Name: La formazione immagine a risonanza magnetica valutazione dei tumori della vescica murino indotto da agente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Impara a valutare i tumori della vescica nei topi C57BL/6 mediante risonanza magnetica dopo induzione con BBN. Questo protocollo rapido consente imaging ad alto rendimento con minimo stress per gli animali.

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J. J. M. è finanziato dal merito di Veterans Health Administration concedere BX0033692-01. J. J. M. è anche supportato da John P. Hanson Foundation per la ricerca sul cancro presso il Robert H. Lurie completa Cancer Center della Northwestern University. Ringraziamo il centro per Imaging traslazionale per fornire l'acquisizione di MRI e di elaborazione. Fonti di finanziamento non avevano alcun ruolo nella scrittura del manoscritto o della decisione di presentare per la pubblicazione.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Northwestern University.
1. induzione di tumori con BBN
<ol><li>Ottenere topi C57/BL6 maschii, ogni almeno 6 settimane di età. Nota: I topi maschii di sviluppano cancro alla vescica in modo più rapido e coerente di topi femmina14,15.</li>
	<li>Aggiungi N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) ammina (BBN) ad una dose di 0.05% all'acqua potabile. Conservarla in un contenitore opaco e fornirlo ad libitum come acqua potabile ai topi16. Nota: Conservare la soluzione BBN in un contenitore trasparente si degrada il cancerogeno17.</li>
	<li>Cambiare l'acqua BBN 0.05% due volte alla settimana.</li>
	<li>Monitorare gli animali tramite il controllo per i segni di disagio associato con i tumori della vescica compreso ematuria, costante della vescica e masse. Ispezionare i topi due volte alla settimana o secondo le linee guida locali IACUC.</li>
	<li>Si aspettano i tumori di sviluppare tra 16 e 24 settimane di esposizione18.</li>
</ol>2. installazione MRI
<ol><li>Eseguire un'iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica sterile (0,1 – 0,2 mL utilizzando una siringa di ago e 1ml di 25 – 27 G) 10 min prima del MRI per facilitare il riempimento della vescica.</li>
	<li>Anestetizzare ogni mouse con una miscela di gas di 100% O2 e isoflurano (2%-4% se necessario). Il riflesso di ritiro (pizzico di punta) prima di procedere verificare un adeguato piano di anestesia. Applicare unguento oculare sterile per l'animale.</li>
	<li>Trasferisce il mouse al titolare della imaging dotato di una punta conica per la consegna di inalazione isoflurane (0,5% – 3%).</li>
	<li>Monitorare la temperatura corporea e respirazione usando una sonda di temperatura rettale connessa al computer di registrazione fisiologica. Nota: La temperatura corporea normale (36 – 37 ° C) viene mantenuta utilizzando il circuito ricircolo di acqua calda integrato nell'animale attacco MR. Temperatura è misurata tramite un sensore rettale e registrata sul computer di monitoraggio fisiologico tramite apposito software di monitoraggio fisiologico. Lo stesso sistema è utilizzato per registrare i segnali di respirazione ed elettrocardiogramma misurati attraverso un cuscino pneumatico posizionato sotto la gabbia toracica e tramite elettrodi 3 derivazioni dell'elettrocardiogramma. Il segnale di respirazione è anche utilizzato per trigger acquisizione di MRI e riducendo gli elementi associati a movimento di respirazione.</li>
</ol>3. acquisizione di immagini MRI
<ol><li>Utilizzare una bobina del corpo di quadratura per l'eccitazione.</li>
	<li>Posizionare una bobina ricevente 4 canali sull'addome inferiore del mouse sottoposto a scansione per abilitare il rilevamento ottimizzato dei segnali dalla regione di interesse.</li>
	<li>Avviare regolazioni automatiche attraverso il software di imaging integrato di acquisire un tri-assiale set di immagini del corpo intero del mouse. Da questo insieme di riferimento delle immagini, è necessario identificare l'area di interesse (in questo caso, la regione della vescica).</li>
	<li>Acquisire tre insiemi di immagini ortogonali affettato lungo i piani assiali, coronali e sagittali utilizzando radiologica fotogrammi di riferimento.</li>
