Name: Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e lattività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Scopri i protocolli di trasformazione di patate con Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes per studi di biotecnologia vegetale. Valuta l'attività del promotore mediante colorazione GUS nelle radici transgeniche.

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Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant a PB), il Ministerio de Economía y Competitividad e FEDER finanziamenti (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) e l'Università di Girona (borsa di dottorato a SF e grant SING11/1). Gli autori sono grati al Dr. Inge Broer (Istituto di uso del territorio, Università di Rostock, Rostock, Germania) e Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spagna) per la fornitura a. rhizogenes e il ceppo di a. tumefaciens , rispettivamente e Dr. Marçal Soler e Dr. Anna Plasencia per l'aiuto e il sostegno ricevuto nell'inizio degli esperimenti di trasformazione a. rhizogenes (Università di Tolosa III Paul Sabatier — CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Castanet Tolosan, Francia). Gli autori ringraziano Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) per la sua preziosa assistenza nella realizzazione dei lavori di laboratorio e prendersi cura di piante e Ferran Fontdecaba e Carla Sánchez, che ci ha assistito con alcuni esperimenti mentre stavano facendo loro progetti di laurea finale.

Il protocollo di trasformazione a. rhizogenes è stato adattato e modificato da corno et al.7 e il genotipo testato era S. tuberosum ssp. tuberosum (c.v. Désirée). Il protocollo di trasformazione a. tumefaciens è stato adattato e modificato da Bono et al.22 e i genotipi testati erano S. tuberosum ssp. tuberosum (c.v. Désirée) e S. tuberosum SSP. andigena. Le fasi principali di entrambe le procedure sono riassunti nella Figura 1 e figura 2, rispettivamente.
Nota: In tutte le fasi della procedura di esecuzione in vitro trasferimenti, farlo rapidamente e quando possibile, mantenere le piastre o vasi chiusi, riducendo così al minimo pianta esposizione all'aria per evitare l'avvizzimento e contaminazione. Diversamente indicato, tutte le incubazioni di pianta sono state fatte in armadi nelle condizioni di 12h di 24 ° C luce/12 h di 20 ° C scuro e 67 µmol m-1 s-1. Altrimenti, eseguire tutti i batteri manipolazione e in vitro pianta trasferimenti in condizioni asettiche in cappa a flusso laminare. Tutte le ricette di media per Agrobacterium e in vitro di colture vegetali sono fornite in Tabella S1.
Attenzione: Deposito di tutti i batteri geneticamente modificati e le piante per il contenitore di raccolta appropriato.
1. culture Agrobacterium usate per la trasformazione
Nota: Il ceppo utilizzato per la trasformazione di a. rhizogenes era la C58C1:Pri15837 (gentilmente fornito da Dr. Inge Broer) e che per la a. tumefaciens era il GV2260 (gentilmente fornito da Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-dipartimento di biologia dei sistemi vegetali presso Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) che contiene un T-DNA che trasportano un marcatore di trasformazione per monitorare la radice pelosa formazione. Per confrontare le radici trasformate generate da a. rhizogenes e a. tumefaciens, entrambi sono stati trasformati con il pKGWFS7 di vettore binario che contiene un T-DNA che trasportano il promotore FHT guida il gene reporter β-glucoronidase (GUS) ed il gene di resistenza alla kanamicina come un marcatore selezionabile15.
<ol><li>Scegli una colonia di Agrobacterium e crescere durante la notte (O/N) in 5 mL di medium YEB completate con gli antibiotici (Tabella S1) in una provetta da centrifuga 50 mL a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min.</li>
	<li>Per la trasformazione di a. tumefaciens , misurare la densità ottica, che deve essere OD600 = 0.6-1.0.<ol>
<li>Se la densità ottica è più alta, fare una sottocultura abbassandola a OD600 = 0.3 con media fresco e aspettare finché raggiunge la cultura OD600 = 0,6-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare 1 mL di coltura di Agrobacterium a 3.000 x g in una centrifuga di banco per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettaggio per rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di mezzo YEB fresco senza antibiotici. Ripetere questo passaggio per garantire la rimozione completa di antibiotici.<ol>
<li>Per la trasformazione di a. tumefaciens , nella risospensione ultimo aggiungere il volume appropriato di YEB per ottenere una densità ottica finale di OD600 = 0,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenere le cellule sul ghiaccio durante la preparazione le piante per essere infettati.</li>
</ol>2. il materiale vegetale per la trasformazione
<ol><li>Fare uno o due nodo talee o contenenti l'apicale o i germogli ausiliari da sterile in vitro patata piante (donatore); farle crescere in mezzo solido 2MS in vasi per 3-4 settimane (Figura 1A e Figura 2A).</li>
</ol>3. impianto di trasformazione utilizzando a. rhizogenes (Figura 1)
Nota: Questa procedura permette di ottenere delle radici pelosi trasformate. Per valutare l'espressione del transgene, è necessario un controllo negativo. Per preparare il controllo negativo, seguire la procedura utilizzando un ceppo di a. rhizogenes trasformato o trasformato con il vettore vuoto che include il gene marcatore di trasformazione.
