Name: Costruzione e luso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/Stromal In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Scopri come costruire una camera di stimolazione elettrica riutilizzabile per potenziare la differenziazione osteogenica nelle cellule staminali mesenchimali. Questo metodo semplice e a basso costo migliora i risultati nell'ingegneria tessutale ossea.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di Start-up di fondazione AO (S-14-03 H) e la Fondazione di Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) con sede a Francoforte sul meno, Germania.

1. costruzione di alloggiamento della coltura di stimolazione elettrica delle cellule
<ol><li>Per costruire la camera EStim, raccogliere due coperchi delle piastre per colture cellulari 6 pozzetti standard; filo di platino al 99,99%, 60 cm di lunghezza con un diametro di 0,5 – 1 mm; filo di rame argentati, 70 cm di lunghezza con un diametro di 0,6 mm; pinze di taglio; kit saldatore; un tubetto di colla superconduttore; connettore del blocchetto terminali di monofilo, sei piccolo 2,2 V LED (opzionale); un tubo di adesivo siliconico anti corrosivo rivestimento (opzionale); un rotolo di nastro nero dell'isolamento elettrico; standard, flessibile, isolato legare elettrico di rame (0,14 mm2), 2 m di lunghezza (tabella materiali).</li>
	<li>In un coperchio piastra a 6 pozzetti, segno e poi due fori di trapano (con un diametro di ~ 1 mm), 25 mm apart, vicino al bordo esterno di ciascuna delle sei pozzi (12 buche in totale), come mostrato in Figura 1A, B.</li>
	<li>Tagliate dodici lunghezze di 5 cm di filo di platino con pinze di taglio. Piegare ciascuno dei fili manualmente in una forma di L, lasciando un'estremità lungo 3 cm e gli altri 2 cm. tagliare il filo argento-rivestito in due lunghezze di 35 cm.</li>
	<li>Inserire l'estremità piegata (3 cm) più lunga di un filo di platino (da dentro a fuori) ogni foro praticato, lasciando una sporgenza dalla parte esterna del coperchio, 1 – 2 mm piegarlo usando il forcipe. Fissare i cavi platino nei fori coperchio con superconduttore colla e lasciare asciugare per circa 6 ore.</li>
	<li>Saldare i suggerimenti di tutti i sei fili di platino (che sarà poi servire come catodi, vedere Figura 1A) che sporge dai coperchi ad uno dei fili argentati. Ripetere la stessa procedura, saldare i fili di platino sei rimanenti (che serviranno poi come anodi) per l'altro filo argento-rivestito.<ol>
<li>Aggiungere il LED nel circuito tra ognuna delle sei coppie anodo catodo elettrodo di platino, per confermare la funzionalità durante gli esperimenti (opzionali). Posizionare un pezzo di nastro isolante nero sotto ogni LED per prevenire l'esposizione delle cellule in piastre di coltura per la luce del LED (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il connettore del blocchetto terminali di filo all'angolo in alto a sinistra del coperchio piastra a 6 pozzetti per colla e collegare entrambi i fili argentati ai morsetti di ingresso, come mostrato in Figura 1.</li>
	<li>Tagliare una sezione di 20 x 20 mm dall'angolo superiore sinistro di un secondo coperchio piastra a 6 pozzetti (Figura 1B, coperchio Nr. 2) per ospitare il connettore del blocchetto terminali sul coperchio del primo. Coprire il coperchio primo, dotato di elettrodi, con il secondo coperchio e fissarli con nastro adesivo insieme con nastro adesivo.<ol>
<li>Per migliorare l'incollaggio dei due coperchi, utilizzare adesivo siliconico, rivestimento (opzionale). A tale scopo, coprire il coperchio con gli elettrodi d'argento con uno strato di adesivo siliconico 3 – 5 mm e coprire con coperchio, permettendo 12 h per l'adesivo ad asciugare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collegare un'estremità dei due fili di rame isolati standard ai terminali di uscita del filo connettore e le altre estremità di connettori maschio a banana (4 mm). Nota: La lunghezza di questi fili dipende dalla distanza dalla mensola in incubatrice, dove verranno mantenute le celle, all'alimentazione, all'esterno dell'incubatrice (Figura 1).</li>
	<li>Regolare il dosaggio (tensione) e regime di EStim consegnati alle cellule regolando l'alimentazione DC.<ol>
<li>Accendere l'alimentazione premendo il pulsante ON/OFF sul pannello frontale. Attiva il canale 1 premendo il tasto 1.</li>
		<li>Premere il pulsante Nr. 4 (V-set) per impostare la tensione. Premere contemporaneamente i tasti 2, . e 5 per impostare l'uscita di carico a 2,5 V. Premere invio.</li>
		<li>Accertarsi che l'uscita di carico di 2,5 V (2.500 mV) corrisponde a una stima di 100 mV/mm, secondo l'equazione seguente, semplificata. V EStim = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg"> ; o V = VEStim × d Qui, V = tensione di alimentazione di uscita in millivolt; d = la distanza tra gli elettrodi in millimetri; V EStim = stimolazione tensione in millivolt per millimetro. Nota: Questa semplificazione si applica solo in caso di costante tensione di CC. La resistenza tra il mezzo e le cellule è trascurabile come elettrodi non sono a diretto contatto con le cellule; invece, EStim è trasportato alle cellule attraverso il mezzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mesenchymal stem cell cultura in medium osteogenica