	<li>Utilizzare il vero FISP imaging sequenza (incluso come una delle caratteristiche del software di imaging integrato) con i seguenti parametri di MR: TR = 900 msec, TE = 2 ms, FA = 70, 14 medie. Nota: Questo set di parametri consente per rappresentazione rapida con alta qualità diagnostica, tra cui ponderazione T1/T2 in < 10 min per topo.</li>
	<li>Spaziale ad alta risoluzione e fetta di spessore sono determinati dalla parametri geometrici selezionati dall'utente tramite l'interfaccia grafica della piattaforma imaging integrata. Ciò comporta una serie di fette attraverso l'intera vescica di 0,5 mm di spessore con una risoluzione in-aereo di 0,148 millimetri.</li>
</ol>4. signor analisi dell'immagine
<ol><li>Identificare l'insieme delle fette dello spessore di 0,5 mm e risoluzione in piano di 0,148 mm che copre l'intera vescica.</li>
	<li>Esportare il software di analisi di immagini mediche selezionando la cartella con le immagini corrispondenti in formato ANALYZE.</li>
	<li>Selezionare "vista assiale rappresentanza" al centro della vescica per analisi quantitativa scorrendo le immagini generate e identificando una fetta al punto mediano della vescica, che permette per la visualizzazione della parete della vescica e del lume. Nota: La fetta di centro dovrebbe essere il prescelto con il diametro più grande.</li>
	<li>Delineare con attenzione la regione di interesse (ROI) tracciando manualmente i confini intorno al bordo esterno della vescica (BLAfuori) e dintorni il lume interno (BLAin) della vescica (Vedi figure schematiche e rappresentante nella Figura 2) nella vista assiale rappresentativa selezionata.</li>
	<li>Sottrarre il lume interno dal bordo esterno per calcolare l'area della superficie della parete della vescica. BLAparete = BLAfuori - BLAin Nota: L'area della superficie di una vescica di controllo con nessun tumore dovrebbe essere inferiore a quello con un tumore della vescica.</li>
</ol>5. l'eutanasia e la dissezione della vescica
<ol><li>Dopo 20 settimane di esposizione BBN, eutanasia i topi utilizzando procedure operative standard in conformità con le linee guida locali IACUC.</li>
	<li>Pulire l'area dell'incisione con etanolo al 70%, poi afferrare e sollevare la pelle della parete addominale con il forcipe.</li>
	<li>Fare un'incisione del midline dalla sinfisi pubica al processo xifoideo.</li>
	<li>Acutamente incise la cavità peritoneale da afferrare con una pinza e incisione con le forbici.</li>
	<li>Identificare la vescica, che si trova nell'addome inferiore del midline.</li>
	<li>Identificare e tagliare il legamento ombelicale mediano che collega la cupola della vescica al umbilicus e parete addominale.</li>
	<li>Afferrare la cupola della vescica con la pinzetta per fornire reggibacino e sezionare la vescica dalle strutture, tra cui le vescicole seminali, il retto ed il grasso circostanti.</li>
	<li>Identificare gli ureteri entrando la vescica e tagliare con le forbici vicino la vescica.</li>
	<li>Sollevamento cephalad la vescica, l'uretra di tagliare con le forbici e rimuovere la vescica.</li>
	<li>Pesare immediatamente la vescica dopo risciacquare con PBS.</li>
</ol>6. l'esame istologico del tessuto della vescica
<ol><li>Fissare il tessuto della vescica in 10% formalina neutra tamponata per 36 – 48 h a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Incorporare il tessuto in blocchi di paraffina, i vetrini per l'esame successivo di tagliare e colorare i vetrini con ematossilina ed eosina per esame al microscopio come descritto in precedenza19,20.</li>
	<li>Eseguire un esame al microscopio della vescica del mouse in basso (2.5 x e x 10) e alta (20x e 40x) ingrandimenti, esaminando per le lesioni macroscopiche, iperplasia, il carcinoma in situ, papillomi, tumori papillari e neoplasma dilaganti19 , 21.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Accurato imaging di modelli del tumore è necessario appropriato pre-eutanasia staging e randomizzazione animale prima dell'inizio del trattamento sperimentale. Utilizzando la procedura presentata qui, dimostriamo metodologia per (1) generare tumori della vescica utilizzando l'agente cancerogeno BBN e (2) stratificare il carico del tumore della vescica attraverso l'uso di Mr MR An-derivato zona misura (BLAparete) correla significativamente con ex vivo peso della vescica ed è associato con la fase patol...

