Name: Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Impara a coltivare microalghe in fotobioreattori a colonna di bolle per studi sui biocarburanti. Questo metodo economico e personalizzabile consente di misurare tassi di crescita e contenuto lipidico neutro.

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Il supporto per questa ricerca è stato fornito dallo USDA National Institute of Food e agricoltura Hatch progetto ALA0HIGGINS e gli uffici di Università Auburn del Prevosto, il Vice Presidente per la ricerca e la Samuel Ginn College di ingegneria. Supporto è stato fornito anche da NSF concedere CBET-1438211.

<ol><li>Prandini, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+nutrient+removal+from+swine+wastewater+digestate+coupled+to+biogas+purification+by+microalgae+Scenedesmus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp.</a> Bioresource Technology. , 67-75 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycoremediation+of+dairy+and+winery+wastewater+using+Diplosphaera+sp.+MM1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1.</a> Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).</li>
<li>Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dairy+Wastewaters+for+Algae+Cultivation%2C+Polyhydroxyalkanote+Reactor+Effluent+Versus+Anaerobic+Digester+Effluent%5BTitle%5D)+AND+%22BioEnergy+Research%22%5BJournal%5D)">Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent.</a> BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).</li>
<li>Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+a+native+alga+for+biomass+and+biofuel+accumulation+in+coal+bed+methane+production+water%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water.</a> Algal Research. 19, 63-68 (2016).</li>
<li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+accumulation+mechanisms+of+the+oleaginous+microalga+Chlorella+protothecoides+revealed+through+its+genome%2C+transcriptomes%2C+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes.</a> BMC Genomics. 15, (2014).</li>
<li>Burch, A. R., Franz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+nitrogen+limitation+and+hydrogen+peroxide+treatment+enhances+neutral+lipid+accumulation+in+the+marine+diatom+Phaeodactylum+tricornutum%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).</li>
<li>Brennan, L., Owende, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels+from+microalgae--A+review+of+technologies+for+production%2C+processing%2C+and+extractions+of+biofuels+and+co-products%5BTitle%5D)+AND+%22Renewable+Sustainable+Energy+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products.</a> Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).</li>
<li>Branyikova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+-+Novel+highly+efficient+starch+producers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microalgae - Novel highly efficient starch producers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).</li>
<li>Chalima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Volatile+Fatty+Acids+from+Microalgae+for+the+Production+of+High+Added+Value+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Fermentation%22%5BJournal%5D)">Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds.</a> Fermentation. 3 (4), (2017).</li>
<li>Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+engineering+of+microalgae+to+produce+a+variety+of+consumer+products%5BTitle%5D)+AND+%22Renewable+and+Sustainable+Energy+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+method+for+genetic+transformation+of+the+green+alga+Chlorella+ellipsoidea%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutate+Chlorella+sp.+by+nuclear+irradiation+to+fix+high+concentrations+of+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2.</a> Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).</li>
<li>Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techno-economic+analysis+of+autotrophic+microalgae+for+fuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Energy%22%5BJournal%5D)">Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production.</a> Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).</li>
<li>Sales, C. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Scale+in+a+Photosynthetic+Reactor+System+for+Algal+Remediation+of+Wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55256(2017).</li>
<li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+symbiosis+for+enhanced+algal+growth%2C+biofuel+production%2C+and+wastewater+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment.</a> Algal Research. 17, 308-315 (2016).</li>
<li>Higgins, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal-bacterial+synergy+in+treatment+of+winery+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clean+Water%22%5BJournal%5D)">Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater.</a> Nature Clean Water. 1 (6), (2017).</li>
<li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+thiamine+metabolites+and+spent+medium+from+Chlorella+sorokiniana+on+metabolism+in+the+green+algae+Auxenochlorella+prototheciodes%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes.</a> Algal Research. 33, 197-208 (2018).</li>