<ol><li>Utilizzare mezzi freschi piatti; in alternativa, le piastre possono essere tenute a 4 ° C dal lato del coperchio, ermeticamente sigillate con pellicola trasparente per evitare la disidratazione media. Per preparare i piatti quadrati media, loro inclinazione ~ 15°, riempimento con 40 mL di MS e farli solidificare. Questo ridurrà al minimo il contatto della parte aerea della pianta con il mezzo.</li>
	<li>Trasferimento molto attentamente una pianta di donatore da 2MS medio a piastra quadrata 120 x 120 mm.</li>
	<li>Iniettare a uno stelo internodo 3 μL della cultura a. rhizogenes utilizzando un ago chirurgico e ripeterlo due volte per pianta in diversi internodi quando possibile. Nota: Considerare ogni iniezione come un evento di trasformazione indipendente (Figura 1B).</li>
	<li>Trasferire immediatamente l'intera pianta ad una piastra quadrata con tinta MS supplementato con acetosyringone di 0,1 mM. Ospitare 2 piante per piastra. Nota: La soluzione di riserva acetosyringone 1m è preparata in DMSO e possa essere conservata a-20 ° C.</li>
	<li>Sigillare la piastra utilizzando nastro chirurgico e disporre verticalmente all'interno di un armadietto di crescita per 4 giorni.</li>
	<li>Trasferire la pianta ad una nuova piastra quadrata con MS supplementato con cefotaxime sodium [500 µ g/mL] di uccidere a. rhizogenes.</li>
	<li>Dopo 10-12 giorni, radici pelosi inizieranno ad apparire (Figura 1,1D). Quindi, asportare le radici native della pianta e trasferire la pianta ad una nuova piastra quadrata con MS supplementato con cefotaxime sodico [500 µ g/mL]. Nota: Radici pelosi trasformate possono essere controllate da fluorescenza rossa quando usando un pennarello di trasformazione DsRed (Figura 3D).</li>
	<li>Per ottenere una pianta composita (Figura 1E), lasciare le radici pelosi transgeniche crescere per 3-4 settimane in MS supplementato con cefotaxime sodico [500 μg/mL] (cambiare il mezzo ogni settimana).</li>
	<li>A seconda dello scopo, propagare le radici pelosi transgeniche e controlli negativi come segue.<ol>
<li>Trasferire la pianta intera composita a idroponici (Tabella S2) o medio del terreno per consentire lo sviluppo massiccio.</li>
		<li>Per propagare individualmente le radici trasformate pelosi, usando un bisturi tagliata le radici che esprime l'indicatore rosso fluorescente trasformazione (proteina DsRed) quando sono lunghe 4-8 cm (Figura 1E) e trasferirli in una capsula di Petri con terreno solido Gamborg B5 completato con 2% di saccarosio e cefotaxime sodium [500 μg/mL]. Sigillare le piastre con parafilm plastica e farle crescere al buio a 20 ° C. Nota: Le radici possono essere manipolate sotto un microscopio stereoscopico in grado di rilevare la fluorescenza in condizioni sterili (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Per la produzione di biomassa (cioè, analisi di espressione genica), tagliare una radice lunga pelosi di 5 cm e si propagano in una beuta da 150 mL con 20 mL di liquido Gamborg B5 supplementato con 2% di saccarosio e cefotaxime sodium [500 µ g/mL]. Crescere per 6 settimane al buio a 20 ° C e 60 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3.jpg"> Figura 1: Sequenza temporale per ottenere patate transgeniche radici pelosi utilizzando a. rhizogenes. Le settimane cumulative per raggiungere ogni fase del processo di trasformazione e i passi successivi per crescere le radici pelosi sono mostrate. Sono raffigurate immagini rappresentative di diverse fasi: l'iniziazione del processo utilizzando 3-settimana-vecchio in vitro di piante (A), quindi l'infezione delle piante iniettando a. rhizogenes (B), la formazione della proliferativa tessuto (C, frecce) con radici pelosi emergenti (D) e le radici sviluppate pelosi che esprime l'indicatore rosso fluorescente trasformazione DsRed (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. impianto trasformazione utilizzando a. tumefaciens (Figura 2)
Nota: Questa procedura permette di ottenere delle piante trasformate. Per valutare effetto del transgene, è necessario un controllo negativo. È possibile seguire la procedura utilizzando un a. tumefaciens trasformate con il vettore vuoto. In alternativa, possono essere utilizzati piante wild type.