Cancro alla vescica è il quinto tumore più comune nel complesso, responsabile di circa 80.000 nuovi casi e 16.000 morti negli Stati Uniti nel 20171. Dopo circa 30 anni senza progressi significativi nel trattamento sistemico della vescica cancro2, prove recenti di inibitore anti-PD-1 e anti-PD-L1 checkpoint hanno dimostrato risposte emozionante e durevole occasionalmente in pazienti con avanzato urothelial carcinoma3,4,5. Tuttavia, solo circa il 20% dei pazienti mostrano una risposta obiettiva a questi trattamenti, e ulteriori studi sono necessari per espandere l'uso efficace di immunoterapia in pazienti con cancro alla vescica.
Modelli del cancro della vescica murino sono strumenti critici nella valutazione preclinica di nuovi trattamenti6,7. Al fine di controllare per dimensioni del tumore quando randomizing topi ai diversi trattamenti, carico del tumore deve essere valutato e controllato tra gruppi di trattamento. Gli studi precedenti hanno usato ultrasuono o bioluminescenza per valutare orthotopic cella basata su riga vescica cancro modelli8,9,10,11. Tuttavia, entrambe le tecniche presentano diversi svantaggi. Misurazioni agli ultrasuoni possono essere influenzate dalla abilità dell'operatore e mancano di caratteristiche tridimensionali e ad alta risoluzione spaziale. Metodi di bioluminescenza possono fornire solo la valutazione semi-quantitativa delle cellule del tumore e non consentono per la visualizzazione della vescica anatomia e morfologia. Inoltre, bioluminescenza può essere utilizzato solo con modelli basati su linee cellulari, che esprimono geni bioluminescente in topi glabri o topi con camici bianchi.
La formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), d'altra parte, offre flessibilità unica nell'acquisizione di immagini ad alta risoluzione anatomiche, che espone una vasta gamma di contrasto del tessuto che consente una visualizzazione accurata e valutazione quantitativa del carico del tumore senza il bisogno di esprimere proprietà bioluminescenti. Immagini di MR sono più facilmente riproducibili con le opportune analisi condotte e garantite visualizzazione 3-d della vescica. Le più grandi limitazioni di MRI sono la lunghezza del tempo necessario per un esame e associati costi elevati che limitano l'elevato throughput saggi. Tuttavia, parecchi studi hanno indicato che le sequenze di RM possono fornire immagini diagnostiche di alta qualità che possono essere utilizzate per rilevare efficacemente e monitorare i tumori delle cellule della vescica basata su riga; così, essi possono essere utilizzati per alta velocità effettiva analisi9,12.
Qui, descriviamo un metodo non invasivo basato su MR per attendibilmente ed efficientemente caratterizzano i tumori della vescica indotta da agente cancerogeno nei topi. A tale scopo, utilizziamo un imaging veloce con tecnica di MR di precessione di stato stazionario (true FISP), che garantisce brevi sessioni di scansione pur fornendo alta qualità e alta risoluzione spaziale (~ 100 micron) per la rilevazione e la misura della vescica i tumori13. Inoltre, per confermare l'accuratezza di questo test non invasivo di MRI, descriviamo la correlazione tra parametri MRI-derivato ed ex vivo della vescica peso così come la fase del tumore patologico confermato.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>topi</td></tr><tr><td>N-butil-N-(4-idrossibutil)nitrosamina cancerogeno (BBN)</td><td>TCI American</td><td>B0938</td><td>cancerogeno</td></tr><tr><td>0,9% soluzione salina normale</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-488-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal HealthCare</td><td>60307-120-25</td><td>Anestetico</td></tr><tr><td>7Tesla ClinScan MRI</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td>Imaging dedicato per piccoli animali MRI</td></tr><tr><td>MR MR Syngo</td><td>Siemens</td><td>NA</td> MR <td>Software di imaging integrato</td></tr><tr><td>Modello 1030 Monitoraggio e Gating System</td><td>Small Animal Instruments, Inc. (SAII)</td><td>NA</td><td>Monitoraggio fisiologico dei piccoli animali</td></tr><tr><td>Formalina, neutro tamponato, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td>Fissativo</td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1093844</td><td>Agente di colorazione istologica</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245651</td><td>Agente di colorazione istologica</td></tr><tr><td>Jim7</td><td>Xinapse Systems</td><td>NA</td><td>Software di analisi delle immagini mediche</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v7.04</td><td>Graphpad</td><td>NA</td><td>Software grafico</td></tr><tr><td>R v3.4.2</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Software statistico</td></tr><tr><td>Pacchetto R pROC v1.10.0.</td><td>Il progetto R per il calcolo statistico</td><td>NA</td><td>ROC analysis</td></tr></tbody></table>

