Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Le vescicole extracellulari sono sempre più utilizzate come biomarcatore diagnostico e potenziale strumento terapeutico in molti campi. Flow Cytometric è il metodo analitico più dritto per caratterizzare con marcatori con faccia a tuta questo protocollo può essere utilizzato nell'analisi di una particella assizzata, è veloce ed è applicabile ai sismometri convenzionali senza la necessità di un'impostazione speciale o dello strumento dedicato. Sebbene questo protocollo sia usato per classificare le vescicole extracellulari da tale condizione e mezzo, può essere espanso verso la categorizzazione dei CV arrivati dal sangue, per sostituire le biopsie tissutali invasive nei pazienti.

Per i ricercatori nuovi al protocollo, è fondamentale eseguire i passaggi descritti nella sezione del metodo di set-up e seguire da vicino le strategie di ottenere dimostrate Iniziare rivestendo 55 centimetri di petri-dishes squadrati con 02% gelatina di pelle suina, in PBS. Dopo 15 minuti, lavare il piatto e il piatto 4,4 volte 10 alla quinta cellule progenitrici cardiache su ogni piatto in 7 millilitri del Medium di Dulbecco modificato di Iscove, o IMDM, integrato con siero bovino fetale al 20%, e 1%penicillina e streptomicina per la loro incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, lavare le colture due volte con il PBS di Dulbecco senza calcio e magnesio e nutrire le cellule con 10 milileter di mezzo di produzione esosoma privo di siero.

Dopo 7 giorni, mettere in comune il mezzo condizionato da ogni piastra, in un unico tubo di centrifuga in polipropilene e centrifugare il mezzo per rimuovere eventuali detriti cellulari. Trasferire il supernatente in un tubo filtrante di centrifuga da 100 kilodalton e concentrare il mezzo sgombrato, condizionato, con una centrifugazione aggiuntiva. Trasferire il concentrato in un tubo di micro centrifuga per una centrifugazione finale sul banco e aggiungere il supernatent in un tubo di microfuga a parete spesso in policarbonato.

Riempire il tubo con PBS, ad un volume finale di 3,2 milileters, e caricare il campione in un rotore angeled fisso in titanio. Quindi caricare il rotore in un ultracentrifugo da tavolo per l'ultracentrifugazione e rimescolare il pellet in 100 microlitri di PBS fresco. Per il tracciamento e la quantificazione dell'analisi delle nanoparticelle, diluire 1 microliter del campione ultracentrifugato, in 999 microlitri di PBS, e caricare il campione in una siringa da 1 milileter senza bolle.

Caricare la siringa nella porta di ingresso della camera d'esame e accendere il laser. Usa il pulsante di acquisizione per aprire la fotocamera e regolare la messa a fuoco. Quindi registrare almeno tre diversi fotogrammi di 60 secondi ciascuno e utilizzare l'opzione di processo batch nel software, per analizzare le tre diverse acquisizioni.

Per preparare il campione all'acquisizione, aggiungere innanzitutto l'anticorpo monoclonale sperimentale appropriato coniugato perline di cattura ad un rapporto 1:1:1, in un tubo di micro centrifuga e vortice il pool di perline di cattura risultante. Successivamente, aggiungere il volume appropriato del campione a 1 microliter di pool di perline di cattura per generare un 1 per 10 alle 8 particelle più 1,2 per 10 al 5 ° perline per concentrazione di prova. Aggiungere 1 microlitro di perline a un tubo etichettato perline come controllo negativo e regolare il volume in ogni tubo a 100 microlitri con PBS fresco.

Quindi posizionare i tubi in un termo miscelatore, con scuotimento, a 400 rotazioni al minuto e da 4 a 10 Celsius, durante la notte. Il giorno successivo, trasferire i campioni su un fondo rotondo di 96 piastra del pozzo e aggiungere gli anticorpi coniugati a florescence appropriati ad ogni pozzo. Dopo un'incubazione di 1 ora a 4-10 gradi Celsius, aggiungere 100 microlitri di PBS a ogni pozzo e aprire il software di acquisizione.