<li>Lépinay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+insight+on+interactions+between+bacteria+and+the+marine+diatom+Haslea+ostrearia%3A+Algal+growth+and+metabolomic+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting.</a> Algal Research. 31, 395-405 (2018).</li>
<li>Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+three+microalgae+strains+and+nutrient+removal+from+an+agro-zootechnical+digestate%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate.</a> Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).</li>
<li>Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azospirillum+brasilense+Increases+CO2+Fixation+on+Microalgae+Scenedesmus+obliquus%2C+Chlorella+vulgaris%2C+and+Chlamydomonas+reinhardtii+Cultured+on+High+CO2+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations.</a> Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).</li>
<li>Higgins, B., VanderGheynst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Escherichia+coli+on+mixotrophic+growth+of+Chlorella+minutissima+and+production+of+biofuel+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors.</a> PLoS One. 9 (5), e96807(2014).</li>
<li>Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+assay+for+quantitation+of+neutral+lipids+in+extracts+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae.</a> Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).</li>
<li>Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+elevated+CO2+concentration+on+the+quality+of+algal+starch+as+a+potential+biofuel+feedstock%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informatics+for+improved+algal+taxonomic+classification+and+research%3A+A+case+study+of+UTEX+2341%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341.</a> Algal Research. 12, 545-549 (2015).</li>
<li>Garrett, R. H., Grisham, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarrett%2C+RH+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 5th Edition, Cengage Learning. 578-730 (2012).</li>
<li>de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorella+sorokiniana+UTEX+2805%2C+a+heat+and+intense%2C+sunlight-tolerant+microalga+with+potential+for+removing+ammonium+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater.</a> Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+Q+%22Annual+International+Meeting+of+the+ASABE%22">Annual International Meeting of the ASABE</a>. , American Society of Agricultural and Biological Engineers. Detroit, MI. (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La considerazione più importante quando la coltura di alghe è la comprensione delle esigenze specifiche dell'organismo o del gruppo di organismi. Il sistema di coltivazione qui descritto può essere utilizzato per una vasta gamma di alghe ma gli specifici fattori abiotici (temperatura, media, pH, intensità luminosa, livello di CO2 , tasso di aerazione) della coltura di alghe devono essere adattati alle esigenze dell'organismo. Nota i parametri descritti qui sono stati utilizzati per la coltivazione di clore...

L'applicazione di microalghe in ingegneria e biotecnologia ha attirato grande interesse negli ultimi anni. Microalghe sono allo studio per l'utilizzo in acque reflue trattamento1,2,3,4, biocarburanti produzione5,6,7,8e la produzione di prodotti nutraceutici e altri prodotti di alto valore9,10. Le alghe sono anche essendo geneticamente modificate al prezzo maggiore nel tentativo di migliorare la propria forma per ingegneria specifiche applicazioni11,12. Di conseguenza, c'è grande interesse nella sperimentazione con organismi industrialmente rilevanti nelle impostazioni controllate. Lo scopo di questo metodo è di comunicare un approccio efficace alla microalghe cultura in un ambiente di laboratorio controllato e per misurare la crescita e il contenuto di lipidi neutri di quello alghe. Migliorando la crescita tariffe e contenuto di lipidi neutri di microalghe sono stati identificati come due principali strozzature verso la commercializzazione dei biocarburanti alghe13.
Una vasta gamma di approcci sono stati utilizzati per le alghe di cultura per scopi sperimentali. In generale, questi approcci possono essere suddivisi tra coltivazione all'aperto su larga scala e su scala ridotta coltivazione indoor. Coltivazione all'aperto in fotobioreattori e stagni aperti è appropriato per la sperimentazione volta a scalare i processi che hanno già dimostrati a scala di laboratorio (ad esempio, per testare scale-up di un nuovo ceppo di alta-lipidico delle alghe)14. Tuttavia, la coltivazione su piccola scala indoor è opportuno durante lo sviluppo di ceppi di alghe nuove o migliorate o effettuando esperimenti volti a comprendere meccanismi biologici. In questi ultimi casi, per prendere in giro i cambiamenti sottili nel comportamento biologico è necessaria un'elevata di controllo sperimentale. A tal fine, colture axeniche sono spesso necessari al fine di ridurre al minimo i fattori biotici complessi connessi con altri organismi (per esempio batteri, altre alghe) che inevitabilmente crescono in grandi impianti all'aperto. Anche quando lo studio di interazioni tra le alghe e altri organismi, abbiamo trovato che uso di condizioni sperimentali altamente controllato è disponibile quando si esaminano scambio molecolare tra organismi15,16,17.