la formazione immagine a risonanza magnetica valutazione dei tumori della vescica murino indotto da agente

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

Modelli di tumore della vescica murino sono fondamentali per la valutazione di nuove opzioni terapeutiche. Tumori della vescica indotti con l'agente cancerogeno nitrosamina (BBN) di N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) sono vantaggiosi rispetto ai modelli basati su linee cellulari perché essi strettamente replicare i profili genomici dei tumori umani, e, a differenza di modelli cellulari e gli xenotrapianti, forniscono un buona occasione per lo studio delle immunoterapie. Tuttavia, la generazione del tumore della vescica è eterogenea; Pertanto, una valutazione accurata del carico del tumore è necessario prima di randomizzazione al trattamento sperimentale. Descritto qui è un modello murino BBN e protocollo per valutare vescica cancro tumore onere in vivo utilizzando una sequenza veloce e affidabile a risonanza magnetica (MR) (true FISP). Questo metodo è semplice e affidabile perché, a differenza di ultrasuono, signor è indipendente dall'operatore e consente l'elaborazione semplice post-acquisizione immagini e recensione. Usando immagini assiali della vescica, l'analisi delle regioni di interesse lungo la parete della vescica e del tumore permette il calcolo della superficie di parete e del tumore della vescica. Questa misurazione correla con ex vivo peso della vescica (rs= 0,37, p = 0,009) e Stadio del tumore (p = 0,0003). In conclusione, BBN genera tumori eterogenei che sono ideali per la valutazione delle immunoterapie e MRI può rapidamente e valutare in modo affidabile il carico del tumore prima della randomizzazione a bracci di trattamento sperimentale.

Mediante il protocollo descritto (Figura 1), i tumori della vescica sono state indotte in di topo maschio C57/B6. MRI è stato effettuato a 16 settimane, e topi sono stati eutanasizzati a 20 settimane. Ex vivo pesi della vescica (BW) per ogni mouse sono stati registrati. Vetrini sono stati colorati con ematossilina ed eosina, e tutte le diapositive di istologia sono state esaminate per la fase del tumore.
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Tumori della vescica murino sono indotti con l'agente cancerogeno nitrosamina di N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Generazione del tumore della vescica è eterogenea; Pertanto, una valutazione accurata del carico del tumore è necessario prima di randomizzazione al trattamento sperimentale. Qui presentiamo un protocollo di MRI veloce e affidabile per valutare la fase e dimensioni del tumore.

La formazione immagine a risonanza magnetica valutazione dei tumori della vescica murino indotto da agente

