Name: Effetto dellanticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Scopri come generare osteoclasti puri dal midollo osseo murino e valuta gli effetti dell'anticorpo Anti-c-fms sull'osteoclastogenesi. Questo metodo offre potenziale terapeutico per malattie ossee infiammatorie.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un KAKENHI JSPS concedere della Japan Society per la promozione della scienza (n. 16K 11776 a H. K., n. 17K 17306 a K. S., n. 16K 20637 a K.k., n. 16K 20636 a S., n. 18K 09862 dei. M.).

Tutte le procedure di animale e cura degli animali sono state eseguite secondo norme e regolamenti di Università di Tohoku.
1. manipolazione e dissezione murino Hindlimb
<ol><li>Prima della dissezione, riempire un piatto con circa 50 mL di α-MEM a seconda delle dimensioni del contenitore e collocarlo sul ghiaccio. Questo servirà come un contenitore di raccolta fino al completamento della dissezione di tutte le ossa. Per questo e i successivi esperimenti, utilizzare α-MEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 100 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina.</li>
	<li>Eutanasia del mouse C57Bl/6J per inalazione di una dose eccessiva di 5% isoflurane.</li>
	<li>Difficoltà il mouse in posizione supina con perni trafitto le palme e piedi e spruzzo accuratamente con etanolo al 70%.</li>
	<li>Fare un'incisione della pelle utilizzando forbici chirurgiche sterili e pinzette a livello dell'anca ed estenderlo fino ai piedi, esponendo i muscoli.</li>
	<li>Tagliare il tendine allegando il muscolo quadricipite ed il tendine di associare il muscolo bicipite femorale fino all'osso. Togliere i muscoli esponendo le articolazioni di anca e di ginocchio. Individuazione di questi tendini faciliterà liberando entrambi i muscoli da loro allegati senza lasciare tag dei tessuti molli. Non tagliare l'osso.</li>
	<li>Posizionare la forbice tra la testa del femore e spazio articolare e tagliati in essa liberando il femore ma mantenendo intatto l'osso. Ciò consentirà il distacco delle ossa senza il rischio di esporre il midollo osseo.</li>
	<li>Allo stesso modo tagliare via i muscoli allegare alla tibia. Tagliare la tibia gratis dal relativo collegamento all'articolazione della caviglia mantenendo intatto per evitare la contaminazione dell'osso.</li>
	<li>Raschiare eventuali tessuti molli rimanenti dal femore e tibia utilizzando le forbici lame e kimwipe e metterlo in un piatto con α-MEM posizionato su ghiaccio.</li>
</ol>2. murino Hindlimb del midollo osseo isolamento
<ol><li>Riempire una siringa ago 30g con α-MEM.</li>
	<li>Scollegare la tibia e femore dall'articolazione del ginocchio.</li>
	<li>Tagliare le estremità delle ossa lunghe da entrambi i lati con le forbici.</li>
	<li>Tenere l'osso dall'albero con una pinzetta, inserire l'ago nello spazio del midollo dell'osso e lentamente svuotare il contenuto del midollo in una piastra di coltura di 6 cm. L'osso apparirà bianca, che indica l'estrazione di tutto il contenuto del midollo osseo. Ripetere per tutte le ossa.</li>
	<li>Ceppo il midollo osseo estrarre utilizzando un colino di cella di 40 μm in nylon in una provetta conica per centrifuga da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Eliminare il supernatante, lavare con 5 mL di α-MEM e centrifugare a 300 x g per 5 min lavaggio ripetere per un totale di 2 volte.</li>
	<li>
Risospendere il pellet in 10 mL di α-MEM ed eseguire un conteggio delle cellule usando un emocitometro come segue:
	<ol>
<li>Fai una diluizione di 1:1 di sospensione cellulare aggiungendo 10 µ l di sospensione cellulare a 10 μL di 0,4% trypan blu in una provetta da 1,5 mL e dispensare una volta.</li>
		<li>Coprire l'emocitometro camera con una diapositiva e trasferire la sospensione di tintura l'emocitometro. È importante non sovraccaricare o sovra la camera e consentire la sospensione fino a riempire la camera per azione capillare.</li>
		<li>Posto l'emocitometro su una fase di microscopio. Utilizzando obiettivo 10x, concentrarsi sulla Piazza del centro. Contare tutte le celle vincolate da 3 linee. Per assicurarsi che le celle non vengono conteggiate due volte, contare gli angoli superiori e destro di ogni quadrato. Le cellule morte apparirà blu scuro, questi sono esclusi dal conteggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A seconda dell'applicazione a valle, le cellule del seme in un vaso di coltura appropriato. Per questo particolare esperimento, seguire la sezione 3.</li>