All'interno della categoria di coltivazione su piccola scala coperta di alghe, una gamma di approcci sono stati utilizzati. Forse l'approccio più comune è far crescere alghe in matracci di Erlenmeyer su una tabella di shaker sotto una luce banca18,19. Scambio di ossigeno e CO2 avviene per diffusione passiva attraverso una spina di schiuma nella parte superiore del pallone. Alcuni ricercatori hanno migliorato questo set-up attraverso aerazione attiva delle boccette20. Un altro approccio è quello di coltivare alghe in bottiglie, mixate da ancoretta e aerazione attiva. Nonostante la loro semplicità, abbiamo trovato che l'uso di bottiglie e boccette spesso porta a risultati incoerenti tra repliche biologiche. Presumibilmente questo è dovuto gli effetti di posizione - diverse posizioni ricevono diverse quantità di luce, che riguardano anche le temperature interne del reattore. Rotazione giornaliera dei reattori in nuove posizioni può aiutare ma non risolve il problema perché alcune fasi di crescita delle alghe (per esempio, presto esponenziale) sono più sensibili agli effetti posizionali rispetto ad altri (ad es., fase di log).
Sul lato opposto dello spettro di sofisticazione tecnologica sono completamente controllati commerciale fotobioreattori. Questi sistemi continuamente monitorare e regolare le condizioni nel reattore per ottimizzare la crescita delle alghe. Hanno illuminazione programmabili, controllo della temperatura in tempo reale e controllo del pH. Purtroppo, sono costosi e in genere costano diverse migliaia di dollari al reattore. Più riviste scientifiche e ingegneristiche richiedono la replica biologica dei risultati, rendendo necessario l'acquisto di più bioreattori. Presentiamo qui un sistema di reattore bolla colonna che colma il divario tra la semplice (pallone) e sofisticato (completamente controllato bioreattore) si avvicina per la coltivazione delle alghe su scala di laboratorio. Bolla colonne utilizzare delle bollicine di gas per facilitare lo scambio di gas e mescolare il reattore. Questo approccio fornisce un certo grado di controllo sull'illuminazione e temperatura ma lo fa in un modo che è conveniente. Inoltre, abbiamo trovato questo sistema per produrre risultati altamente coerenti tra replicati biologici, riducendo il numero delle ripetizioni biologici necessari al fine di ottenere risultati statisticamente significativi rispetto all'approccio fiasco o bottiglia. Abbiamo anche utilizzato questo sistema per coltivare con successo miscele di alghe e batteri21. Oltre alla coltivazione delle alghe, descriviamo una procedura per misurare il contenuto di lipidi neutri nelle alghe coltivate. Il metodo di quest'ultimo è stato pubblicato altrove22, ma includiamo la procedura qui per fornire istruzioni dettagliate su come impiegare con successo.