<ol><li>Acquistare e conservare MSCs ratto commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali) in azoto liquido fino al giorno dell'esperimento. In alternativa, MSCs l'isolato dagli altri animali secondo i protocolli pubblicati altrove7,8 disposizioni istituzionali locali per l'uso di animali da esperimento.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, rimuovere un flaconcino (1 x 106 cellule) di cellule staminali mesenchimali dallo stoccaggio di azoto liquido e rapidamente (entro 1 min) scongelare le cellule in un bagno di acqua preriscaldato a 37 ° C.<ol>
<li>In condizioni di sterilità in cappa a flusso laminare, pipettare il contenuto del flacone in un tubo falcon 50 mL e aggiungere 9 mL di medium normale (NM) preriscaldata a 37 ° C, che consiste del mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM; 1x) con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione di penicillina/streptomicina. Agglomerare le cellule per 5 min per centrifugazione a 300 x g.</li>
		<li>In una cappa a flusso laminare, rimuovere il supernatante e Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 12 mL di NM preriscaldata a 37 ° C. Trasferire le cellule sedimento in un pallone di cultura delle cellule T-75.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coltura, le cellule a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 fino a raggiungere una confluenza di 80 – 90% (dopo circa 3 – 5 giorni).</li>
	<li>Le cellule del passaggio. Nota: Eseguire tutte le operazioni tranne centrifugazione e incubazione in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.<ol>
<li>Dopo aver raggiunto una confluenza di 80 – 90%, recuperare le cellule con soluzione di distacco delle cellule. Aspirare il terreno di coltura cellulare, lavare 2x con 1 soluzione salina x tampone fosfato (PBS), aggiungere 5 mL di soluzione per distacco delle cellule 1x e restituire le cellule nell'incubatore per 5 min.</li>
		<li>Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere una pari quantità di terreno di coltura per inattivare la soluzione di distacco. Raccogliere le cellule in un tubo falcon 50 mL e li spin a 300 x g per 5 min.</li>
		<li>Eliminare il terreno e risospendere le cellule in 1 mL di medium normale fresco. Valutare il numero di cellule vitali con la macchia blu di trypan.</li>
		<li>Semi di 1 x 106 cellule in una nuova staffa di T-75 con 12 mL di NM preriscaldati. Coltura, le cellule a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 fino a raggiungere una confluenza di 80 – 90%. Nota: Cella passaggio (misure 2.4.1–2.4.4) può essere ripetuto alcune volte fino ad ottenuta il numero necessario di cellule. Non utilizzare cellule oltre passaggio 8 anni di età.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 cellule di seme 9 x 10 in 3 mL di nanometro (10% inattivati siero fetale bovino, 1% di penicillina/streptomicina, DMEM) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti. Incubare le cellule per 1 giorno a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.</li>
	<li>Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura e applicare 3 mL di mezzo di differenziazione osteogenica (OM; normale supplementato con 10-7 M desametasone, β-glicerofosfato di 10 mM e 0,05 mM acido ascorbico-2-fosfato).</li>
	<li>Posizionare la piastra 6 pozzetti con cellule nell'incubatrice e incubare a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 durante la notte.</li>
</ol>3. trattamento di MSCs con EStim
<ol><li>Il giorno che le cellule sono trattate con EStim, sterilizzare gli elettrodi in soluzione di etanolo 70% per 30 min; quindi, asciugarli sotto la luce in un armadietto per altri 30 min di sicurezza UV.</li>
	<li>In una cappa a flusso laminare, coprire la piastra 6 pozzetti contenenti i MSCs coltivate con il coperchio dotato di elettrodi, assicurandosi che gli elettrodi sono completamente sommerse in mezzo (se necessario, aggiungere il terreno). Trasferire la piastra 6 pozzetti coperta (EStim sezione) con le cellule nell'incubatore e collegare i suoi fili dell'alimentazione.</li>
	<li>Impostare l'alimentazione a 2,5 V carico uscita e trattare le cellule con EStim per 1h3,9.</li>
	<li>Dopo stimolazione, scollegare l'alimentazione elettrica e rimuovere la camera EStim dall'incubatrice. In condizioni di sterilità, scambiare il coperchio dotato di elettrodi con un coperchio piatto 6 pozzetti standard.</li>
	<li>Riporre le cellule nell'incubatore e lasciarli durante la notte. Pulire gli elettrodi, prima con PBS e poi con soluzione di etanolo al 70%. Pulire i prodotti di corrosione accumulato dalla superficie dell'elettrodo con carta vetrata fine.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1 – 3,5 per 6 giorni consecutivi. Il giorno 4, prima dell'applicazione EStim e in condizioni di sterilità, modificare il terreno di coltura ad aspirazione 1,5 mL di terreno e la sua sostituzione con 1,5 mL di preriscaldati om fresco</li>
	<li>Dopo aver applicato EStim per 7 giorni consecutivi, mantenere le cellule in coltura per altri 7 giorni, scambiando il mezzo ogni 3 – 4 giorni.</li>
</ol>4. misurazioni di differenziazione osteogenica
<ol><li>Analizzare i cambiamenti di morfologia delle cellule al microscopio.</li>
	<li>Per valutare l'effetto di EStim il differenziamento osteogenico MSC, misura il deposito del calcio, attività della fosfatasi alcalina ed espressione del gene marcatore osteogenica, come descritto altrove3,9.</li>
</ol>

