il controllo solo con buffer.Infettare con un patogeno batterico e incubare.Nelle cellule di test, Wnt5A attiva una cascata di segnalazione che favorisce la riorganizzazione del citoscheletro per aumentare l'assorbimento batterico nei fagosomi, mentre le cellule di controllo prive di questo segnale interiorizzano meno batteri.Lavare per rimuovere i batteri non...

Potenziamento mediato da Wnt5A della clearance batterica nei macrofagi murini

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Mentre lo studio in vitro delle interazioni ospite-patogeno consente la caratterizzazione di specifiche risposte immunitarie, sono necessari modelli in vivo per osservare gli effetti di risposte complesse. Utilizzando l'esposizione a Candida albicans seguita da un'infezione polmonare mediata da Pseudomonas aeruginosa, abbiamo stabilito un modello murino di interazioni microbiche coinvolte nella patogenicità della polmonite associata al ventilatore.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Qui descriviamo il modello e l'approccio per studiare le funzioni dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi del cancro. Per dimostrare il ruolo di queste cellule nelle metastasi, è stato utilizzato il modello singenico (4T1) del carcinoma mammario in combinazione con la deplezione dei macrofagi alveolari con liposomi di clodronato.

Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l'inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

La presente comunicazione descrive le metodologie di isolamento e coltura dei macrofagi alveolari da esseri umani e modelli murini per scopi sperimentali.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare se l'esposizione all'ozono, un criterio di inquinante dell'aria, imponga l'efferocitosi alveolar in vivo. Questo protocollo utilizza reagenti e tecniche di uso comune e può essere adattato a più modelli di lesione polmonare per determinare gli effetti sull'efferocitosi del macrofagio alveolar.

Valutazione In Vivo dell'efferocitosi del macrofago alveo dopo l'esposizione all'ozono

Questo protocollo descrive l'isolamento dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) e il loro trasferimento adottivo dopo stimolazione IL-33 degli alveoli polmonari in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).

Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo

Scopri metodi per analizzare la fagocitosi dei macrofagi alveolari murini e valutare la clearance batterica polmonare in vivo. Queste tecniche aiutano a studiare le risposte immunitarie contro Pseudomonas aeruginosa.

Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi

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