Name: Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Impara l'ibridazione in situ wholemount per visualizzare l'espressione genica negli embrioni di Astyanax mexicanus con minimo fondo. Questo metodo semplificato facilita la riproduzione e l'analisi in biologia dello sviluppo.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio lordo per utili commenti su questo manoscritto. Vogliamo riconoscere quattro studenti delle scuole superiori che hanno utilizzato questo protocollo durante stage estivi nel 2017 e 2018, tra cui Christine Cao, Michael Warden, Aki Li e David Nwankwo. HL è stato sostenuto da una borsa di studio UC biologia staminali durante l'estate del 2017. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della National Science Foundation (DEB-1457630 a JBG) e il National Institutes of Dental e Craniofacial Research (NIH; DE025033 a JBG).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Cincinnati (protocollo n. 10-01-21-01).
1. fissazione
<ol><li>Isolare il numero desiderato di Astyanax mexicanus embrioni da un serbatoio di allevamento e difficoltà ~ 50 embrioni alla volta. Se gli embrioni sono grandi e vecchi, può essere necessario fissare 25 alla volta per garantire anche fissazione.</li>
	<li>A seconda dell'età dell'embrione, utilizzare il metodo IACUC-approvato dell'anestesia. Per vecchi embrioni con un sistema nervoso funzionante, sacrificare embrioni tramite overdose di anestetico. Di conseguenza, posizionare gli embrioni in una soluzione di ~ 1% tricaina (tamponato a pH 7.4) per ridurre al minimo il dolore e il disagio per l'organismo.</li>
	<li>Una volta che gli embrioni sono insensibili al tatto, sistema acqua contenente tricaina di sostituire e aggiungere ~ 1 mL di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4): 1x.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di PBS e aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA). Difficoltà embrioni durante la notte a 4 ° C. Attenzione: PFA è pericoloso (vale a dire, è infiammabile ed è una pelle e polmone irritante), maneggiare con cura.</li>
</ol>2. disidratazione
<ol><li>Per disidratare gli embrioni, rimuovere la soluzione fissante e sciacquare con 1 mL di PBS. Posizionare fiale contenenti embrioni ad un angolo (tra 30° e 45°), su un agitatore di piattaforma durante il risciacquo. Continuare a lavare gli embrioni due volte, 5 min a lavaggio.</li>
	<li>Se gli embrioni hanno ancora un corion, collocare 50 tutti gli embrioni in un 100 mm x 25 mm piastra di Petri e attentamente isolarli da chorions utilizzando due set di Pinzette da orologiaio (ad es., #5 forcipe) sotto un microscopio. Nota: Durante la procedura descritta qui sotto e per il resto del protocollo, con attenzione rimuovere tutto il liquido dal passaggio precedente utilizzando pulito, vetro Pasteur pipette prima di aggiungere la soluzione successiva</li>
	<li>Disidratare gli embrioni in una serie di lavaggi sempre più concentrate di metanolo (MeOH) descritto di seguito. Le diluizioni sono basate su un volume totale di 1 mL con 500 µ l di soluzione andando in ogni flaconcino di vetro da 4 mL. Eseguire tutti i passaggi di disidratazione a temperatura ambiente (TA) su shaker a piattaforma.<ol>
<li>Rimuovere con attenzione la soluzione PBS. Aggiungere una soluzione al 25% MeOH (250 µ l di MeOH) + 750 µ l di PBS. Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione di MeOH 25%. Aggiungere una soluzione di 50% MeOH (500 µ l di MeOH) + 500 µ l di PBS. Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione di MeOH 50%. Aggiungere una soluzione di MeOH 75% (750 µ l di MeOH) + 250 µ l di PBS. Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 minuti.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione di MeOH 75%. Aggiungere una soluzione di MeOH 100% (1 mL di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min, ripetere questo passo 3 volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A questo punto, conservare gli embrioni disidratati, come necessario, in loro fiale di vetro a-20 ° C (lungo termine). In alternativa, procedere direttamente al giorno 1 del protocollo.</li>