<ol><li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine%3A+What+Is+the+Evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li>
<li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications%3A+Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li>
<li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821(2017).</li>
<li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).</li>
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<li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC%2FEPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui descriviamo la costruzione di una camera e un metodo per il trattamento di cellule staminali mesenchimali con EStim che si traduce in una maggiore differenziazione osteogenica.
Il setup di EStim presentato non richiede particolare attrezzature/conoscenza e può essere eseguito in un laboratorio di Biologia/biochimica standard sulle cellule staminali dai ricercatori junior. Tuttavia, quando costruire e usare la camera di EStim, è necessario prestare attenzione speciale in pochi passaggi crit...

Un aumento nel trauma e/o difetti ossei malattia-indotta sono stati trattati utilizzando diverse combinazioni di tecnologie di medicina rigenerativa e terapia cellulare. MSCs sono le cellule di scelta in tali trattamenti, a causa della loro attività osteogenica relativamente elevata, isolamento ed espansione efficienza e sicurezza1. Per massimizzare la loro attività osteogenica e, quindi, ottimizzare la loro efficacia terapeutica, sono stati introdotti diversi metodi per manipolare MSCs prima del loro utilizzo in questi trattamenti (come Recensito da Mauney et al.2). Uno di questi metodi è EStim, che ha dimostrato di migliorare la differenziazione osteogenica MSC in vitro3 e promuovere in vivo4di guarigione ossea. Nonostante il numero crescente di studi concentrandosi sul trattamento MSCs con EStim, un regime ottimale per massimizzare l'effetto pro-osteogenico di EStim deve ancora essere definito.
Altri metodi in vitro utilizzando EStim utilizzano sale ponti sommersi nel terreno di coltura, che separa le cellule da elettrodi metallici5. Il vantaggio di questo è che la prestazione EStim tramite ponti sale Elimina l'introduzione di sottoprodotti chimici (ad esempio, la corrosione degli elettrodi metallici) che possono essere citotossici. Nonostante questo vantaggio, sale ponti sono ingombranti per lavorare con ed EStim consegnano differisce da quello consegnato in modelli in vivo, che lo rende difficile da correlare i risultati ottenuti con i due sistemi. Configurazioni che consegnare EStim tramite elettrodi metallici o carbonio fissati all'interno dei pozzi di cultura delle cellule (come Recensito da Hronik-Tupaj e Kaplan6) meglio simulano dispositivi utilizzati in vivo; Tuttavia, questi dispositivi sono difficili da pulire/sterilizzare tra un utilizzo e il numero delle cellule che possono essere studiate per esperimento è limitato. Abbiamo progettato la camera EStim presentata qui appositamente per risolvere le limitazioni di queste altre configurazioni. Mentre la maggior parte della nostra esperienza nell'utilizzo di quest'Aula EStim è stato con 2D e 3D colture contenenti midollo adiposo-tessuto-derivata e MSCs3,4, dei principali vantaggi di questa camera è che è versatile e, con relativamente minori modifiche, può essere adattato per studiare altri tipi di cellule in una varietà di condizioni diverse.
Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim; quindi, dimostriamo l'uso dal servizio MSCs trattante con regimi differenti di EStim e misurando l'effetto risultante sul differenziamento osteogenico. Differenziazione osteogenica MSC è valutata tramite il deposito del calcio, attività della fosfatasi alcalina ed espressione genica osteogenica marcatore. Importante, in passato esperimenti che hanno usato questa configurazione, abbiamo osservato che questi effetti pro-osteogenico persistono lungamente dopo che il trattamento di EStim è stato interrotto.