</ol>3. generazione di BMM
<ol><li>Semi 1 x 107 cellule/10 mL in un 10cm cultura piatto e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 ° C, 5% CO2 per 3 giorni.</li>
	<li>Dopo 3 giorni, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule vigorosamente con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) due volte per rimuovere le cellule non-aderenti, aggiungere 5 mL di tripsina EDTA 0.02% temperatura ambiente in PBS e incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 5 min.</li>
	<li>Staccare le cellule pipettando approfondita. Assicurarsi che le celle siano state staccate osservando la cultura sotto un microscopio (le cellule dovrebbero apparire arrotondato e galleggiante in media). Se le cellule rimangono attaccate, ripetere accuratamente il pipettaggio per staccarli. Quando le cellule sono state staccate, aggiungere 5 mL di α-MEM per inattivare la reazione.</li>
	<li>Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante e lavare con 5 mL di α-MEM.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 5 min e risospendere il pellet in 10 mL di α-MEM.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle cellule come precedentemente descritto al punto 2.7.1.</li>
	<li>Semi 1 x 106 cellule/10 mL in un 10cm cultura piatto e aggiungere M-CSF 100 ng/mL. La concentrazione finale di M-CSF è 100 ng/mL di terreno di coltura. Incubare la coltura a 37 ° C, 5% CO2 per 3 giorni.</li>
</ol>4. generazione di osteoclasti da BMM come precursori degli osteoclasti
<ol><li>Dopo 3 giorni, raccogliere le cellule allegate che rappresentano BMM come precursori degli osteoclasti, seguendo passaggi 3.2-3.7.</li>
	<li>BMM seme a 5 x 104 cellule/200 μL di α-MEM in un piatto ben 96. Aggiungere RANKL per una concentrazione finale di 50 ng/mL o TNF-α per una concentrazione finale di 100 ng/mL. Aggiungi M-CSF per una concentrazione finale di 100 ng/mL in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiunta dell'anticorpo anti-c-fms (concentrazioni finali di 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) ad ogni pozzetto.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 4 giorni. Cambiare supporto ogni altro giorno per 4 giorni.</li>
</ol>5. macchia di fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP)
<ol><li>Dopo 4 giorni di incubazione, aspirare delicatamente il terreno di coltura di ciascun pozzetto. Lavare ogni bene una volta con 200 μL di PBS 1X temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di formalina al 10% ad ogni pozzetto per la fissazione e incubare per 1 h a temperatura ambiente. La formalina di aspirare e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di 0,2% Triton X-100 in PBS a ciascuno per permeabilizzazione ed incubare per 1 h a temperatura ambiente. il X-100 Triton di aspirare e lavare ogni pozzetto 3 volte con acqua deionizzata.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di soluzione di macchia di trappola ad ogni pozzetto. Visualizzare la macchia sotto il microscopio. Ci vorranno da 10-30 min per la macchia a svilupparsi correttamente.</li>
	<li>Aspirare la macchia e lavare ciascun pozzetto con acqua deionizzata 3 volte ed asciugare all'aria. Conservare a temperatura ambiente per utilizzare in ulteriore osservazione.</li>
</ol>6. analisi di proliferazione
<ol><li>BMM seme come precursori degli osteoclasti a 5 x 103 celle/200 μL di α-MEM in un piatto ben 96. Aggiungi M-CSF per una concentrazione finale di 100 ng/mL in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiunta dell'anticorpo anti-c-fms (concentrazioni finali di 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 3 giorni senza cambiamento medio.</li>
	<li>Dopo 3 giorni, lavare le cellule con PBS 1X. Aggiungere 100 μL di α-MEM in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di soluzione di kit di conteggio delle cellule e incubare a 37 ° C, 5% CO2 per 2 h e determinare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, abbiamo studiato l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti RANKL-indotta, formazione di osteoclasti indotta da TNF-α e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti M-CSF-indotto. Abbiamo trovato che la quantità effettiva di anticorpo anti-c-fms per l'inibizione dell'osteoclastogenesi tra formazione di osteoclasti RANKL-indotta, TNF-α indotto da osteoclasto formazione e M-CSF-indotto di proliferazione dei precursori degli osteoclasti è diversa.
<p class="jove_conten...

Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate, e si differenziano da cellule staminali ematopoietiche attraverso la fusione di più precursori degli osteoclasti. Essi sono essenziali per il rimodellamento del tessuto osseo sano e contribuire al riassorbimento osseo patologico associato a malattie osteolitiche infiammatorie come l'artrite reumatoide e la malattia parodontale1.
Funzione di osteoclastogenesi e degli osteoclasti sono mediati da due fattori chiave; fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago. Sia M-CSF e RANKL sono importanti per la differenziazione di osteoclasto2. Un altro fattore che è stato indicato per indurre la formazione di osteoclasti da macrofagi del midollo osseo in vitro è il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α formazione mediata degli osteoclasti è stato indicato per essere critico per osteolisi in malattie ossee distruttive come artrite reumatoide6, malattia parodontale7e8di osteoporosi postmenopausale.
C-fms è il recettore di membrana di M-CSF e media la sua azione. Il ruolo di c-fms è ben documentato nella letteratura come è stato dimostrato che la somministrazione di un anticorpo contro c-fms (anticorpo anti-c-fms) completamente arrestato osteoclastogenesis in un modello di artrite come pure in TNF-α ha indotto le erosioni dell'osso mentre osteoclastogenesis lontano dall'articolazione infiammata era ancora robusto9. La somministrazione dell'anticorpo anti-c-fms ha inibito osteoclasto formazione e riassorbimento osseo indotto dal lipopolysaccharide (LPS) in mouse calvariae10 pure come LPS indotta periodontitis modello11. Inoltre, l'anticorpo anti-c-fms ha inibito il riassorbimento della radice indotta da stress meccanico durante di movimento ortodontico del dente12, come pure il movimento ortodontico del dente e riassorbimento osseo associato di movimento ortodontico del dente13.
M-CSF è stato segnalato per avere altre funzioni che sono essenziali per la risposta immunitaria. L'assenza di M-CSF in topi op/op con polmonite batterica portare all'aumento della carica batterica e la diffusione batterica al fegato con necrosi epatica14. Pertanto, M-CSF è importante per la risposta immunologica nella protezione dall'infezione.
Questo studio dimostra l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms su M-CSF e RANKL o TNF-α ha indotto la formazione degli osteoclasti in vitro e M-CSF ha indotto la proliferazione dei precursori degli osteoclasti. Questo protocollo viene illustrato l'isolamento delle cellule del midollo osseo murino da ossa lunghe e i passaggi per generare i macrofagi di midollo osseo (BMM) che sono considerati come precursori degli osteoclasti e per indurre la differenziazione delle BMM in osteoclasti multinuclear da due Metodi; RANKL o TNF-α. Il protocollo confronta anche l'arresto di osteoclastogenesi in entrambi i metodi usando l'anticorpo anti-c-fms.
Il processo mediante il quale midollo osseo viene estratta e successivamente utilizzato per generare precursori degli osteoclasti è affidabile nella produzione di grandi quantità di culture osteoclast puro che possono essere utilizzate in molteplici applicazioni a valle come test anti-droga. L'uso di RANKL o TNF-α per indurre il osteoclastogenesi in questo protocollo distingue osteoclastogenesi come un processo fisiologico (RANKL) da osteoclastogenesis come un processo patologico (TNF-α), che a sua volta prevede due procedure alternative per guidare la decisione di cui uno è superiore in termini di reagenti da utilizzare in applicazioni a valle. Questo protocollo fornisce inoltre un metodo mediante il quale possiamo determinare un'adeguata concentrazione di anticorpo anti-c-fms che può essere tranquillamente utilizzato per gli studi successivi coinvolti nel riassorbimento dell'osso e malattie osteolitiche.

<table><tbody><tr>Anticorpo <td></td><td></td><td>anti-c-Fms</td><td>AFS98, un anticorpo monoclonale di ratto, antimurino, c-Fms (IgG2a)</td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td></td><td></td><td>TNF-alfa murino ricombinante, preparato nel nostro laboratorio. TNF-&alfa; Frammento di cDNA clonato mediante RT-PCR e clonato in un pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) per generare una proteina di fusione GST. GST-TNF-&alfa; è stato espresso nelle cellule BL21 di Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA). Le cellule sono state lisate in condizioni non denaturanti e GST-TNF-&alfa; è stato purificato su una colonna di glutatione-sefarosio. La GST è stata scissa dalla PreScission Protease (Amersham Biosciences) dal produttore ed è stato rimosso da una colonna di glutatione-sefarosio.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Ligando murino-ricombinante sRANK, Fonte: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF M-CSF</td><td></td><td></td><td>umano ricombinante. 1/10 vol di CMG14&ndash; 12 surnatante di coltura di linea cellulare a 5x106&nbsp; cellule in una piastra di coltura in sospensione di 10 cm.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>con L-Glutammina e rosso fenolo</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Siero fetale bovino Origine francese Piatto</td></tr><tr><td>di coltura</td><td>Corning</td><td></td><td>100 mm x 20 mm piastra a</td></tr><tr><td>96 pozzetti</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Delta kit</td></tr><tr><td>di conteggio delle cellule-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Sunrise REMOTE; Tekan Giappone, Kawasaki, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Corning</td><td></td><td>40 &mu; m Nylon</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga</td><td>Corning</td><td></td><td>50 mL Tappo CentriStar</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Poliossietilene (10) Etere ottiliferico</td></tr></tbody></table>

effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti in vitro

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Rimodellamento osseo è un processo complesso e coinvolge periodi di deposizione e di riassorbimento. Riassorbimento dell'osso è un processo mediante il quale osso è ripartito dagli osteoclasti in risposta a stimoli diversi. Precursori degli osteoclasti differenziano in osteoclasti multinuclear in risposta al fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago. In circostanze patologiche, il profilo di citochina è diverso e coinvolge una miscela di citochine infiammatorie. Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) è una delle più importanti citochine come si trova in grandi quantità nelle aree coinvolte con osteolysis infiammatorio. Lo scopo del presente protocollo è quello di fornire un metodo mediante il quale midollo osseo murino è isolato per generare osteoclasti attraverso induzione con M-CSF e RANKL o TNF-α, che verrà successivamente inibita aumentando le dosi dell'anticorpo anti-c-fms, il recettore per M-CSF. Questo esperimento evidenzia il valore terapeutico dell'anticorpo anti-c-fms in malattie di riassorbimento infiammatorio dell'osso.

Lo scopo del presente protocollo è di valutare l'effetto dell'anticorpo anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti in presenza di RANKL o TNF-α e di determinare l'effetto di M-CSF sulla proliferazione dei precursori degli osteoclasti. In questo protocollo, abbiamo fornito un affidabile processo mediante il quale vengono generate grandi quantità di culture osteoclast puro. Abbiamo anche fornito un modo per testare l'anticorpo anti-c-fms concentrazione adatto per inibire la formazione di...

Questo protocollo comprende dissezione delle ossa lunghe murine e isolamento del midollo osseo, per generare i macrofagi del midollo osseo e producono gli osteoclasti usando fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago o fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e loro arresto dall'anticorpo anti-c-fms, ricevitore di M-CSF.

Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Questo esperimento evidenzia il valore terapeutico dell'anticorpo Anti-c-fms nelle malattie di disturbo infiammatorio osseo, come l'artrite reumatoide e la parodontite. Il processo con cui il midollo osseo viene estratto e utilizzato per generare precursori di osteoclasti, produce grandi quantità di osteoclasti puri, che possono essere utilizzati in molteplici applicazioni a valle. Questo protocollo fornisce due metodi alternativi di osteoclastogenesi, utilizzando ligando RANKL o TNF alpha.Inoltre, questo metodo fornisce informazioni sull'effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sull'osteoclastogenesi. La dimostrazione visiva di questa procedura familiarizza il ricercatore con il processo di dissezione e l'ottenimento di cellule del midollo osseo in grandi quantità. Per iniziare riempire un piatto che fungerà da contenitore di raccolta con circa 50 millilitri di MEM alfa, a seconda delle dimensioni del contenitore, e posizionarlo sul ghiaccio.Utilizzare perni per perforare i palmi e i piedi di un topo eutanasiato per fissarlo in posizione supina e spruzzare accuratamente con il 70% di etanolo. Usa forbici chirurgiche sterili e pinzette per fare un'incisione cutanea a livello dell'anca ed estenderla fino ai piedi, esponendo i muscoli. Individuare e tagliare il tendine attaccando il muscolo quadricipite.Stacca il muscolo e taglialo a livello dell'anca. Quindi individuare il tendine che attacca il muscolo del tendine del ginocchio all'osso. Staccare i muscoli esponendo l'osso e liberare il tendine del ginocchio dal suo attaccamento, assicurandosi di non tagliarlo all'osso.Posizionare le forbici tra la testa del femore e lo spazio articolare. Tagliarlo liberando il femore, ma mantenendo intatto l'osso, il che consentirà il distacco delle ossa senza il rischio di esporre il midollo osseo. Tagliare i muscoli attaccati alla tibia in modo simile.Quindi tagliare la tibia libera dal suo attacco all'articolazione della caviglia, mantenendo intatto l'osso per evitare contaminazioni. Utilizzare le lame a forbice e le salviette da laboratorio per raschiare qualsiasi tessuto molle rimanente dal femore e dalla tibia e posizionarli nella piastra preparata con mem alfa posto sul ghiaccio. La dissezione deve essere eseguita con cura per ridurre al minimo la contaminazione.Ecco perché la rimozione approfondita dei tessuti molli e la localizzazione ossea sono cruciali. Riempire una siringa ad ago calibro 30 con alpha MEM. Scollegare la tibia e il femore lontano dall'articolazione del ginocchio e tagliare le estremità dell'osso lungo da entrambi i lati usando le forbici.Utilizzare una pinzetta per tenere l'osso dall'albero. Inserire l'ago nello spazio del midollo all'osso e sciacquare lentamente il contenuto del midollo in un piatto di coltura di sei centimetri e ripetere per tutte le ossa. L'osso diventerà bianco, indicando l'estrazione di tutto il contenuto di midollo osseo.Utilizzare un colino a celle in nylon da 40 micrometri per filtrare l'estratto di midollo osseo in un tubo di centrifuga conica da 50 millilitri. Centrifugare il tubo a 300 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante.Per lavare, aggiungere cinque millilitri di MEM alfa al pellet. Pipettare le cellule per staccarle, centrifughe e ripetere il lavaggio per un totale di due volte. Dopo aver contato queste cellule isolate, come descritto nel manoscritto, seminare 10 milioni di cellule per 10 millilitri, in un piatto di coltura di 10 centimetri, e aggiungere M-CSF alle cellule.Incubare la coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per tre giorni. Rimuovere il mezzo dopo tre giorni e lavare le cellule due volte vigorosamente con 10 millilitri di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Aggiungere cinque millilitri di temperatura ambiente allo 0,02% di tripsiderina-EDTA e PBS e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per cinque minuti.Pipettare accuratamente le cellule per staccarle. Osservare la coltura al microscopio per assicurarsi che le cellule siano state staccate e appaiano arrotondate e fluttuanti nei supporti. Quando le cellule sono state staccate, disattivare la reazione aggiungendo cinque millilitri dell'alfa MEM.Raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo aver scartato il supernatante, lavare con cinque millilitri di MEM alfa e centrifugare di nuovo a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere di nuovo il pellet in 10 millilitri di MEM alfa.Semina 1 milione di cellule per 10 millilitri in un piatto di coltura di 10 centimetri e aggiungi M-CSF. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per tre giorni. Raccogliere le cellule attaccate, che rappresentano i BBM come precursori dell'osteoclasta dopo tre giorni, come fatto in precedenza durante la generazione di BBM.Seminare i BBM a 50.000 cellule per 200 micro litri di MEM alfa in una piastra di 96 pozzi per pozzo. Ad ogni bene, aggiungere gli stimoli desiderati. E poi aggiungere M-CSF per una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro.Aggiungere anticorpo anti-c-fms ad ogni pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per quattro giorni, cambiando i supporti a giorni diversi per quattro giorni. E poi procedere con colorazione e saggi, come descritto nel manoscritto.È stata valutata la formazione di osteoclasti nella coltura trattata con M-CSF e RANKL, con anticorpo Anti-c-fms. Con 101.000 nanogrammi per millilitro Anticorpo anti-c-fms, è stata osservata una significativa diminuzione del numero di osteoclasti rispetto al controllo. Mentre, con un anticorpo anti-c-fms su 10 per millilitro, non c'è stata alcuna diminuzione significativa.Quindi, è stata valutata la formazione di osteoclasti nella coltura trattata con M-CSF e TNF alfa, con anticorpo Anti-c-fms. Con 10, 100, 1.000 nanogrammi per millilitro Anticorpo Anti-c-fms, è stata osservata una significativa diminuzione del numero di osteoclasti rispetto al controllo, senza alcuna diminuzione significativa a un nanogrammo per millilitro. E la coltura M-CSF con 1, 10, 100 nanogrammi per millilitro Anticorpo Anti-c-fms, non c'è stata alcuna diminuzione significativa del numero di precursori osteoclasti rispetto al controllo.Tuttavia, a 1.000 nanogrammi per millilitro, c'è stata una significativa diminuzione del numero di precursori dell'osteoclasto, indicando che è necessaria una concentrazione fino a 1.000 nanogrammi per millilitro per inibire significativamente la proliferazione dei precursori dell'osteoclasto. Assicurati di liberare i legami mantenendo intatto l'osso, il che ridurrà al minimo la possibilità di contaminazione.

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Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

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