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

Questa metodologia può essere utilizzata per generare riproducibilmente tumori della vescica usando l'agente cancerogeno BBN e per immaginare le dimensioni e l'estensione del peso del tumore della vescica attraverso la risonanza prima. Questa tecnica utilizza un approccio di imaging rapido indipendente dall'operatore con brevi tempi di acquisizione ad alta qualità diagnostica per condurre test ad alta produttività dei topi nelle fasi intermedie dello sviluppo tumorale. Per indurre la formazione di tumori del cancro alla vescica, aggiungere lo 0,05% di BBN a un contenitore opaco di acqua potabile e fornire l'acqua ai sei topi neri C57 di 6 settimane ad libitum.Quindi monitorare gli animali due volte a settimana per il segno di angoscia associato ai tumori della vescica in conformità con le linee guida locali della IACUC. Da 16 a 24 settimane dopo l'esposizione, caricare una siringa millilitro dotata di un ago calibro da 25 a 27 con da 100 a 200 microlitri di soluzione salina sterile e iniettare la soluzione salina sottocutaneamente in un animale trattato con BBN. Dopo 10 minuti, trasferire il mouse nel supporto di imaging di un dispositivo di imaging a risonanza magnetica e inserire una sonda di temperatura rettale collegata al computer di registrazione fisiologico per monitorare la temperatura corporea dell'animale.Quindi, posizionare una bobina del ricevitore di quadratura a 4 canali sopra l'addome inferiore del mouse e avviare regolazioni automatiche nel software di imaging integrato per acquisire un set triassiale di immagini di tutto il corpo del mouse. Da questo insieme di riferimenti di immagini, identificare la regione di interesse e acquisire tre serie di immagini affettate ortogonali lungo i piani assiale, coronale e sagittale. Utilizzando la vera immagine veloce con sequenza di imaging di progressione in stato stazionato, impostare tr su 900 millisecondi, TE su due millisecondi e fa su 70, 14 medie.Quindi selezionare i parametri geometrici appropriati all'interno del software della piattaforma di imaging per ottenere una serie di fette su tutta la vescica di spessore di 0,5 millilitri e una risoluzione in piano di 0,148 millimetri. Una volta ottenute tutte le immagini, esportare il set di fette che coprono l'intera vescica in un appropriato programma software di analisi delle immagini mediche e scorrere le immagini generate per individuare una fetta nel punto centrale della vescica che consente la visualizzazione della parete della vescica e del lume per selezionare la vista assiale rappresentativa al centro della vescica per l'analisi quantitativa. Quindi traccia i confini attorno al bordo esterno e al lume interno della vescica per delineare attentamente la regione di interesse all'interno della vista assiale rappresentativa selezionata e sottrarre il lume interno dal bordo esterno per calcolare l'area di superficie della parete della vescica.20 settimane dopo l'esposizione al BBN, pulire l'area di incisione con il 70% di etanolo e utilizzare le forcep per sollevare la pelle della parete addominale. Fare un'incisione della linea mediana dalla sinfisi pubica al processo xifoide e afferrare il peritoneo per consentire una forte incisione della cavità peritoneale. Identificare la vescica nell'addome inferiore della linea mediana, usando le forcep per afferrare la cupola della vescica.Sezionare la vescica lontano dalle strutture circostanti, comprese le vescicole seminali, il retto e il grasso. Tagliare il legamento ombelicale mediano che collega la cupola della vescica all'ombelicale e alla parete addominale. Tagliare gli ureteri vicino alla vescica e sollevare il cefalato vescica, tagliare l'uretra per rimuovere la vescica.Quindi sciacquare la vescica asportata con PBS e pesare immediatamente il tessuto su un bilanciere. Qui, vengono mostrate immagini rappresentative di risonanza magnetica a progressione dello stato stazionario delle ricostruzioni 3D della parete della vescica e immagini patologiche di un topo con un grande tumore e di un topo di controllo senza tumore. Lo spessore della parete vescicale derivato dalla risonanza magnetica è correlato settimanalmente con le misurazioni del peso della vescica ottenute ex vivo.L'esame dello spessore della parete vescicale derivato dalla risonanza prima e dei dati del peso della vescica ottenuti ex vivo dimostra anche un'associazione con lo stadio tumorale e un'associazione quando si stratifica la patologia da cancro alla vescica invasivo non muscolare e cancro della vescica invasivo muscolare. Tieni presente che è meglio acquisire le immagini nei topi quando hanno una vescica piena. Dopo l'imaging MR dei tumori della vescica, i topi possono essere divisi in coorti con caratteristiche tumorali simili, a caso.Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare nuove immunoterapie e altri trattamenti per migliorare i risultati per i nostri pazienti. È importante ricordare che il BBN è cancerogeno e che la precauzione appropriata deve sempre essere presa quando si maneggia questo composto.

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Tumori della vescica sono stabiliti in topi femmina in modo minimamente invasivo con il cateterismo, cauterizzazione locali, e l'adesione successiva delle cellule di carcinoma ai siti bruciare.

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Stabilire un modello di tumore della vescica ortotopica per valutare gli effetti antitumorali di sarna via endovescicale consegnate e monitoraggio della crescita tumorale con l'ecografia e imaging bioluminescente.

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Impianto di cellule tumorali nell'organo di origine può servire come un modello preclinico utile per valutare nuove terapie. Cellule di carcinoma della vescica MB49 possono essere coltivate all'interno della vescica seguente instillazione intravescicale. Questo protocollo dimostra cateterizzazione della vescica topo a scopo di impianto tumorale e consegna adenovirale.

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La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

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Qui viene descritto il metodo per stabilire un modello murino singenico di tumore ortotopico della vescica per valutare l'efficacia antitumorale della proteina batterica HP-NAP.

Valutazione dell&#39;efficacia della<em&gt; H. pylori</em&gt; Proteine ​​HP-NAP come strumento terapeutico per il trattamento del cancro della vescica in un ortotopico Modello murino

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica ortotopico murini in femmine C57BL 6J e il monitoraggio della crescita tumorale /.

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Questo protocollo utilizza un letto a più camere per immagini a risonanza magnetica parallela (MRI) di fino a quattro animali al fine di rilevare tumori adenocarcinomi pancreatici in modelli murini geneticamente modificati. Questo protocollo di risonanza magnetica multi-animali è rapido ed economico per la rilevazione e la misurazione dei tumori, facilitando la selezione degli animali per studi preclinici e il monitoraggio longitudinale della crescita tumorale.

Imaging a risonanza magnetica multianimale per misurazioni tumorali in modelli topini di cancro al pancreas

Impara a valutare i tumori della vescica nei topi C57BL/6 mediante risonanza magnetica dopo induzione con BBN. Questo protocollo rapido consente imaging ad alto rendimento con minimo stress per gli animali.

La formazione immagine a risonanza magnetica valutazione dei tumori della vescica murino indotto da agente

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