<table><tbody><tr><td>Estim fabrication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connettore a banana/Adattatore jack</td><td>Poppstars</td><td>1008554</td><td>2 pezzi</td></tr><tr><td>Pinze da taglio</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore DC (0-30V/0-3A)</td><td>B& K Precision</td><td>Modello 9130B</td><td>Qualsiasi modello simulato può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Fili flessibili isolati (0,14 mm2)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2 pezzi</td></tr><tr><td>Gomma siliconica non corrosiva</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>*potrebbe essere acquistato da molti negozi</td></tr><tr><td>Filo di platino (999,5/1000; 1mm &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0,6 m necessario per 1 camera Estim</td></tr><tr><td>Soluzione di etanolo al 70%</td><td>qualsiasi</td><td></td><td>Sterilizzazione della camera Estim</td></tr><tr><td>Filo di rame rivestito d'argento (0,6 mm &oslash;)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>409334 - 62</td><td>&asim; 70 cm necessari per 1 dispositivo Estim</td></tr><tr><td>Set di saldatori</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi modello simulato</td></tr><tr><td>Coperchio per piastra TPP a 6 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>2 coperchi per camera Estim</td></tr><tr><td>LED circolari cablati da 2,2 V</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6 pezzi</td></tr><tr><td>UHU Super colla</td><td>UHU GmbH & Co. KG</td><td>n/a</td><td>*potrebbe essere acquistato da molti negozi</td></tr><tr><td><forte>coltura MSC</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sale disodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>coltura cellulare osteogenica</td></tr><tr><td>DMEM, basso glucosio, integratore GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>21885025</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo-Fischer Coltura</td><td>cellulare</td><td>14190144</td> scientifica</tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td> coltura <td>cellulare osteogenica</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td>10500064 coltura cellulare</td></tr><tr><td>50 ml Provetta Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>coltura</td></tr> <tr>cellulare osteogenica<td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>15140122</td><td>colture cellulari</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) cellule staminali mesenchimali di ratto, origine del midollo osseo</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di distacco cellulare</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>A1110501</td><td>colture cellulari, stacco cellulare</td></tr><tr><td>TC Flask, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piastre TPP a 6 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye, soluzione allo 0,4%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>conta cellulare</td></tr></tbody></table>

costruzione e l'uso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/stromal in vitro

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Cellule staminali/stromali mesenchimali (MSCs) sono stati ampiamente utilizzate per promuovere la guarigione dell'osso in approcci di ingegneria tissutale. Stimolazione elettrica (EStim) ha dimostrata di aumentare la differenziazione osteogenica MSC in vitro e promuovere nelle regolazioni cliniche di guarigione ossea. Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim e suo uso nel trattamento dell'osso-zucchino-derivate MSC per migliorare la differenziazione osteogenica del ratto. Abbiamo trovato che il trattamento MSCs con EStim per 7 giorni si traduce in un aumento significativo nel differenziamento osteogenico e d'importanza, questo effetto pro-osteogenico persiste a lungo dopo (7 giorni) EStim è interrotto. Questo approccio di pretrattamento MSCs con EStim per migliorare la differenziazione osteogenica potrebbe essere usato per ottimizzare i risultati del trattamento di tessuto osseo e, quindi, di aiutarli a raggiungere il loro potenziale terapeutico completo. Oltre a questa applicazione, questo alloggiamento della coltura delle cellule EStim e protocollo utilizzabile anche per studiare altri comportamenti di cella EStim-sensibili, come la migrazione, la proliferazione, apoptosi e impalcatura allegato.

