ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

Questo protocollo ATAC-seq modificato introduce un nuovo buffer di lisi che riduce le letture mitocondriali contaminanti dal 50% a meno del 3%La diminuzione della contaminazione mitocondriale consentirà ai ricercatori di eseguire ATAC-seq più efficienti con una diminuzione del 50% dei costi di sequenziamento. Abbiamo convalidato questo nuovo protocollo ATAC-seq nei PBPC primari umani, nei monociti primari umani, nelle cellule dendritiche del topo e nelle linee cellulari del melanoma. Crediamo che sarà efficace in una vasta gamma di tipi di cellule.

Ridurre al minimo la perdita di campioni durante il processo di attivazione e selezione delle celle è fondamentale per ottenere risultati di alta qualità con ATAC-seq. Dimostreremo come gestire un piccolo numero di cellule da campioni preziosi utilizzando attrezzature di laboratorio di base. Per iniziare, scongelare una fiala di cellule CD4+T precedentemente isolate in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi fino a quando il ghiaccio non si è appena sciolto.

Quindi trasferire delicatamente le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente nove millilitri di RPMI completo pre-riscaldato. Centrifugare le cellule a 1.500 volte G e quattro gradi Celsius, per sei minuti. Quindi scartare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet in due millilitri di RPMI completo.

Dopo aver ripetuto la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare delicatamente le cellule in 0,5 millilitri di RPMI completo. Usa un emocitometro per contare le cellule. Utilizzando l'RPMI completo, regolare la densità delle sospensioni cellulari sulla piastra 50.000 CD4 + celle in 200 microlitri per pozzo di una piastra inferiore rotonda da 96 po '.

Quindi, per preparare perline magnetiche, aliquote 12,5 microlitri di perline Human T-Activator CD3/CD28 per campione ATAC-seq su un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di 1x PBS al tubo e posizionarlo su un magnete per un minuto per lavare le perline. Rimuovere e scartare con cura il supernatante trasparente e rimuovere il tubo dal magnete.

Riprendono le perline in 13 microlitri di RPMI completo per campione ATAC-seq. Per attivare le celle CD4+T con la concentrazione regolata, raccogliere 500.000 celle in 2,1 millilitri di mezzo RPMI completo in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere 12,5 microlitri di perline Human T-Activator, preparati e lavati nei passaggi precedenti e mescolare delicatamente invertendo il tubo.

Quindi trasferire delicatamente le cellule, con perline, in un serbatoio sterile. Utilizzando una pipetta multicanale, placcare 200 microlitri di cellule con perline per pozzo di una piastra a 96 po 'a fondo tondo e incubare in un incubatore di 37 gradi Celsius, 5%CO2 per 48 ore. Dopo l'incubazione completa, centrifugare la piastra a 423 volte G e la temperatura ambiente, per otto minuti.

Rimuovere 100 microlitri di mezzo da ogni pozzo e raccoglierlo in un tubo conico prima di scartare, al fine di confermare nessuna perdita di perline. Quindi rimospendre il pellet cellulare nei restanti 100 microlitri di mezzo e raccogliere tutto in un tubo da 1,5 millilitri. Per isolare le celle CD4+, aggiungere 50 microlitri di perline coniugate CD4 prelavate a 500.000 celle in un millilitro di RPMI completo e invertire la miscela.

Incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius, mentre si svolazza a mano ogni sei minuti per mescolare. Posizionare il tubo sul magnete per due minuti, fino a quando il supernatante non è chiaro, quindi rimuovere e scartare. Rimuovere il tubo dal magnete.

Lavare le celle legate alle perline riutilizzandole in un millilitro di PBS, più il 2%FCS, e riposizionare il tubo sul magnete per un minuto. Scartare il supernatante chiaro e ripetere questo processo per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, posizionare il tubo sul magnete per un minuto.

Rimuoverlo, scartare il supernatante e posizionare il pellet sul ghiaccio. Successivamente, per eseguire l'isolamento dei nuclei, rimescolare le perline e le cellule in 50 microlitri di tampone di lysis fredda e centrifugare immediatamente a 500 G, quattro gradi Celsius, per 10 minuti. Rimuovere e scartare il supernatante.

Per eseguire la reazione trasposasi, rimescolare il pellet di nuclei isolati con 50 microlitri di miscela di trasposasi Tn5. Incubare in un termociclo per 30 minuti a 37 gradi Celsius, con il coperchio impostato su 40 gradi Celsius, quindi tenere a quattro gradi Celsius al termine. Subito dopo il termociclismo, eseguire un rapido spin-down di centrifuga da banco.

Posizionare il tubo sul magnete per un minuto per rimuovere le perline dal prodotto. Senza rimuovere il tubo dal magnete, trasferire il supernatante trasparente in una colonna di purificazione del DNA. Lavare la colonna una volta con 250 microlitri di tampone PB e due volte con 750 microlitri di tampone PE.

Quindi aggiungere 10 microlitri di tampone di eluizione per eludere il campione. Impostare la reazione di amplificazione PCR iniziale in un tubo PCR privo di nucleasi. Posizionare il tubo PCR nel termociclo e eseguire il programma di amplificazione PCR.

Quindi completare l'amplificazione FINALE PCR dei restanti 45 microlitri di reazione PCR, come descritto nel manoscritto. Posizionare il tubo PCR nel termociclo e eseguire il programma. Dopo l'amplificazione completa, purificare le librerie utilizzando un kit di pulizia PCR, seguendo il protocollo del produttore, eluindo in 25 microlitri del buffer di eluizione.

Sequenziare le librerie preparate su un sequencer di nuova generazione a una profondità di lettura media di 42 milioni di letture per campione. Questo protocollo ATAC-seq migliorato produsse una libreria finale di più di un nanogrammo per microlitro per sequenziamento. Il controllo di qualità ha mostrato frammenti di DNA tra le 200 e le 1.000 coppie di basi, e un ulteriore sequenziamento è stato eseguito con queste librerie di alta qualità.

Le librerie preparate a seguito di questo protocollo hanno mostrato solo il 3% di contaminazione mitocondriale. L'alta percentuale di letture utilizzabili è sufficientemente costante tra le repliche biologiche. Questo protocollo ha fornito risultati altamente riproducibili tra repliche tecniche, nonché repliche biologiche.

Inoltre, questo protocollo ha richiesto 48 ore, anziché una settimana o più come descritto in precedenza, con conseguente attivazione coerente ed efficiente, come dimostrato dai risultati di sequenziamento riproducibili. Inoltre, i picchi di ATAC-seq previsti sono stati accuratamente chiamati dalla pipeline di analisi. L'analisi dei risultati di sequenziamento ha rivelato chiari cambiamenti nello stato della cromatina durante l'attivazione delle cellule T umane.

Le regioni differenziali accessibili della cromatina aperta sono state identificate tra sei campioni prima e 48 ore dopo l'attivazione. Assicurarsi che la reazione di llisi dei nuclei sia eseguita con reagenti e materiali refrigerati, al fine di massimizzare il recupero di nuclei intatti. Il nostro tampone di lisi dei nuclei modificato è più delicato sulle cellule e riduce al minimo la contaminazione del DNA mitocondriale.

Attendiamo con impazienza che questo tampone di lisi modificato venga applicato anche ai singoli nuclei ATAC-seq. Sappiamo che questo protocollo consentirà ai ricercatori di produrre dati ATAC-seq di qualità superiore a un costo ridotto, contribuendo a inoltrare il campo epigenetico. Il protocollo è semplice, rapido e non richiede reagenti o strumenti pericolosi, rendendolo facilmente accessibile a coloro che sono nuovi ad ATAC-seq.