</ol>3. giorno 1: reidratazione
<ol><li>Ottenere embrioni disidratati dal congelatore a-20 ° C (o procedere direttamente dal punto 2.5).</li>
	<li>Ordinare gli embrioni utilizzando una pipetta Pasteur. Uno può ordinare basata su morfotipo (cioè, grotta e/o superficie), e il numero di geni valutati in ogni esperimento. Non ci sono solitamente non più di 12 embrioni per flaconcino una volta ordinato. Per mantenere l'organizzazione, è possibile utilizzare nastro colorato laboratorio per designare i flaconcini e le pipette per ciascun gene. Gli embrioni rimarranno nel flacone stesso in tutto l'intero protocollo. Nota: Posto la punta della pipetta Pasteur in 100% EtOH per sterilizzarlo tra utilizza.</li>
	<li>Impostare un bagnomaria con agitazione a 70 ° C deve essere utilizzato in un passaggio successivo. Attentamente, tirare fuori il MeOH in fiale di embrioni ordinati e sostituire con 500 µ l di nuovo 100% MeOH. Lavare brevemente (~ 1 min) su shaker a piattaforma.</li>
	<li>Reidratare embrioni in una crescente concentrazione di 1X PBS con Tween 20 (PBT, vedi sotto) su shaker a piattaforma. Le diluizioni sono basate su un volume di diluizione finale di 1 mL con 500 µ l in ogni flaconcino.<ol>
<li>Aggiungere una soluzione al 25% PBT (250 µ l di PBT, 750 µ l di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione PBT 25%. Aggiungere una soluzione al 50% PBT (500 µ l di PBT, 500 µ l di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione di 50% PBT. Aggiungere una soluzione di 75% PBT (750 µ l di PBT, 250 µ l di MeOH). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione PBT di 75%. Aggiungere una soluzione al 100% PBT (1 mL di PBT). Agitare delicatamente su un agitatore di piattaforma per 5 min, ripetere questo passo 3 volte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. giorno 1: Digestione e fissazione
<ol><li>Preparare una soluzione di K (PK) proteinasi aggiungendo 1 µ l di PK (20 mg/mL) a 2 mL di PBT.</li>
	<li>In previsione di passaggi successivi, è possibile ottenere le aliquote congelate di buffer di ibridazione (IBRID - e Ibrid +; vedere Supplemental File 2 e 3 File supplementare) e PFA da stoccaggio-20 ° C.<ol>
<li>Consentire PFA scongelare a TA.</li>
		<li>Porre le aliquote di ibrid - e Ibrid + in un bagno di acqua 70 ° C rotante. Posizionare tutti i reagenti e fiale all'interno di un piccolo "guarnizione" con un fondo di rete, all'interno l'apparecchio del bagno d'acqua galleggianti. In questo modo semplice aggiunta e rimozione di tubi e flaconi dal bagno di acqua rotante di 70 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere delicatamente la soluzione PK per il o i flaconcini di embrioni garantendo tutti i tessuti sono completamente ricoperti di soluzione. Digerire gli embrioni per ~ 12 min in soluzione di lavoro di PK nell'agitatore di piattaforma. Nota: La lunghezza di digestione può essere variata dallo sperimentatore per garantire risultati ottimali.</li>
	<li>Sfilare delicatamente la soluzione PK e brevemente inondare il flaconcino con PBT per diluire qualsiasi restante PK.</li>
	<li>Erogare la soluzione PBT e sostituire con 500 µ l di nuovo PBT. Lasciare la soluzione di sciacquare l'agitatore di piattaforma per 5 min.</li>
	<li>Disegnare i PBT e sostituire con 500 µ l di scongelati 4% PFA. Consentire gli embrioni a incubare per 20 minuti sull'agitatore piattaforma a TA.</li>
	<li>Prelevare il 4% PFA e brevemente inondare il flaconcino con PBT per diluire qualsiasi PFA rimanente. Sfilare il PBT e sostituire con 500 µ l di PBT fresco. Consentire gli embrioni sciacquare per 5 minuti sull'agitatore piattaforma. Ripetere questo passaggio 4 volte di più.</li>