<ol><li>Tagliare e posizionare una foglia dalle piante di 3-4-settimana-vecchio (Figura 2A) in una capsula di Petri. Usando un bisturi escludere il picciolo e fare tagli trasversali (1-3 a seconda delle dimensioni della foglia) dal centro della foglia ai bordi evitando loro tagliando (Figura 2B).</li>
	<li>Immediatamente posto la foglia che galleggia su 10 mL di 2MS fresco liquido media in una capsula di Petri con il lato abbagliai fino e chiudere la piastra. Ripetere il passo in grado di ospitare fino a 15 fogli per CV Désirée e 25 foglie per SSP. unndigena (a seconda delle dimensioni di foglia).</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 80 µ l di a. tumefaciens cultura OD600 = 0,8 in mezzi liquidi e omogeneizzare la piastra manualmente per 1 min distribuire la soluzione batterica.</li>
	<li>Con attenzione sigillare con pellicola sigillante, coprire con carta stagnola e incubare per 2 giorni in una camera a 24 ° C per consentire la trasformazione si verificano.</li>
	<li>Trasferire le foglie mantenendo abbagliai laterale fino a medie CIM (Figura 2B) e incubare a loro per una settimana in un armadietto di crescita.<ol>
<li>Raschiare il mezzo CIM con le pinzette, affinché le foglie possono essere risolte al meglio sui media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire le foglie mantenendo abbagliai laterale fino a mezzo SIM (Figura 2) e incubare a loro in un armadietto, rinfrescante il mezzo ogni 7-10 giorni, fino a quando i germogli sono circa 2 cm di altezza di crescita.<ol>
<li>Raschiare il mezzo SIM con le pinzette, affinché le foglie possono essere completamente circondate dai media. Quando i germogli emersi raggiungono il coperchio, lavorare con altezza di Petri (100 x 20 mm, altezza x diametro). Nota: Il callo si forma dopo 2-3 settimane in media SIM (Figura 2D) e i germogli dopo 6-7 settimane (Figura 2E). I germogli saranno considerati eventi di trasformazione indipendente quando emergono dal callo formato dalle ferite indipendente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Taglio tre tiri è emerso da ogni callo (considerato lo stesso evento di trasformazione) (Figura 2E), trasferimento per matracci di cultura con il mezzo di MG completati con cefotaxime sodium [250 mg/L] per consentire il tifo, etichettare il sottoinsieme con un numero e Incubare in una crescita armadietto per 3-4 settimane o fino a quando i germogli sono vigoroso (Figura 2F). Nota: Quando si tagliano i germogli, rimuovere bene il callo altrimenti che la radice non si formerà.<ol>
<li>Ripetere il passaggio tante volte quante sono necessarie linee indipendenti. Fino a 5 diversi trasformazione eventi possono essere messo in un matraccio di cultura con un diametro di 8 cm per lavorare in piena fiducia che le piante da eventi diversi non sono mescolate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare la pianta più vigorosa di ciascun evento, tagliare il segmento apicale delle riprese con internodi di 3-4 e posizionarlo in un matraccio di cultura nuova con 2MS supplementato con cefotaxime sodium [250 mg/L]. Nota: In 3-6 settimane che la pianta crescerà in modo efficiente, lo sviluppo di una vigorosa ripresa e radici.<ol>
<li>Riportare alla camera i germogli non selezionati fino a quando la pianta selezionata è completamente sviluppato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare segmenti di fusto dalla pianta con almeno un internodo o con la gemma apicale e trasferirli al nuovo 2MS supplementato con cefotaxime [250 mg/L]. Incubare a loro nella crescita armadietto.<ol>
<li>Replicare ogni 3-4 settimane per stabilire le linee in vitro trasformato. Nota: Il sodio cefotaxima è necessaria in almeno tre trasferimenti successivi a 2MS medio per essere sicuri di uccidere a. tumefaciens; in seguito, se si osserva la crescita eccessiva di a. tumefaciens , trasferire le piante nuovamente ai media di 2MS completati con cefotaxime sodium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per caratterizzare il fenotipo della pianta, è necessario trasferire piante al suolo per la loro completa caratterizzazione o alla coltura idroponica per ispezione di radice.<ol>