<table><tbody><tr><td>Supplies per l'installazione di fotobioreattori airlift</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L Bottiglie in Pyrex</td><td>Corning</td><td>16157-191</td><td>Per reattori a bottiglia, umidificatori</td></tr> 1<tr><td>/2" fascetta stringitubo</td><td>Home Depot</td><td>UC953A</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>1/4" femmina luer a barb</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson FTLL360-6005</td><td>1/4" ID, PP</td></tr><tr><td>1/4" ID, 3/8" OD autoclavabile tubo in PVC</td><td>Thermo-Nalgene</td><td>63013-244</td><td>50'1</td></tr><tr><td>/4" in O-ring</td><td>Grainger</td><td>1REC5</td><td>#010 O-ring in silicone medio duro, 0.239" I.D., 0.379" O.D.</td></tr><tr><td>1/8" Luer femmina a barb</td><td>Nordson biomedical</td><td>FTLL230-6005</td><td></td></tr><tr><td>1/8" ID, 1/4" OD autoclavabile Tubo in PVC</td><td>Thermo-Nalgene</td><td>63013-608</td><td>250'1</td></tr><tr><td>/8" maschio spinning luer a barb</td><td>Nordson biomedical</td><td>MLRL013-6005</td><td></td></tr><tr><td>1/8" barbiglio multiporta</td><td>Nordson biomedical</td><td>4PLL230-6005</td><td>1/8" barbiglio</td></tr> <tr>multiporta<td>1/8" NPT a barb</td><td>Nordson biomedical</td><td>18230-6005</td><td>1/8" 200 series barb</td></tr><tr><td>1/8" montaggio a pannello luer</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson MLRLB230-6005</td><td>1/8", PP</td></tr><tr><td>10 galloni</td> acquario <td>Walmart</td><td>802262</td><td>Può contenere fino a 8 bioreattori a seconda del layout</td></tr><tr><td>Flussometro da 100-1000 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-13-SSV</td><td>Per reattori a bottiglia</td></tr><tr><td>da 2 piedi banco di luce fluorescente</td><td>Agrobrite</td><td>FLT24 T5</td><td></td></tr><tr><td>200-2500 ccm flussometro</td><td>Dwyer</td><td>RMA-14-SSV</td><td>Per la regolazione dell'aria a monte dell'umidificatore</td></tr><tr><td>250 mL Bottiglie Pyrex</td><td>Corning</td><td>16157-136</td><td>Per la miscelazione di gas dopo umidificatore</td></tr><tr><td>50-500 ccm flussometro</td><td>Dwyer</td><td>RMA-12-SSV</td><td>Per reattori a tubo di ibridazione</td></tr><tr><td>5-50 ccm flussometro</td><td>Dwyer</td><td>RMA-151-SSV</td><td>Per il controllo della portata di CO2</td></tr><tr><td>Filtri aria 0,2 & micro; m</td><td>Whatman/ Fisher</td><td>09-745-1A</td><td>Polyvent, 28 mm, 0,2 &micro; m, PTFE, confezione da 50</td></tr><tr><td>Valvole di ritegno</td><td>VWR</td><td>89094-714</td><td></td></tr><tr><td>Coperchi Corning per bottiglie in pyrex</td><td>VWR</td><td>89000-233</td><td>10 coperchi GL45</td></tr><tr><td>Tappo finale luer femmina</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson FTLLP-6005</td><td>Tubi di ibridazione PP stabili femmina</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>32645-030</td><td>35x300 mm, confezione da 2</td></tr><tr><td>timer luce</td><td>Walmart</td><td>556393626</td><td></td></tr><tr><td>Controdadi</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson LNS-3</td><td>1/4", nylon rosso</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico a basso profilo</td><td>VWR</td><td>10153-690</td><td>Agitatore magnetico a basso profilo</td></tr><tr><td>Tappo terminale luer maschio</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson LP4-6005</td><td>Tappo maschio PP</td></tr><tr><td>Anello di bloccaggio luer rotante</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson FSLLR-6005</td><td></td></tr><tr><td>Barre di agitazione - VWR lunghe</td><td></td><td>58949-040</td><td>38,1 mm, per reattori a bottiglia</td></tr><tr><td>Ancorette - medie</td><td>VWR</td><td>58949-034</td><td>25 mm, per tubi di iridizzazione</td></tr><tr><td>Forniture e reagenti per la coltura di alghe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &; m filtri</td><td>VWR</td><td>28145-491</td><td>13 mm, PTFE, per filtrare i terreni esauriti dal campionamento giornaliero di colture</td></tr><tr><td>Siringhe da 1 mL</td><td>Air-tite</td><td>89215-216</td><td>Per filtrare i terreni esauriti dal campionamento giornaliero di colture</td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Pipette sierologiche sterili (o equivalenti)</td></tr> <tr>da <td>10 mL Greiner</td><td>Bio-One</td><td>82050-482</td><td>Sterili (o equivalenti)</td></tr><tr><td>100 mm piastre</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100x15 mm impilabili piastre di Petri, sterili</td></tr><tr><td>Provette da 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-276</td><td>Sterili (o equivalente), polipropilene</td></tr><tr><td>2 mL Puntali per pipette sierologiche</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-584</td><td>Sterile (o equivalente)</td></tr><tr><td>Provette da 2 