</ol>5. giorno 1: Prehybridization
<ol><li>Posto 500 µ l di pre-riscaldato IBRID-soluzione nel flaconcino. Con attenzione è possibile posizionare la cuvetta nei 70 ° C acqua bagno (all'interno di guarnizioni) senza agitazione, per 5 min.</li>
	<li>Erogare la soluzione di ibridazione e inondare il flaconcino con 500 µ l di soluzione Hyb + pre-riscaldato. Posizionare la cuvetta indietro nel bagno di acqua 70 ° C con agitazione (40 giri). Incubare per entrambi 4 h, o durante la notte. Nota: Un'incubazione di 4 h produrrà un protocollo completo in situ che durerà per 4 giorni in totale. Qui, questo passo si presenta come un'incubazione overnight, che produrrà un protocollo di durata di 5 giorni in totale.</li>
</ol>6. giorno 2: ibridazione
<ol><li>Introdurre un'aliquota di ibrid + dal congelatore a-20 ° C in agitazione bagno acqua calda per 5 min.</li>
	<li>Sfilare il Hyb + dal flaconcino e sostituire con 500 µ l di pre-riscaldato Hyb +. A questa soluzione, aggiungere con cautela 2 µ l di sonda RNA per ogni flaconcino. Agitare delicatamente il flaconcino per garantire una distribuzione omogenea della sonda.</li>
	<li>Incubare la soluzione Hyb + (con sonda aggiunto) nel bagno d'acqua calda di 70 ° C per una notte mentre si stringono a 40 giri/min. Nota: Si può riutilizzare soluzione Hyb + (con sonda). Per questo, prendere Hyb + con sonda dalla prima esecuzione dal congelatore a-20 ° C e posto in una vasca di acqua calda per 5 min, Sostituisci Hyb + dal giorno 1 protocollo con Hyb + con sonda e consentire l'incubazione durante la notte in bagno di acqua calda.</li>
</ol>7. giorno 3: Preparazione soluzione
<ol><li>Preparare le provette microcentrifuga etichettate Hyb + con la sonda RNA "gene di interesse". Preparare la serie di diluizioni che verranno utilizzati durante il giorno 3.<ol>
<li>Utilizzando 6 tubi separati, preparare la seguente serie di diluizioni di ibrid - e salino sodio citrato (SSC, 0-100%) in un volume di 1 mL e posto nei 70 ° C in agitazione acqua vasca: tubo 1 = 100% IBRID-(1 mL di ibrid-): tubo 2 = 25% 2 x SSC (250 µ l di 2 x SSC, 750 µ l di ibrid-); Tubo 3 = 50% 2 x SSC (500 µ l di 2X SSC, 500 µ l di ibrid-); Tubo 4 = 75% 2 x SSC (750 µ l di 2X SSC, 250 µ l di ibrid-); Tubo 5 = 100% 2 x SSC (1 mL di 2 x SSC); Tubo 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL di 0,2 x SSC). Nota: Essere vigili della concentrazione di SSC, che cambia da 2x a 0.2 x.</li>
		<li>Utilizzando 4 separare tubi, preparare la seguente serie di diluizioni di PBT e SSC in un volume di 1 mL e inserire a RT: tubo 1 = 25% PBT (250 µ l di PBT, 750 µ l di 0.2 x SSC); Tubo 2 = 50% PBT (500 µ l di PBT, 500 µ l di 0,2 x SSC); Tubo 3 = 75% PBT (750 µ l di PBT, 250 µ l di 0,2 x SSC); Tubo 4 = 100% PBT (1mL di PBT).</li>
		<li>Preparare una provetta da 2 mL di tampone acido maleico, contenente la soluzione di lavoro di Tween 20 (MABT).</li>
		<li>Preparare due provette coniche da 15 mL di soluzione di blocco. In ogni provetta, aggiungere 0,2 g di reagente bloccante a 10 mL di MABT (vedere Supplemental File 4). Posizionare entrambi i tubi un mixer nutante (o shaker a piattaforma) fino al completamente dissolto nella soluzione (fino a 3 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. giorno 3: Rimozione della sonda
<ol><li>Erogare la soluzione Hyb + (con sonda) con un pipetta Pasteur di vetro e posizionarlo in una sterile, etichettato microcentrifuga. Conservare questo tubo nel congelatore di-20 ° C per un uso futuro (se la sonda-etichettatura è successo).</li>
	<li>Con attenzione aggiungere 500 µ l di calde SSC/IBRID-diluizioni (indicato sotto). Incubare in ciascuna delle seguenti soluzioni per 10 minuti ciascuno, a bagnomaria con agitazione i 70 ° C.<ol>
