Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Questo protocollo descrive come indurre la malattia xenograft-versus-host, o xenoGVHD, e come accecare e standardizzare il punteggio clinico per garantire risultati coerenti. Il modello xenoGVHD fornisce un metodo in vivo per testare le terapie immunosoppressive contro le cellule T umane piuttosto che murine, migliorando la traduzione di questi studi in clinica. A dimostrare la procedura sarà Amara Seng, una studentessa laureata del mio laboratorio.

Un giorno prima dell'iniezione, posizionare topi di scid gamma diabetica da otto a 12 settimane, non obesi, o NSG, in una gabbia di torta sterilizzata e irradiare i topi in una fonte di cesio-137 con una dose totale di 150 centigray, con una rotazione lenta per garantire un'irradiazione uniforme. Quindi, metti i topi in gabbie pulite in un armadietto sterile per la biosicurezza durante la notte. La mattina seguente, raccogliere abbastanza sangue umano sano da isolare 1,1 per 10 alle sette cellule mononucleari del sangue periferico, o PBBC, per topo, e diluire il sangue eparinato in un volume uguale del 2% di siero bovino fetale, o FBS, in PBS.

Sovrapporre con cura fino a 25 millilitri del sangue diluito su 15 millilitri di mezzo gradiente di densità di separazione dei linfociti in un tubo conico da 50 millilitri per la centrifugazione del gradiente di densità. Al termine della separazione, raccogliere il PBMC all'interfaccia e lavare le celle in 10 millilitri di PBS in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aspirare il supernatante e far scorrere il tubo per allentare il pellet.

Resuspend i PBBC in 10 millilitri di PBS fresco per un'altra centrifugazione, seguita da resuspensione in cinque millilitri di PBS fresco per il conteggio. Quindi, raccogliere le cellule con una centrifugazione finale e rimorsi il pellet a uno per 10 agli otto PBBC per millilitro di concentrazione di PBS. Per la consegna retro-orbitale del PBMC umano isolato nell'occhio del mouse, caricare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 28 con 100 microlitri di cellule.

Confermare la mancanza di risposta all'avvicinamento delle dita dei dita dei dita dei dati e trattenere delicatamente il mouse con il pollice e il dito medio. Inserire il lato smussato dell'ago verso il basso, laterale nel canthus mediale, attraverso la membrana congiuntivale fino a raggiungere la parte posteriore dell'occhio. Ritrarre leggermente l'ago e iniettare lentamente l'intero volume delle cellule.

Quindi, ritrarre completamente l'ago per un corretto smaltimento della siringa e dell'ago. Chiudere la palpebra e applicare una leggera pressione sul sito di iniezione con una spugna di garza. Quindi, esaminare il sito di iniezione per il gonfiore o altri traumi visibili e consentire al mouse di riprendere conoscenza in una gabbia sterile fiancheggiata da asciugamani di carta e monitoraggio prima di spostare l'animale nella sua gabbia di casa.

Per misurare il punteggio GVHD, posizionare la gabbia in una cappa di flusso laminare e rimuovere il cibo e l'acqua dalla gabbia. Per segnare l'attività, osservare il comportamento dei topi per cinque minuti. Per ottenere un punteggio di perdita di peso, pesare ogni mouse in un bicchiere.

Mentre il topo è ancora nel becher, ispezionare l'animale per la postura, la consistenza della pelliccia e l'integrità della pelle. Dopo aver raccolto i tessuti di interesse, tagliare un pezzo di tessuto di circa tre per 0,5 millimetri dall'organo e pesare il campione su un equilibrio. Trasferire il tessuto ponderato in un tubo sterile da 1,5 millilitri e congelare il campione in azoto liquido per lo stoccaggio notturno a meno 80 gradi Celsius.

La mattina dopo, scongelare i campioni prima dellalisi, secondo le istruzioni di un kit di isolamento genomico del DNA. Per la quantificazione delle cellule T umane mediante reazione a catena della polimerasi digitale, o PCR, preparare reazioni PCR digitali secondo il protocollo per i coloranti leganti il DNA per la macchina PCR digitale utilizzata e utilizzando i primer appropriati per il DNA genomico epsilon CD3 umano. Quindi, eseguire la reazione PCR digitale nelle condizioni di reazione appropriate.

Topi NSG di entrambi i sessi irradiati sublethally da otto a 12 settimane che ricevono PBMC umano iniziano a mostrare segni clinici di GVHD intorno al giorno 10 dopo l'iniezione rispetto ai topi di controllo negativi trattati solo con PBS. I topi XenoGVHD hanno una sopravvivenza mediana di 23,5 giorni. Utilizzando pcr digitale, le cellule T umane positive all'epsilon CD3 possono essere rilevate nei campioni polmonari e epatici di topi che ricevono PBPC umani.

È fondamentale che il punteggio sia eseguito in modo coerente e che il ricercatore che segna i topi sia accecato al loro trattamento. Seguendo questa procedura, il siero può essere raccolto da topi eutanasiati per l'analisi dell'espressione citochina periferica e le cellule immunitarie possono essere raccolte dalla milza per l'analisi tramite citometria del flusso.