<li>Mantenere i tuberi prodotti nel terreno per propagare e mantenere le linee stabilite.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig2.jpg"> Figura 2: Timeline per ottenere patate trasformato piante utilizzando a. tumefaciens. Le settimane cumulative per raggiungere ogni fase del processo di trasformazione e i passi successivi per coltivare le piante sono mostrate. Sono raffigurate immagini rappresentative di diverse fasi: l'iniziazione del processo utilizzando foglie da 3 - settimana-vecchio in vitro le piante (A), il trasferimento dei feriti e infetto foglie ai media CIM (B), le foglie quando trasferito a Media SIM (C), la visualizzazione del callo intorno alle aree feriti dopo 2-3 settimane in SIM media (D), la formazione di sparare dopo 9-11 settimane in media SIM (E) e i germogli dopo essere stato trasferito ai media di MG (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. idroponico cultura
<ol><li>Preparare la soluzione di Hoagland a una mezza forza (0.5 x) (Tabella S2) in un secchio di 10 L.</li>
	<li>Immergere una pompa da acquario per mantenere condizioni di ossigeno adeguato e omogeneità.</li>
	<li>Ricoprono le pareti del secchio con foglio di alluminio di crescere radici in condizioni di oscurità.</li>
	<li>Evitando danni alle radici, trasferimento in vitro le piante in coltura idroponica. Nota: Rimuovere qualsiasi supporto restante in vitro dalle radici per evitare la proliferazione di microrganismi durante l'incubazione agitando accuratamente le radici immerse in acqua.</li>
	<li>Coprire le piante con pellicola trasparente come una serra per consentire un'adeguata acclimatazione e incubare in camera di crescita.</li>
	<li>Forare la pellicola dopo 3 giorni e rimuoverlo completamente una settimana dopo.</li>
	<li>Sostituire con mezzi freschi ogni 10 giorni.</li>
</ol>6. analisi del gene del reporter istochimiche GUS 
Nota: Nel nostro caso il GUS analisi è stata eseguita con radici di 2-3 settimane coltivate in idroponica o in vitro.
<ol><li>Difficoltà le radici con acetone refrigerati il 90% (v/v) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Effettuare due lavaggi con acqua distillata.</li>
	<li>Aggiungere GUS fresco colorazione soluzione (tabella 1) e applicare il vuoto (-70 Pa) per 20 min.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C nel buio per proteggere il GUS fotosensibile per 4 h o fino a quando un colore blu è visibile. Nota: La presenza di ferri - e ferrocianuro in soluzione di GUS minimizzare la diffusione dei prodotti di reazione e fornire la localizzazione più precisa. Attenzione: Utilizzare un aspiratore e indossare indumenti protettivi quando si maneggia i derivati del cianuro tossico in soluzione di GUS (il ferricianuro di potassio e ferrocianuro di potassio). Il substrato di GUS e il materiale di smaltimento devono essere eliminati in modo sicuro.</li>
	<li>Rimuovere GUS soluzione di colorazione e gettarlo negli appositi contenitori.</li>
	<li>Effettuare due lavaggi con etanolo 70% (v/v).</li>
	<li>Osservare sotto un microscopio a campo chiaro. Nota: GUS macchiatura è stabile per un paio di settimane; Tuttavia, durante la prima settimana, il segnale di GUS è chiaro e diffonde meno in cellule vicine. Per conservarli più a lungo, sigillare il tubo e conservare a 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59119/59119tbl1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Tabella 1: Ricetta di soluzione colorante GUS.

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Patata, il sistema più comune per ottenere piante transgeniche complete stabile utilizza la trasformazione da ceppi di Agrobacterium tumefaciens che richiedono organogenesi utilizzando fitormoni esogeni. Anche se i protocolli di Agrobacterium basato ha il potenziale per integrare non-T-DNA vettore sequenza25, questa metodologia è ancora il metodo più semplice e meno costoso disponibile per trasformare piante di patate. Negli ultimi anni, l'interesse in a. rhizogenes-tras...