mL</td><td>VWR</td><td>87003-298</td><td>Sterile (o equivalente)</td></tr><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-348</td><td>Micropiastra sterile (o equivalente) in polipropilene</td></tr><tr><td>a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89089-578</td><td>Polistirene con coperchio, fondo piatto</td></tr><tr><td>Anse inoccupanti</td><td>VWR</td><td>80094-478</td><td>Sterile (o equivalente)</td></tr><tr><td>Serbatoio e regolatore di anidride carbonica liquida</td><td>Airgas</td><td>CD-50</td><td></td></tr><tr><td>Forniture e reagenti per l'estrazione dei lipidi e il dosaggio dei lipidi neutri</ provette per perline da ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>2 mL</td><td>VWR</td><td>10158-556</td><td>Provetta in polipropilene con coperchio</td></tr><tr><td>Micropiastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-774</td><td>Polipropilene, fondo piatto</td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Walmart</td><td>550646751</td><td>Utilizzare solo candeggina normale, non candeggina detergente</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>BDH</td><td>BDH1109-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>BDH</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>BDH</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>Rosso Nilo</td><td>VWR</td><td>TCN0659-5G</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>BDH</td><td>BDH9286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Olio vegetale</td><td>Walmart</td><td>9276383</td><td>Qualsiasi olio vegetale dovrebbe funzionare purché sia fresco</td></tr><tr><td>Perle di zirconia/silice (0,5 mm di diametro)</td><td>Prodotti Biospec</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XS205DU</td><td>Capace di almeno 4 decimali di precisione</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore di perline</td><td>Omni</td><td>19-040E</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga da banco</td><td>Thermo</td><td>Heraeus Fresco 21 con 24x2</td><td>Incluso rotore in grado di gestire provette da 1,5 e 2 mL</td></tr><tr><td>Riscaldatore a blocco secco</td><td>VWR</td><td>75838-282</td><td>Incluso blocco secco per una micropiastra</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td>2,5L sistema di liofilizzazione</td></tr><tr><td>Grande centrifuga da banco</td><td>Thermo</td><td>Heraeus Megafuge 16R Tissue</td><td>Compresi rotori in grado di gestire flaconi da 400 mL, provette da 50 mL e provette da 15 mL</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2</td><td>In grado di leggere l'assorbanza e la fluorescenza</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

C'è notevole interesse per lo studio delle microalghe per applicazioni di ingegneria come la produzione di biocarburanti, prodotti di alto valore e per il trattamento dei rifiuti. Come la maggior parte nuovi sforzi di ricerca iniziano a scala di laboratorio, c'è la necessità di metodi economici per la coltura di microalghe in maniera riproducibile. Qui, comunichiamo un approccio efficace alla cultura microalghe in fotobioreattori su scala di laboratorio e per misurare la crescita e il contenuto di lipidi neutri di quello alghe. Anche per istruzioni su come impostare il sistema di fotobioreattore. Anche se gli organismi di esempio sono specie di clorella e Auxenochlorella, questo sistema può essere adattato per coltivare una vasta gamma di microalghe, tra cui co-colture di alghe con specie non-alghe. Colture di riserva prima sono coltivate in bottiglie per la produzione di inoculo per il sistema di fotobioreattore. Inoculo di alghe è concentrato e trasferito in fotobioreattori per la coltivazione in modalità batch. I campioni sono raccolti ogni giorno per le letture di densità ottica. Alla fine della cultura batch, le cellule vengono raccolte da centrifuga, lavata e liofilizzati per ottenere una concentrazione finale di peso a secco. La concentrazione finale di peso a secco viene utilizzata per creare una correlazione tra la densità ottica e la concentrazione di peso a secco. Un metodo modificato di Folch viene successivamente utilizzato per estrarre i lipidi totali dalla biomassa liofilizzata e l'estratto viene analizzato per il suo contenuto di lipidi neutri usando un'analisi di micropiastre. Questo saggio è stato pubblicato in precedenza ma passaggi protocollo sono stati inclusi qui per evidenziare i passaggi critici della procedura cui frequentemente si verificano errori. Il sistema di bioreattore descritto qui riempie una nicchia tra coltivazione semplice boccetta e bioreattori commerciale completamente controllato. Replica anche con solo 3-4 biologico per il trattamento, il nostro approccio alla coltura di alghe porta a strette deviazioni standard nelle analisi del lipido e di crescita.