Selezionare il citometro e il programma di avvio del sistema, per avviare lo strumento e aprire un nuovo esperimento. Creare un modello sperimentale e selezionare la piastra e aggiungere la piastra. Selezionare la posizione dei campioni sulla piastra e fare clic anche sul set come campione.

Immettere il nome di esempio nelle regole di denominazione, aprire la scheda canale e selezionare i canali di segnale di florescence appropriati. Ora carica la piastra nello strumento. Quindi fate clic su traccia punto (Dot Plot), per creare una nuova area di dispersione in avanti rispetto al tracciato punto dell'area di dispersione laterale.

Selezionare initialize per avviare il laser e la fluidica e fare clic su Esegui per avviare l'acquisizione. Regolare la scala per mostrare la popolazione al centro del grafico a dispersione anteriore rispetto a quello laterale e disegnare un cancello di perline intorno all'intera popolazione campione per escludere i detriti. Fate clic su interrompi (stop and dot plot) per creare un'altezza di dispersione in avanti rispetto al tracciato punto dell'area di dispersione in avanti e aprite il campione sulla popolazione di perline.

Disegna un nuovo cancello intorno alla popolazione più grande e denominalo Singlets e fai clic sul grafico dei punti per creare un segnale fluorescente rispetto al grafico a punti dell'area di dispersione laterale, per fluoroforo sperimentale utilizzato. Porta il nuovo grafico a punti sui Singlets. Selezionare quindi il numero di eventi da registrare e selezionare il record per avviare l'acquisizione sperimentale.

Al termine dell'analisi, caricare i file di acquisizione nel software di analisi appropriato e aprire un nuovo protocollo. Create tracciati di punti per ogni file come appena dimostrato, impostate tutto l'asse di dispersione su scala lineare e tutto l'asse florescente per registrare la scala. Quindi mostra la media geometrica della florescence nei canali dei segnali rilevanti, per calcolare il cambiamento completo nell'intensità media della florescence, nei diversi preparati vescicolari extracellulari.

Dopo aver testato diverse condizioni per impostare la più piccola quantità totale di vescicole extracellulari per raggiungere la fase esponenziale iniziale di una curva di intensità di florescence media, il numero minimo di particelle è stato determinato essere 1 per 10 alle 8 particelle relative alla colorazione. La concentrazione ottimale di anticorpi per 1 per 10 contro le 8 particelle per ottenere il segnale più alto senza legame anticorpale non specifico, è stata determinata in 10 microgrammi per millilitro sia per gli anticorpi anti CD9_FITC che anti CD63_PE e cinque microgrammi per millilitro per l'anticorpo anti CD81_PE. Per confermare l'idoneità del metodo, per l'analisi delle vescicole extracellulari a forma di tazza, e non dei detriti della membrana, le vescicole extracellulari sono state sonicate, con conseguente diminuzione dell'intensità media della florescence, dopo appena 30 secondi di sonicazione, senza alcuna florescence rilevata dopo un minuto di interruzione meccanica.

La purificazione di X dalle cellule progenitrici cardiache come dimostrato, produce vescicole extracellulari, esprimendo bassi livelli di CD9 e alti livelli di CD63 e CD81 da entrambe le popolazioni cellulari. Inoltre, mentre i marcatori superficiali di X sono chiaramente identificabili senza ultracentrifugazione, questo passo di arricchimento migliora notevolmente l'intensità media di florescence di questi marcatori. Quando si lavora con vescicole extracellulari, ci sono più pellet di nano particelle incuranti che possono essere facilmente persi.

Pertanto, è essenziale seguire tutti i step come dimostrato nel protocollo. L'uso di vescicole extracellulari come biomarcatore è ora una delle ricerche sul campo più emergenti. E presto, potrebbe essere tradotto nella diagnostica clinica utilizzata come strumento di screening alternativo.