<li>Incubare in sequenza con 100% IBRID-(1 mL di ibrid-), 25% 2 x SSC (250 µ l di 2 x SSC, 750 µ l di ibrid-), 50% 2 x SSC (500 µ l di 2 x SSC, 500 µ l di ibrid-), 75% 2 x SSC (750 µ l di 2 x SSC, 250 µ l di ibrid-), 100% 2 x SSC (1 mL di 2 x SSC) , 100% 0,2 x SSC (2 mL di 0.2 x SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'ultimo passo, Incubare in ciascuna delle seguenti soluzioni per 10 minuti ciascuno. Tutte le incubazioni seguente si terrà al RT il shaker a piattaforma: 25% PBT (250 µ l di PBT, 750 µ l di 0.2 x SSC), 50% PBT (500 µ l di PBT, 500 µ l di 0.2 x SSC), 75% PBT (750 µ l di PBT, 250 µ l di 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 mL di PBT).</li>
	<li>Dopo un'incubazione di 10 min, rimuovere il 100% PBT e aggiungere 500 µ l di MABT in ogni flaconcino. Ripetere questo passaggio due volte per 5 min.</li>
</ol>9. giorno 3: blocco
<ol><li>Rimuovere MABT da ogni flaconcino e flood con soluzione premiscelata bloccante da uno dei tubi (preparati al punto 7.1.4). Flaconcino posto su un mixer nutante per ~ 4 h a TA.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di Anti-DIG-AP Fab frammenti nel secondo flaconcino da 10 mL di soluzione (preparata al punto 7.1.4) e brevemente vortice di blocco.</li>
	<li>Riempire quasi completamente ogni flaconcino con soluzione (~ 5 mL) di blocco e nutante mixer durante la notte in frigorifero a 4 ° C.</li>
</ol>10. giorno 4: MABT risciacqui
<ol><li>Preparare un flaconcino stock di 10% siero di capra normale (NGS) nel MABT (aggiungere 100 µ l di NGS a 900 µ l di MABT).</li>
	<li>Erogare la soluzione bloccante in ogni fiala e aggiungere 500 µ l di miscela NGS/MABT in ogni flaconcino. Consentire gli embrioni a incubare per 25 min a RT sull'agitatore piattaforma.</li>
	<li>Sostituire la miscela NGS/MABT con 500 µ l di 100% MABT. Incubare per 30 min a RT sull'agitatore piattaforma. Eseguire questo risciacquo 11 più volte durante il giorno ogni 30 min.</li>
	<li>Riempire il flacone con 100% MABT e posto su un mixer nutante durante la notte in una camera frigorifero o cabina a 4 ° C.</li>
</ol>11. giorno 5: Visualizzazione della sonda
<ol><li>Preparare un'aliquota di 50 mL di tampone di fosfatasi alcalina (AP) (vedere Supplemental File 5). Combinare le operazioni seguenti in una provetta conica 50 mL avvolta nella carta stagnola per limitare l'esposizione alla luce: 5 mL di 1 M Tris (pH 9.5), 5 mL di 50 mM MgCl2, 5ml di 1% Tween 20, 5 mL di NaCl di 1m, 30 mL di ddH2O.</li>
	<li>Rimuovere MABT e sostituire con 1 mL di tampone di AP (tubo avvolto in carta stagnola). Lasciarlo a lavare per 5 min. Farlo due volte a garantire la rimozione completa di MABT.</li>
	<li>Buffer di AP di rimuovere e sostituire con 1 mL di tampone di AP con 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) e 4,5 μL di nitro blu di tetrazolio (NBT). Sostituire con preparati AP buffer/NBT/BCIP una volta ogni ora fino a quando la reazione è completa. Monitorare attentamente, controllando ogni 15 minuti, per permettere la reazione di colorazione che si terrà fino a quando è stato raggiunto il livello desiderato di macchiatura. Se precipitato comincia a formarsi, sostituire la soluzione al più presto.</li>
	<li>Fermare la reazione di colorazione risciacquando gli embrioni nel buffer di AP 100% fresco (senza NBT/BCIP) per 5 min continua risciacqui in PBT fino al raggiungimento dei livelli ottimali del segnale (con quantità minime di colorazione di fondo). Continuare a sciacquare gli esemplari con l'aumento di diluizioni di PBT in AP Buffer come segue: 25% PBT (250 μL di PBT, 750 μL di tampone di AP), risciacquo per 5 min; 50% PBT (500 μL di PBT, 500 μL di tampone di AP), risciacquo per 5 min; 75% PBT (750 μL di PBT, 250 μL di tampone di AP), sciacquare per 5 min.</li>
	<li>Sciacquare gli embrioni in ~ 5 mL del 100% PBT nutante mixer fino a quando lo si desidera una colorazione di fondo minimo viene raggiunto. Interruttore fuori con PBT fresco più volte. Questo potrebbe richiedere fino a diversi giorni.</li>