Questa procedura produce un corso di tempo dei dati di densità ottica algali a OD 550 nm (Figura 4A). La densità ottica e il peso a secco la concentrazione di dati possono essere correlata (Figura 4B). Questa operazione viene eseguita dal primo calcolo della concentrazione di alghe di peso secco finale dopo il passaggio di liofilizzazione. Successivamente, la densità ottica della diluizione seriale di cultura (eseguita l'ultimo g...

Qui, presentiamo un protocollo per costruire su scala di laboratorio bolla colonna fotobioreattori e li usa per cultura microalghe. Esso fornisce inoltre un metodo per la determinazione del tasso di crescita della cultura e del contenuto di lipidi neutri.

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Questo protocollo fornisce istruzioni per la costruzione e l'uso di un sistema di fotobioreattori a colonna di bolle per coltivare microalghe e dovrebbe essere di interesse per chiunque studi i biocarburanti algel, il trattamento delle acque reflue o la biologia dell'algel. Abbiamo scoperto che il sistema del reattore a guglia produce risultati altamente affidabili. Il sistema del reattore è anche personalizzabile in un ampio gruppo di alghe e costa molto meno di molte offerte commerciali.A dimostrare la procedura sarà Qichen Wang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare la configurazione dei fotobioreattori Bubble Column, costruire una serie di coperchi ventilati dai coperchi di plastica delle bottiglie di vetro da un litro e tubi di ibridazione come descritto nel protocollo di testo. Infilare un anello O da 1/4 di pollice sui battistrada di un raccordo di esca da 1/8 di montaggio del pannello e far scorrere questo nel foro da 1/4 di pollice praticato nel coperchio.Infilare un secondo 1/4 di pollice sui fili in modo che il coperchio sia inserito tra i due anelli O. Quindi infilare un dado di blocco sui fili e stringerlo per fissare l'esca di montaggio del pannello in posizione. Ora aggancia per bloccare gli anelli sull'esca maschile esposta, sporgendo dal coperchio.Ripetere questa procedura per ogni foro nel coperchio. Per i coperchi che verranno utilizzati sui reattori Bubble Column e bottle, collegare l'esca femminile da 1/8 di pollice ai raccordi barb a pezzi da 1/2 pollice di tubi in PVC ID da 1/8 di pollice. Attaccare questi a ciascuno dei raccordi di esca maschile esposti sul coperchio.Collegare una valvola di ritegno all'estremità libera di uno dei pezzi da 1/8 di pollice. Quindi collegare un'esca maschile al raccordo barb al secondo pezzo di tubi da 1/8 di pollice sporgenti dal coperchio. Fare clic sull'anello di blocco rotante in posizione e fissare un filtro dell'aria da 0,2 micron a questo.Compleat assembly del sistema di consegna dell'aria, serbatoi di pesce, piastre di agitazione e luci come descriva il protocollo di testo. Concentrare il materiale di microalghe stabilizzato rimuovendo il supernatente utilizzando una pompa per vuoto. Lasciare meno di 100 millilitri di mezzo in ogni bottiglia, ma evitare di rimuovere le alghe sistemate.Sospendere e trasferire i liquami di alghe in tubi sterili di centrifuga da 50 millilitri. Centrifuga 1.000 volte G per cinque minuti per concentrare ulteriormente le alghe. Nell'armadio della biosicurezza, rimuovere abbastanza supernatente da ottenere un volume totale di circa 80 millilitri di concentrati di alghe per 12 fotobioreattori.Evitare di aspirare il pellet. Trasferire il concentrato di alghe in un contenitore di steril. Ora, aggiungi sei millilitri di liquami di alghe in ogni fotobioreattore con