Per valutare l'effetto di 100 mV/mm di EStim sul differenziamento osteogenico di cellule staminali mesenchimali, cellule trattate con EStim per 3, 7 e 14 giorni o non trattato (controllo) sono stati analizzati al giorno 14 di coltura valutando i cambiamenti morfologici e deposizione di calcio (Figura 2 ). Questo è stato fatto da imaging celle utilizzando la microscopia a campo chiaro (cambiamenti di morfologia) o fissando le cellule in soluzione di paraformal...

Qui presentiamo un protocollo per la costruzione di un alloggiamento della coltura cellulare progettato per esporre le cellule a vari tipi di stimolazione elettrica e il suo uso nel trattamento di cellule staminali mesenchimali per migliorare la differenziazione osteogenica.

Costruzione e l'uso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/Stromal In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Qui, mostriamo come costruire una camera di stimolazione elettrica usando le comuni sei piastre di coltura murale, e come usarla per stimolare la differenziazione osteogenica nelle cellule staminali mesenchimali. Questa camera è facile e non costosa da costruire e può essere riutilizzata in più esperimenti. Dopo essere state pretrattate con stimolazione elettrica nella nostra camera, le cellule staminali mesenchimali possono essere utilizzate per migliorare i risultati nei trattamenti di ingegneria del tessuto osseo.Questa camera può anche essere utilizzata per indagare altri tipi di cellule e comportamenti cellulari elettro-sensibili come migrazione, proliferazione, cambiamenti nel potenziale della membrana, apoptosi e attaccamento attento. In un coperchio a sei piastre, segnare e quindi praticare due fori di diametro di un millimetro, distanti 25 millimetri l'uno dall'altro, vicino al bordo esterno di ciascuno dei sei pozzi. Quindi, tagliare un filo di platino in sezioni lunghe 12 cinque centimetri.Piegare manualmente ogni sezione di cinque centimetri in una forma A, lasciando un'estremità lunga tre centimetri e gli altri due centimetri di lunghezza. Quindi, tagliare il filo rivestito d'argento in due lunghezze di 35 centimetri. Inserire l'estremità piegata più lunga di un filo di platino nel foro forato, lasciando uno o due millimetri sporgenti dall'esterno del coperchio.Piegarlo usando le forcep. Successivamente, fissare i fili di platino nei fori del coperchio con colla super conduttiva e lasciarli asciugare per circa sei ore. Per preparare i catodi, saldare le punte di tutti e sei i fili di platino sporgenti dal coperchio a uno dei fili rivestiti in argento.Per preparare gli anodi, saldare i restanti sei fili di platino ad altri fili rivestiti in argento. Successivamente, aggiungere LED nel circuito tra ciascuna delle sei coppie di elettrodi di platino anodico-catodo per confermare la funzionalità. Posizionare un pezzo di nastro isolante nero sotto ogni LED per evitare di esporre le celle nelle piastre di coltura alla luce a LED.Quindi, incollare il connettore del blocco terminale del filo nell'angolo in alto a sinistra del coperchio della piastra a sei pozzi e collegare entrambi i fili rivestiti in argento ai terminali di ingresso. Quindi, tagliare una sezione quadrata di 20 millimetri per 20 millimetri dall'angolo in alto a sinistra di un secondo coperchio a piastre a sei porsi, per ospitare il connettore del blocco terminale sul primo coperchio. Coprire il primo coperchio, dotato degli elettrodi, con il secondo coperchio, e rastrerli insieme al nastro adesivo.Collegare un'estremità dei due fili di rame isolati standard ai terminali di uscita del connettore del filo e l'altra estremità ai connettori maschi di banana. Accendere l'alimentatore premendo il tasto ON-OFF sul pannello frontale. Attivare il canale uno premendo il pulsante uno.Successivamente, premere il pulsante quattro per impostare la tensione. Impostare l'uscita di carico a 2,5 volt. Quindi premere INVIO.Il giorno in cui le cellule vengono trattate con fusto E, sterilizzare gli elettrodi in soluzione di etanolo al 70% per 30 minuti. Quindi, asciugarli sotto la luce UV in un armadio di sicurezza per altri 30 minuti. In una cappa