A parte di interesse economico, la generazione di piante transgeniche ha una propria rilevanza nella ricerca per dimostrare la funzione dei geni e capire meglio la fisiologia vegetale e sviluppo. Il più diffuso metodo per pianta inserimento del DNA è Agrobacterium-mediata trasformazione. Agrobacterium tumefaciens è in grado di generare corona Galle nel tessuto infetto di molte specie vegetali dall'azione del suo tumore-induzione plasmide (Ti). Il plasmide contiene una regione T-DNA con un set di geni che sarà integrato nel genoma della pianta e indurre il tessuto dedifferenziazione1,2. Lo scambio di questi geni all'interno del T-DNA di transgene ha permesso la generazione di modifiche specifiche impianto evitando effetti fenotipici3. Per facilitare il transgene clonazione nel T-DNA, regione del T-DNA è stata asportata in un plasmide indipendente chiamato un plasmide binario, mentre il resto dei geni del plasmide Ti (i geni di virulenza che consentono i meccanismi di trasferimento e inserimento di T-DNA) sono stati collocato in un plasmide helper. Per ricerca di biotecnologia della pianta, trasformazione di a. tumefaciens ha diversi vantaggi: essa non ha bisogno di costosi dispositivi, è in grado di generare sia trasformazione in pianta stabile e transitoria e basso numero di copie sono integrate nel gene la cromosoma4. Tuttavia, per la maggior parte delle piante, ma non, di Arabidopsis la generazione di trasformanti stabile richiede la rigenerazione della pianta da una sola o poche cellule utilizzando esogeni fitormoni, rendendo questo processo laborioso e che richiede tempo. A. rhizogenes è anche in grado di modificare il genoma della pianta, producendo radici pelosi o radici avventizie presso i siti di infezione a causa dell'espressione dei geni rol (radice loci) codificato in radice-induzione (Ri) plasmide5. Anche se meno studiata rispetto a. tumefaciens, a. rhizogenes è utilizzato anche per ottenere radici transgeniche. In questo caso, a. rhizogenes contiene l'originale T-DNA nel plasmide Ri e un plasmide binario con un secondo T-DNA che trasportano il transgene. Quando il sito di infezione è in fusti o ipocotili, una pianta composita può essere ottenuta, con nuove radici transgeniche pelosi emergenti dai germogli di tipo selvaggio. In alternativa, pelosa radici trasformate possono crescere autonomamente in vitro nei media con ingressi sorgente di carbonio. L'uso di a. rhizogenes invece di a. tumefaciens per produrre tessuti transgenici sta guadagnando importanza quando la radice è l'organo bersaglio, perché pianta rigenerazione non è necessaria e quindi è più veloce e meno costoso. Gli studi precedenti hanno dimostrato questa metodologia ha stanziata per la caratterizzazione fenotipica di radice specifici geni6,7,8,9.
La patata (Solanum tuberosum) è il quarto più importanti delle colture del mondo secondo la Food and Agriculture Organization delle Nazioni Unite (FAO) poiché il tubero ha rilevanza nutrizionale destinati al consumo umano per essere una buona fonte di vitamine e minerali. Per questo motivo, patata è stata posta sotto i riflettori di biotecnologia agricola e inoltre è considerata come un buon modello biologico per genetica ed evolutiva Studi10,11. Trasformazione di patate ha contribuito significativamente alla comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti quali tessuti attraverso la caratterizzazione di geni coinvolti nella Suberina e cera biosintesi12,13,14 ,15,16,17, Suberina monomero trasporto18 e trascrizione regolamento19. Il gene della transferasi feruloil suberina, FHT, è uno di questi geni biosintetici caratterizzati; la downregulation dà luogo ad un danno forte della protezione del periderma, che è correlata con una diminuzione forte in miscela di etanolo esteri di Suberina e cere di tuberi di patata14. In concomitanza, nelle radici e semi di Arabidopsis, il Ko di suo putativo ortologo (Massimo/RWP1) inoltre ha dimostrato suo ruolo nella produzione di alchil ferulates in suberina20,21. Patata, la linea di transcriptional reporter FHT e l'anticorpo FHT hanno mostrato rispettivamente che l'attività del promotore e le proteine si trovano in exodermis, endodermis, i phellogen-derivati e in tessuti feriti15.
In questo lavoro, dettagliamo un protocollo utilizzando a. rhizogenes per produrre transgeniche radici pelosi che sono mantenute in un tiro di tipo selvaggio, generazione di piante di patate composito o asportato per crescere autonomamente in vitro. Forniamo anche il protocollo utilizza a. tumefaciens per ottenere piante di patate transgeniche completa. Come caso di studio, a. rhizogenes e a. tumefaciens trasformato con lo stesso vettore binario sono utilizzati per ottenere le radici con il promotore FHT Guida di espressione del gene reporter GUS . I risultati sono segnalati e rispetto.