	<li>Quando risciacquo è completi, lavare gli embrioni in 500 μL di PBS sterile su un agitatore di piattaforma. Eseguire questo risciacquo due volte per 5 min. Dopo lava PBS, post-fissare i campioni in 500 μL di 4% PFA per 1h a RT su un agitatore di piattaforma. In alternativa, difficoltà durante la notte in 1 mL di 4% PFA in frigorifero a 4 ° C.</li>
	<li>Sostituire il fissativo con fresco, PBS sterile. Eseguire questo risciacquo almeno due volte per 5 min posto gli embrioni in ~ 4 mL di PBS sterile al 100% e archiviare a lungo termine a 4 ° C.</li>
</ol>12. imaging
<ol><li>Compongono una piastra di imaging in una capsula Petri usando agarosio al 3% e tampone TAE. Nota: Quantità dipendono da quanti piatti sono necessari. Piastre possono essere riutilizzati più volte. È consigliabile che uno stampo rettangolare poco profondo è disposto in di Petri mentre il gel è di raffreddamento al fine di creare una depressione per contenenti gli embrioni sulla piastra.</li>
	<li>Posizionare gli embrioni sulla piastra in PBS. Nota: Si consiglia di versare delicatamente gli embrioni nella piastra invece di pipettaggio fuori perché è stato trovato che che si attacchi all'interno delle pipette di plastica.</li>
	<li>Utilizzare la microscopia chiara al fine di visualizzare ciascun embrione. Utilizzare una sonda smussata per manovrare gli embrioni nella posizione desiderata.</li>
	<li>Prendere un'immagine quando l'embrione è nella posizione desiderata. Si noti che è importante acquisire le immagini degli embrioni all'interno di un paio di settimane di macchiatura completato per evitare una potenziale riduzione della macchia.</li>
</ol>

<ol><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%3A+Application+to+neurobiology%22">In situ hybridization: Application to neurobiology</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1987).</li>
<li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cranial+patterning+in+the+direct%E2%80%90developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li>
<li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li>
<li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).</li>
<li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1-chemokine%2C+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2C+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li>
<li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+%28Adcyap1%29+and+its+receptor+subtypes+%28Adcyap1r1%2C+Adcyap1r2%2C+and+Adcyap1r3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li>
<li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li>
<li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).</li>
<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

A causa della vulnerabilità di RNA alla degradazione, una delle fasi più critiche nel protocollo riguarda la sintesi sterile della sonda RNA. Tuttavia, se una sonda è generata con attenzione e fornisce buoni risultati, può essere riutilizzato nelle successive reazioni di colorazione. Un secondo punto cruciale è la produzione accurata di tutti i reattivi utilizzati in tutto il protocollo. Poiché questo protocollo coinvolge diversi giorni e molti piccoli passi, è essenziale che tutti i reagenti sono accuratamente prodotte ...

L'ibridazione in situ è un metodo comune per la colorazione di tessuti fissi per visualizzare gene expression pattern1. Questa tecnica è stata eseguita per anni in altri tradizionali2 e sistemi di modello non tradizionali3 , per una varietà di studi biologici. Tuttavia, diversi passi e reagenti sono necessari per eseguire correttamente questa procedura. Per i ricercatori che non hanno mai eseguito questa tecnica, dando inizio al processo può essere intimidatorio a causa i molti passaggi. Ulteriormente, la natura lunga di questa procedura si presta ad errori tecnici, che possono essere difficile da risolvere.