di flusso laminare, coprire la piastra a sei po', contenente i CCC coltivati con il coperchio dotato degli elettrodi, assicurandosi che gli elettrodi siano completamente immersi nel mezzo.Quindi, trasferire la piastra coperta a sei pozzi con le celle all'incubatore e collegare i suoi fili all'alimentatore. Successivamente, impostare l'alimentatore su 2,5 volt di uscita di carico e trattare le cellule con gambo E per un'ora. Dopo la stimolazione, scollegare l'alimentatore e rimuovere la camera dello stelo E dall'incubatore.In condizioni sterili, sostituire il coperchio, dotato di elettrodi, con un coperchio standard a piastre a sei possi bene. Successivamente, riportare le cellule nell'incubatrice e lasciarle durante la notte. Pulire gli elettrodi, prima con PBS e poi con soluzione di etanolo al 70%.Quindi, pulire i prodotti di corrosione accumulati dalla superficie dell'elettrodo con carta vetrata fine. Ripetere il trattamento dello stelo E per sei giorni consecutivi. Il quarto giorno, prima di applicare la stimolazione elettrica, e in condizioni sterili, cambiare il mezzo di coltura aspirando 1,5 millilitri di mezzo e sostituendolo con 1,5 millilitri di mezzo di differenziazione osteogenico fresco preri riscaldato.Dopo aver applicato la stimolazione elettrica per sette giorni consecutivi, mantenere le cellule in coltura per altri sette giorni, scambiando il mezzo ogni tre o quattro giorni. Al termine del trattamento, analizzare i cambiamenti della morfologia cellulare al microscopio. Per valutare l'effetto della stimolazione elettrica sulla differenziazione osteogenica MSC, misurare la deposizione di calcio, l'attività della fosfatasi alcalina e l'espressione genica marcatore osteogenica, come descritto altrove.Per valutare l'effetto di 100 millivolt per millimetro di stimolazione elettrica sulla differenziazione osteogenica MSC, le cellule trattate con stimolazione elettrica per tre, sette e 14 giorni e le cellule non trattate, sono state analizzate al giorno 14 della coltura valutando i cambiamenti morfologici e la deposizione di calcio. Cambiamenti significativi nella morfologia cellulare e nei depositi di calcio sono stati visibili nelle cellule trattate con stimolazione elettrica per sette e 14 giorni. Un'analisi dettagliata dei cambiamenti dell'espressione genica marcatore osteogenica è stata eseguita nei giorni tre, sette e 14 della coltura.Al settimo giorno di coltura, l'espressione runx2 era significativamente più alta nelle cellule trattate con stimolazione elettrica per sette giorni. Mentre l'espressione di Colla1 era significativamente più alta nelle cellule trattate per sette giorni, misurate al giorno 14 della coltura. L'espressione dell'osteopontina è stata significativamente aumentata nelle cellule stimolate elettricamente nei giorni tre, sette e 14 della coltura.L'espressione di Osterix era assente nelle cellule di controllo in tutti i punti di tempo, ed era vista solo a sette e 14 giorni di coltura nelle cellule esposte alla stimolazione elettrica. La camera di stimolazione elettrica è relativamente facile da costruire. Tuttavia, è necessario prestare particolare attenzione quando si maneggiano i fili di platino e anche quando si puliscono e sterilizzano gli elettrodi.Le cellule pretrattate all'elettricità nella nostra camera, sole o seduti su un materiale impalcatura, potrebbero essere impiantate in modelli animali, per studiare come l'effetto positivo della stimolazione elettrica persista in vitro. Questa tecnica fornisce uno strumento semplice ma potente per studiare il meccanismo con cui la stimolazione elettrica regola le funzioni cellulari. Questa conoscenza può essere disponibile nelle cellule di medicina rigenerativa.

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Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule

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Costruzione e luso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/Stromal In Vitro (Video) | JoVE Journal

Costruzione e l'uso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/Stromal In Vitro

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