<table><tbody><tr><td> Acetone </td><td> Panreac </td><td> 1.310.071.21 </td><td></td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> Acros </td><td> 115540050 </td><td></td></tr><tr><td> Pompa per acquari </td><td> Prodac </td><td> MP350 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclave </td><td> Ragpa Strelimatic </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Agar batteriologico </td><td> Lab Conda </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> BAP </td><td> Duchefa </td><td> B0904 </td><td></td></tr><tr><td> Estratto di manzo </td><td> Lab Conda </td><td> 1700 </td><td></td></tr><tr><td> Armadio per la coltivazione di piante </td><td> Nuaire </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Duchefa </td><td> C0109 </td><td></td></tr><tr><td> Cefotaxime sodico </td><td> Duchefa </td><td> C0111 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Merck </td><td> 1029310161 </td><td></td></tr><tr><td> Ecotron infors </td><td> HT </td><td> 29378 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Merck </td><td> 1.009.831.011 </td><td></td></tr><tr><td> Falcon tube </td><td> Control tecnica </td><td> CFT011500 </td><td></td></tr><tr><td> Ferricianato </td><td> Sigma </td><td> 101001081 </td><td></td></tr><tr><td> Ferrocianato </td><td> Sigma </td><td> 100979088 </td><td></td></tr><tr><td> Flask (8,06 cm di diametro e 11,3 cm di altezza) e coperchio in plastica per in vitro coltura </td><td> Apiglass </td><td> ref16 </td><td></td></tr><tr><td> GA3 </td><td> Sigma </td><td> G7645 </td><td></td></tr><tr><td> Gamborg B5 media </td><td> Duchefa </td><td> G0210 </td><td></td></tr><tr><td> Gelrite </td><td> Duchefa </td><td> G1101 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Sigma </td><td> K1377 </td><td></td></tr><tr><td> Leukopor tape </td><td> BSN Leukopor </td><td> BDF47467 </td><td></td></tr><tr><td> Lupe </td><td> Wild-Heerbrugg </td><td> M420 </td><td></td></tr><tr><td> Agitatore magnetico </td><td> Agimatic </td><td> 7000243 </td><td></td></tr><tr><td> MES hydrate </td><td> Sigma </td><td> M2933-25G </td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td> Panreac </td><td> 131404 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olympus </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Minufugue centrifugue 5415R </td><td> Eppendorf </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Murashige e Skoog media </td><td> Duchefa </td><td> M0254.0050 </td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td> Panreac </td><td> 131679 </td><td></td></tr><tr><td> NAA </td><td> Duchefa </td><td> N0903 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Panreac </td><td> 131659 </td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td> Sigma </td><td> 58282 </td><td></td></tr><tr><td> NightSea Stereo </td><td> SFA Moonting Adapter </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Anorsa </td><td> PRFL-001-001 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> Lab Conda </td><td> 1616 </td><td></td></tr><tr><td> Petri plates (90 x 14) </td><td> Anorsa </td><td> 200200 </td><td></td></tr><tr><td> pHmetre </td><td> Crison </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Phytotron </td><td> Inkoa </td><td> RFTI-R5485 </td><td></td></tr><tr><td> Plant Agar </td><td> Duchefa </td><td> P1001 </td><td></td></tr><tr><td> Refrigeratot </td><td> Liebherr Medline </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Rifampicina </td><td> Duchefa </td><td> R0146 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Sigma </td><td> 59007 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotometer </td><td> Shimadzu </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Piastre quadrate (120 x 120) </td><td> Deltalab </td><td> 200204 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomicina </td><td> Sigma </td><td> S6501 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Panreac </td><td> 131621 </td><td></td></tr><tr><td> Lame chirurgiche </td><td> Swann-Morton </td><td> 201 </td><td></td></tr><tr><td> Ago chirurgico </td><td> NIPRO </td><td> 015/0204 </td><td></td></tr><tr><td> Triptone </td><td> Lab Conda </td><td> 1612 </td><td></td></tr><tr><td> Triton </td><td> Serva </td><td> 37240 </td><td></td></tr><tr><td> Unimax 1010 shaker </td><td> Heidolph </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Vuoto </td><td> Dinko </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> x-GlcA (acido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glucuronico, sale sodico anidro) </td><td> Biosynth </td><td> B-7398 </td><td></td></tr><tr><td> Estratto di lievito </td><td> Lab Conda </td><td> 1702.00 </td><td></td></tr><tr><td> Zeatin riboside </td><td> Sigma </td><td> 1001042850 </td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium tumefaciens e agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un gene di suberina da gus staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium SP. è uno dei metodi più diffusi per ottenere piante transgeniche in quanto ha la capacità di trasferire e integrare la propria T-DNA nel genoma della pianta. Qui, presentiamo due sistemi di trasformazione per modificare geneticamente le piante di patata (Solanum tuberosum). Nella trasformazione di a. tumefaciens , foglie sono infetti, le cellule trasformate sono selezionate e un nuovo impianto completo trasformato viene rigenerato utilizzando fitormoni in 18 settimane. Nella trasformazione di a. rhizogenes , steli sono infettati iniettando i batteri con un ago, le nuove radici pelosi trasformate emerse vengono rilevate utilizzando un marcatore fluorescente rosso e le radici non trasformate vengono rimossi. In 5-6 settimane, la pianta risultante è un composito di un germoglio di tipo selvaggio con radici pelosi trasformate completamente sviluppate. Per aumentare la biomassa, le radici di pelosi trasformate possono essere asportate e self-propagate. Abbiamo applicato entrambi metodi di trasformazione dell'agrobatterio -mediata per ottenere radici che esprimono il gene reporter GUS guidato da un promotore del gene biosintetici suberina. La procedura di colorazione di GUS è fornita e permette la localizzazione cellulare dell'induzione promotore. In entrambi i metodi, le radici di patata trasformata ha mostrato macchiatura nella quali endodermis ed exodermis e inoltre, nelle radici di a. rhizogenes trasformato l'attività GUS GUS inoltre è stato rilevato nell'emersione di radici laterali. Questi risultati suggeriscono che a. rhizogenes può essere uno strumento veloce alternativo per studiare i geni che sono espressi nelle radici.