una pipetta sierologica steril da 10 millilitri.Ruotare i bioreattori per mescolare le alghe nel mezzo. Esegnare un campione di due millilitri da ogni bioreattore utilizzando una pipetta sierologica e trasferirlo in un tubo da due millilitri. Raccogli un campione di due millilitri ogni 24 ore per monitorare i progressi della cultura.Controllare il campione per il ph utilizzando strisce di prova e regolare il reattore in base alle esigenze. Stringere i coperchi del bioreattore e posizionare tutti i bioreattori nel bagno d'acqua del serbatoio del pesce. Regolare l'aerazione, l'anidride carbonica e l'illuminazione ai livelli appropriati per la specie.Ruotare la posizione del bioreattore ogni giorno dopo il campionamento. Applicare 200 microlitri di ogni campione di coltura in triplice copia su pozzi di una micropiatta da 96 pozzi. Quindi misurare la densità ottica a 550 nanometri e 680 nanometri.Misurare un volume fisso di coltura di alghe da ogni bioreattore con un cilindro laureato e trasferire in bottiglie di centrifuga. Centrifuga la cultura 4.696 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante aspirandolo con cura.Trasferire i pellet in tubi etichettati da 50 millilitri. Risciacquare le bottiglie di centrifuga con acqua distillata e trasferire il contenuto nei tubi da 50 millilitri. Assicurarsi che il volume totale non superi i 45 millilitri.Dopo aver lavato i pellet di alghe come descritto nel protocollo di testo, scartare il supernatente. Quindi, aggiungere 7,5 millilitri di acqua distillata a ogni tubo da 50 millilitri. Ora, vortice i tubi da 50 millilitri e trasferire i fanghi di alghe in tubi pre pesati da 15 millilitri.Risciacquare i tubi da 50 millilitri con acqua distillata aggiuntiva e trasferire il liquido nei tubi da 15 millilitri mantenendo il volume totale in tali tubi a meno di 12 millilitri. Dopo aver centrifugato i tubi da 15 millilitri e aver scartato il supernatente come prima, congelare i tubi con pellet a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti in preparazione alla liofilizzazione. Aggiungere 1,5 millilitri di solvente di folch a ciascun tubo di due millilitri contenente 20 milligrammi di alghe liofilizzato.Versare circa 0,5 millilitri di perline di silice di zirconia in ogni tubo fino a quando il livello del liquido raggiunge due millilitri. Omogeneizzare i campioni di alghe in un mulino perline per 20 secondi ad una velocità di 6,5 metri al secondo. Trasferire i tubi sui ghiacci per 30 secondi per raffreddare i campioni.Quindi, ripetere altre cinque volte per estrarre completamente i lipidi. Filtrare l'omogeneato attraverso una siringa da cinque millilitri contenente un disco in rete metallica in acciaio inossidabile per filtrare le perline, raccogliendo il filtrato in un tubo da 15 millilitri. Lavare le perline con 1,5 millilitri di solvente folch, spingendo il liquido attraverso con il siringo se necessario.Ripetere questo lavaggio altre 2 volte e raccogliere tutto il filtrato nel tubo da 15 millilitri, producendo un volume finale di circa sei millilitri. Aggiungere 1,2 millilitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% all'estratto di folch nel tubo da 15 millilitri e al vortice per mescolare bene. Centrifugare i tubi da 15 millilitri a 6.000 volte G per cinque minuti.Registrare il volume inferiore della fase cloroformio allo 0,1 millilitro più vicino utilizzando linee sul lato del tubo da 15 millilitri. Quindi trasferire la fase inferiore in una vile di vetro utilizzando una pipetta da pascolo in vetro. Per eseguire il saggio lipidico