L'obiettivo generale di questo articolo è di presentare un metodo semplice e diretto che renderà accessibile ad un vasto pubblico questa tecnica di ibridazione. Per ridurre l'introduzione di errori, vi presentiamo un approccio diretto che produce alta qualità gene espressione macchiatura e riduce al minimo segnale di fondo non specifici. Questa procedura è simile ad altri approcci sviluppati in sistemi modello tradizionale, come Danio rerio4. Qui, ci proponiamo di facilitare l'implementazione attenta di ogni passo usando una lista scaricabile (Supplemental File 1), per promuovere attenzione l'attuazione del protocollo. La spiegazione razionale per questa operazione è quello di facilitare organizzazione attraverso i molti passaggi di questa procedura. Questo articolo è adatto per i ricercatori interessati a condurre l'ibridazione in situ del intero-supporto nello sviluppo di embrioni, ma non hanno ancora eseguito la procedura. Il vantaggio dell'approccio scelto per i ricercatori Astyanax è che è stato testato e dimostrato in caverna e superficie pesce morph, facilitando in tal modo l'analisi dell'espressione comparativa. Il metodo presentato può essere utilizzato dai ricercatori negli studi su Astyanax e altri sistemi.

<table><tbody><tr><td>Pipetta sierologica da 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtrazione da 1000 mL</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conica</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 25 mL</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtrazione da 250 mL</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conico</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unità di filtrazione</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digossigenina-AP, Fab frammenti</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Soluzione bloccante</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kit di etichettatura dell'RNA DIG (SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Fiale dram in vetro</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1</td></tr> Dr <tr><td>Pipette in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio-cristallino</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>Acqua di grado molecolare (senza RNasi)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Pellet di NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>NBT Substrato in polvere</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore Nutante</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinasi K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Pipette in plastica</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua con agitazione 12 L</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 L</td></tr><tr><td>Agitatore analogico standard</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>tRNA Lievito</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di litio (LiCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

wholemount ibridazione in situ per gli embrioni astyanax

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Negli ultimi anni, è stato rilasciato un genoma di bozza per la caverna cieca messicano (Astyanax mexicanus), rivelando l'identità di sequenza per migliaia di geni. Ricerca priore in questo sistema modello emergente capitalizzati sulle indagini di genoma complete che hanno identificato numerosi loci di carattere ereditario quantitativo (QTL) associati con vari fenotipi di grotta-collegata. Tuttavia, la capacità di connettersi alla base ereditabile per cambiamento fenotipico di geni di interesse rimane una sfida significativa. Una tecnica che può facilitare la comprensione più profonda del ruolo di sviluppo in troglomorfiche evoluzione è intero-monta l'ibridazione in situ. Questa tecnica può essere implementata per confrontare l'espressione genica tra forme e superficie-caverne, nominare candidato geni alla base di QTL stabilito, identificare geni di interesse dagli studi di sequenziamento di nuova generazione o sviluppare altri direttamente approcci basati sulla scoperta. In questo rapporto, presentiamo un protocollo semplice, supportato da una lista di controllo flessibile, che può essere ampiamente adattato per l'uso ben oltre il sistema di studio presentato. Si spera che questo protocollo può servire come una vasta risorsa per la comunità di Astianatte e oltre.

In questo rapporto, forniamo un approccio semplice e diretto per eseguire etichettatura delle embrionali Astyanax campioni per analisi di espressione genica di alta qualità. Questa tecnica può essere effettuata in quattro o cinque giorni, e ogni passaggio principale della procedura è rappresentata in un diagramma di flusso con codifica a colori (Figura 1). Una volta completato, macchiati embrioni dovrebbero harbor un'etichetta cromatica viola scura n...

Questo protocollo permette la visualizzazione dell'espressione genica in embrionali Astyanax caverna. Questo approccio è stato sviluppato con l'obiettivo di massimizzare il segnale di espressione genica, riducendo al minimo una colorazione di fondo non specifici.