Agrobacterium rhizogenes -mediata trasformazione di patate
In questo manoscritto, viene presentata la procedura dettagliata per ottenere trasformato radice con a. rhizogenes . Figura 1 presenta una panoramica della procedura, che richiede complessivamente circa 5-6 settimane (da iniezione di a. rhizogenes per ottenere pienamente sviluppate...

Qui, presentiamo due protocolli per trasformare piante di patate. La trasformazione di Agrobacterium tumefaciens conduce ad una pianta transgenica completa mentre l' Agrobacterium rhizogenes produce radici transgeniche pelosi in un tiro di tipo selvatico che può essere auto-propagato. Individuiamo quindi l'attività del promotore di GUS colorazione nelle radici trasformate.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

La trasformazione mediata dall'agrobatterio è un metodo semplice per produrre piante di patate geneticamente modificate. Al fine di comprendere specifiche funzioni geniche e il loro contributo alla fisiologia degli organi. La trasformazione da parte dell'agrobatterio rhizogenes è uno strumento robusto per valutare rapidamente le radici che funzionano con i geni, poiché risultati simili possono essere ottenuti mediante la trasformazione dell'agrobatterio tumefaciens.A dimostrare questa procedura saranno Sandra Fernandez-Pinan, un post-doc, e Jennifer Lopez, studentessa di un maste5r del nostro laboratorio. Inizia coltivando una singola colonia di agrobatteri durante la notte in cinque millilitri di brodo estratto di lievito, o mezzo YEB, integrato con antibiotici in un tubo di centrifuga da 50 millilitri a 28 gradi Celsius, a 200 rotazioni al minuto. Per la trasformazione a-tumefaciens, misurare la densità ottica la mattina successiva.Quando la densità ottica a 600 nanometri, o OD 600 raggiunge 0,6 a uno, centrifugare un millilitro della coltura di agrobatterio e rimorsi il pellet in un millilitro di mezzo YEB fresco senza antibiotici. Dopo il secondo lavaggio, resospendare il pellet in mezzo YEB fresco senza antibiotici, alla concentrazione appropriata per ottenere un OD 600 finale di 0,8, e posizionare le cellule batteriche sul ghiaccio. Per la trasformazione delle piante utilizzando A.rhizogenes, trasferire con cura una pianta donatrice da una coltura media 2MS a una piastra quadrata di 120 per 120 millimetri e utilizzare un ago chirurgico per iniettare tre microlitri da una coltura di A.rhyzogenes a diversi internodi dello stelo il più possibile.Quindi trasferire immediatamente l'intero impianto su una nuova piastra quadrata contenente mezzo MS solido, integrato con acetosiringone millimolare da 0,1 millimolare. Dopo aver posizionato una seconda pianta sulla stessa piastra, trasformata nello stesso modo, sigillare la piastra con nastro chirurgico e posizionare la piastra verticalmente all'interno di un armadio di crescita per quattro giorni. Trasferire la pianta su una piastra quadrata con mezzo MS integrato con cefotaxime sodio per uccidere gli A.rhizogenes e posizionare la piastra sigillata verticalmente all'interno di un armadio di crescita per quattro giorni.Dopo 10-12 giorni, appariranno nuove radici pelose. La loro trasformazione può essere confermata dal microscopio stereo fluorescente. In questo momento, asportare le radici native di ogni pianta e trasferire le piante su una nuova piastra quadrata con mezzo MS, integrata con cefotaxime sodio per uccidere gli A.rhizogenes.Per ottenere una pianta composita, lasciare crescere le radici pelose transgeniche per altre tre o quattro settimane nel mezzo MS, integrato con cefotaxime sodio. Per la trasformazione dell'impianto utilizzando A.tumefaciens. Tagliare e posizionare una foglia da una pianta di tre o quattro settimane in una piastra di Petri e utilizzare un bisturi per fare uno o tre tagli trasversali dal centro della foglia ai bordi senza tagliare i pezzi dalla foglia.e per escludere il piciolo. Posizionare immediatamente la foglia in una piastra di Petri contenente 10 millilitri di mezzo liquido fresco 2MS, lato abaxiale verso l'alto e coprire il piatto. Aggiungere