neutro, diluire gli estratti lipidici e l'olio vegetale standard tre volte con metanolo.Per ogni diluito, il campione aggiunge 80 microlitri a una micropiatta di polipropilene a 96 polietilene in quadruplicato. Per il bianco solvente, applicare 80 microlitri di solvente folch in quadruplicata. Per gli standard, aggiungere 10, 30, 60, 90 e 120 microlitri dello standard di olio vegetale diluito anche in quadruplicato.Posizionare la micropiatta nella cappa dei fumi su un riscaldatore a blocchi secchi preriscaldato a 55 gradi Celsius per 20-30 minuti fino a quando tutto il solvente non è evaporato. Rimuovere la micropiatta dal blocco riscaldante e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 30 microlitri di alcol isopropile ad ogni pozzo e mescolare pipettando su e giù.Assicurarsi che tutti i canali di pipetta mescolano la soluzione e rimorsino i lipidi, producendo un liquido verde omogeneo. Ora, aggiungere 200 microlitri di un microgrammo per millilitro a una soluzione rosso nilo ad ogni pozzo e condirlo su e giù 10 volte per mescolare. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, aggiungere 20 microlitri di soluzione di candeggina al 50% a ciascun pozzo e tubazione su e giù cinque volte per mescolare bene.Lasciare la piastra per incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, leggere la florescenza nei campioni ogni cinque-10 minuti a 530 nanometri di eccitazione, emissione di 575 nanometri, con tagli automatici impostati a 570 nanometri fino a quando il segnale proveniente dai campioni di alghe non si stabilizza. Questa procedura produce un corso di tempo dei dati di densità ottica algel a 550 nanometri OD.Le colture di controllo sono state coltivate su un mezzo NH4 fresco. Trattamento uno, è co-colture auxenocloroella prototecoidi e azospirillum brasiliense coltivati su mezzo NH4 fresco innato. Trattamento due, è un A.Protothecoides azinico coltivato su mezzo NH4 innato integrato con 50 milligrammi per millilitro AIA, che ha completamente inibito la crescita delle alghe.Trattamento tre, è azinico A.Protothecoides, coltivato su mezzo speso da A.Brasilienes. Le curve di crescita mostrano che le colture di auxenoclorella prototecoidi entrano nella crescita logaritmica tardiva a 120 ore. Qui sono mostrate le curve di corelazione tra la densità ottica a 550 nanometri e la concentrazione finale di peso secco, utilizzando una vestibilità polinomiale di secondo ordine.Infine, la colorazione può essere applicata ai dati di densità ottica del corso del tempo per ottenere una curva di crescita del peso secco. Qui vengono utilizzati gli stessi trattamenti, tranne per il fatto che la clorella sorokiniana viene coltivata al posto dei prototecoidi dell'auxenocloroella. La percentuale di lipidi neutri a peso secco ottenuti nel saggio lipidico neutro è correlata bene con il contenuto di glicerolo triosio su una corrispondente lastra di cromatografia a strato sottile.A differenza degli A.Protothecoides, il trattamento IAA non inibisce la crescita della C.Sorkiniana. Dopo l'estrazione lipidica delle alghe, il pallet cellulare rimanente può essere analizzato per il suo contenuto di amido e parete cellulare, fornendo un quadro più dettagliato dei prodotti di accumulo di energia all'interno della cellula. I metodi qui descritti hanno permesso nuove scoperte nel campo dei biocarburanti algel e del trattamento delle acque reflue.In particolare, questo sistema è stato utilizzato per capire meglio come i batteri influenzano la crescita dell'algel.

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