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Il nostro protocollo in situ è significativo perché fornisce un modo semplice per visualizzare i modelli di espressione genica con una colorazione minima dello sfondo. Questa tecnica rende un protocollo complicato e lungo relativamente facile da eseguire. I suggerimenti e le liste di controllo forniti rendono questo protocollo ancora più facile da eseguire correttamente e riprodurre.Mentre le tecniche qui mostrate sono specifiche di Astyanax mexicanus, potrebbero probabilmente essere adattate ad altri sistemi di individui di dimensioni comparabili con piccoli aggiustamenti al protocollo. Per prima cosa, usa il nastro da laboratorio colorato per designare fiale e pipette per ogni gene. Usando una pipetta Pasteur, ordina gli embrioni.Di solito non ci sono più di 12 embrioni per flaconcino, una volta ordinati. Quindi, imposta un bagno d'acqua tremante a 70 gradi Celsius. Estraggono con cura il metanolo nelle fiale degli embrioni selezionati e lo sostituiscono con 500 microlitri di metanolo fresco al 100%.Lavare brevemente gli embrioni per circa un minuto su uno shaker della piattaforma. Successivamente, reidratare gli embrioni in una crescente concentrazione di 1x PBS con Tween 20 su uno shaker di piattaforma come delineato nel protocollo di testo. Per iniziare, posizionare una piccola guarnizione con un fondo a rete nel bagno d'acqua rotante che è stato preriscaldato a 70 gradi Celsius.Inserire le aliquote del buffer di ibridazione meno e il buffer di ibridazione più nella guarnizione. Aggiungere delicatamente una soluzione di PK preparata alle fiale degli embrioni assicurando che tutti i tessuti siano completamente coperti in soluzione. Trasferire i flaconcini su uno shaker a piattaforma e lasciarli digerire nella soluzione di lavoro proteinasi K per circa 12 minuti.Successivamente, estraggono delicatamente la soluzione PK e inondano brevemente il flaconcino con PBT per diluire la chiave di piattaforma rimanente. Sostituire la soluzione PBT con 500 microlitri di PBT fresco e lasciare risciacquare la soluzione sullo shaker della piattaforma per cinque minuti. Sostituire quindi la soluzione PBT con 500 microlitri di PFA scongelato al 4%. Lasciare che gli embrioni incubano sullo shaker della piattaforma a temperatura ambiente per 20 minuti.Per iniziare la pre-ibridazione, aggiungere 500 microlitri di tampone di ibridazione prebellico meno la soluzione alle fiale contenenti embrioni. Posizionare con cura le fiale nella guarnizione nel bagno d'acqua a 70 gradi Celsius senza tremare per cinque minuti. Quindi estraggono il buffer di ibridazione meno la soluzione e inondano i flaconcini con 500 microlitri di buffer di ibridazione prebellico più soluzione.Riposizionare le fiale nella guarnizione nel bagno d'acqua e incubare con tremori per quattro ore o durante la notte. Per iniziare l'ibridazione, disegnare il buffer di ibridazione più dalle fiale e sostituirlo con 500 microlitri di nuovo buffer di ibridazione prebellico plus. Aggiungere con cura due microlitri di sonda RNA a ciascuna fiala e ruotare delicatamente per garantire una distribuzione uniforme della sonda.Incubare nel bagno d'acqua a 70 gradi Celsius durante la notte mentre si trema a 40 giri/min. Per iniziare, preparare tubi di microcentrifugo etichettati buffer di ibridazione più con il gene di interesse sonda RNA come delineato nel protocollo di testo. Impostare due tubi conici da 15 millilitri e aggiungere 0,2 grammi di reagente bloccante e 10 millilitri di MABT.Posizionare entrambi i tubi su un miscelatore di nutating fino a quando il reagente non viene completamente sciolto nella soluzione. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro estraggono il tampone di ibridazione più e sonda la soluzione e la posizionano in un tubo di microcentrifugo etichettato sterile. Conservare questo tubo nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro.Aggiungere con cura 500 microlitri del citrato di sodio salino caldo e del tampone di ibridazione meno diluizioni. Incubare in soluzioni sequenziali per 10 minuti ciascuna nel bagno d'acqua tremante, quindi a temperatura ambiente su uno shaker della piattaforma come delineato nel protocollo di testo. Dopo l'ultima incubazione, sostituire il 100%PBT da ogni flaconcino con 500 microlitri di MABT.Ripetere questo processo due volte per cinque minuti ciascuno. In primo luogo, rimuovere il MABT da ogni flaconcino e