rapidamente 80 microlitri della coltura di A.tumefaciens al mezzo liquido e mescolare delicatamente il mezzo per un minuto per distribuire in modo omogeneo la soluzione batterica.Quindi sigillare e coprire con cura la piastra con un foglio di alluminio per un'incubazione di due giorni in una camera Celsius di 24 gradi. Alla fine del periodo di trasformazione, trasferire le foglie lato abassiale verso l'alto, al mezzo induttivo indissolubile, raschiato con pinzette per un'incubazione di una settimana nel gabinetto di crescita. Alla fine dell'incubazione, trasferire le foglie, lato abassiale verso l'alto, su un mezzo di induttore di germogli raschiato con pinze e incubare le foglie in un armadio di crescita.Quando gli scivoli emersi sono alti circa due centimetri, tagliare tre scivoli emergenti da ogni ingenuo. Posizionare fino a cinque diversi eventi di trasformazione dello scivolo in singole fiasche di coltura contenenti mezzo MG integrato con cefotaxime sodio per consentire il rooting ed etichettare il sottoinsieme come appropriato per un'incubazione di tre o quattro settimane nell'armadio di crescita fino a quando gli scivoli non sono vigorosi. Al termine dell'incubazione, selezionare la pianta più vigorosa di ogni evento e tagliare i segmenti apicici dello scivolo con tre o quattro internodi da ogni pianta.Posizionare i segmenti in un pallone da coltura contenente mezzo 2MS integrato con cefotaxime sodio e far crescere le piante fino a sviluppare scivoli e radici vigorosi. Per eseguire un saggio gene del reporter istochimico beta-glucuronidasi o GUS, fissare le radici da una coltura vegetale in vitro di due o tre settimane con acetone refrigerato al 90% per 20 minuti sul ghiaccio. Al termine della fissazione, lavare le radici due volte in acqua distillata e trattare le radici con soluzione di colorazione GUS fresca sotto vuoto per 20 minuti.Alla fine del trattamento sottovuoto, posizionare le radici a 37 gradi Celsius al buio per circa quattro ore. Quando è visibile un colore blu, lavare le radici due volte con il 70% di etanolo e visualizzare la colorazione al microscopio a campo luminoso. Le radici pelose trasformate mostrano una florescenza rossa quando illuminate con luce verde, mentre il controllo negativo dell'agrobatterio non trasformato non dimostra tale florescence, indicando l'idoneità del marcatore di trasformazione rossa DS per identificare le radici pelose transgeniche.Qui sono mostrate la colorazione GUS nelle radici di piante transgeniche ottenute da A.tumefaciens e radici pelose transgeniche ottenute da A.rhizogenes. Come osservato, le radici trasformate con A, tumefaciens e coltivate in vitro, dimostrano la colorazione blu nell'endodermide, uno strato cellulare tra la corteccia e la stele. Nelle radici più sviluppate, l'etichettatura blu è irregolare nello strato esterno, corrispondente all'esodermide.Nelle radici pelose trasformate ottenute da A.rhizogenes, e coltivate in idroponica, il marcatore GUS si trova specificamente all'interno dell'endodermide nell'emergere di radici laterale nelle aree ferite e nell'esodermide. Oltre ad essere un metodo veloce, le radici transgeniche ottenute con l'agrobatterio rizogene trasportavano anche il DNA dal plasmide che induce radici, che può deregolamentare alcuni processi direttamente controllati. Le radici pelose transgeniche ottenute con agrobacterium rhizogenes possono essere mantenute mentre sparano, ma in alternativa possono essere in loco fino a propagarsi in vitro per una produzione di transito massiccio.La trasformazione della patata fornisce un buon strumento per controllare la funzione genica e l'attivazione del promotore, e anche per produrre regole metodologiche in una specie di alto interesse agronomico. L'organismo geneticamente modificato deve essere scartato in modo sicuro dopo l'uso per evitare la contaminazione ambientale. Inoltre, la soluzione di gas contiene derivati tossici del cianuro, quindi protezione dall'usura e scartare la soluzione in modo sicuro.

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