inondarlo di soluzione di blocco premiscelata da uno dei tubi conici da 15 millilitri. Posizionare entrambe le fiale sul miscelatore di nutating per quattro ore a temperatura ambiente.Aggiungere due microlitri dei frammenti di anticorpo al secondo tubo di soluzione di blocco preparata e brevemente vortice. Quindi riempire ogni fiala quasi completamente con soluzione di blocco e posizionarle su un miscelatore di nutating durante la notte in frigorifero a quattro gradi Celsius. Per iniziare, preparare una fiala stock del 10%NGS in MABT.Sostituire la soluzione di blocco in ogni flaconcino con 500 microlitri di questa soluzione NGS. Incubare a temperatura ambiente sullo shaker della piattaforma per 25 minuti. Successivamente, sostituire la miscela NGS con 500 microlitri del 100%MABT.Incubare sullo shaker della piattaforma a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo risciacquo altre 11 volte durante il giorno, ogni 30 minuti. Quindi riempire ogni fiala con 100%MABT e posizionarli su un mixer di nutating durante la notte in frigorifero a quattro gradi Celsius.In primo luogo, sostituire il MABT in ogni flaconcino con un millilitro di tampone AP e lasciarlo lavare per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio due volte per rimuovere completamente il MABT. Sostituire quindi il buffer AP con un millilitro di tampone PA fresco contenente 3,5 microlitri di BCIP e 4,5 microlitri di MBT.Sostituirlo con una nuova miscela di tampone AP contenente il BCIP e l'MBT ogni ora fino al completamento della reazione, assicurandosi di monitorare attentamente la reazione e controllare ogni 15 minuti fino a raggiungere il livello desiderato di colorazione. Interrompere la reazione di colorazione risciacquando gli embrioni in una concentrazione crescente di 1X PBT nel buffer AP come delineato nel protocollo. Risciacquare gli embrioni in circa cinque millilitri di 100%PBT su un miscelatore di nutating fino a raggiungere la colorazione minima di fondo desiderata.Al termine del risciacquo, lavare gli embrioni in 500 microlitri di PBS sterile su uno shaker a piattaforma e postfissare i campioni come delineato nel protocollo di testo. Dopo aver risciacquato gli embrioni, posizionarli in quattro millilitri di PBS sterile al 100% e, se necessario, conservarli a lungo termine a quattro gradi Celsius. In questo studio i campioni embrionali di Astyanax sono etichettati per l'analisi dell'espressione genica di alta qualità.Questo processo è stato implementato con successo sia nel pesce grotta pachon che negli embrioni di pesce di superficie. Gli embrioni di pesce grotta etichettati per l'espressione Sox9 dimostrano un'etichettatura chiara negli archi branchiali in via di sviluppo e nella pinna pettorale. Si noti che la colorazione è praticamente assente nel sacco vitellino o nei somiti in via di sviluppo sul fianco.Allo stesso modo, l'espressione di Tfap2a è evidente nelle porzioni della testa in via di sviluppo come cellule della cresta neurale di migrazione precoce lungo la regione del fianco dorsale dell'embrione. Il terzo gene presentato per gli embrioni di pesce grotta, Phf20a, è visto nelle porzioni del mesoderma somatico e della testa posteriore che sono destinate a dare origine a tessuto osseo. Gli embrioni di pesce di superficie etichettati per CXCR mostrano un'etichettatura positiva in regioni isolate della testa e del fianco, così come alcune singole cellule che sovrascrivano il sacco del tuorlo.Il gene Adcyap1a è espresso nelle regioni del sistema nervoso centrale comprese le cellule ipofisarie. Si noti l'espressione altamente specifica in ammassi bilaterali accoppiati di cellule sull'aspetto dorsale dell'embrione, così come una regione più ampia di espressione della linea mediana. L'ultimo gene esaminato per gli embrioni di pesce grotta, Sox10, è evidente come un primo marcatore della cresta neurale sui lati sinistro e destro dell'embrione dorsale.Dopo aver completato in situ, in genere immaginiamo i nostri risultati utilizzando la microscopia a luce. È meglio farlo entro due settimane dal completamento per evitare il degrado della colorazione.

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JoVE Journal

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Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

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Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

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