Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Questo protocollo descrive uno schermo soppressore semplice ed efficace per identificare le mutazioni soppressori nei mutanti che hanno un difetto di crescita nel lievito di fissione. I metodi tradizionali di mutagenesi utilizzano sostanze chimiche tossiche o UV che possono generare mutazioni multiple in una cellula. Al contrario, questo protocollo può arricchire un singolo mutante soppressore nelle singole cellule senza utilizzare metodi di induzione di mutazioni.

Iniziare questa procedura con la costruzione e la preparazione della deformazione come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 200 microlitri di mezzi liquidi a ciascun pozzo di una micropiatta di polistirolo a 96 porsi. Con un applicatore sterile, prendere una piccola quantità di ciascuna delle colonie preparate e sospendere ogni colonia in singoli pozzi che contengono il supporto liquido.

Includere un pozzo vuoto per ogni riga sulla piastra contenente 200 microlitri dello stesso supporto. Ora imposta il protocollo sul software di rilevamento del lettore di lastre collegato a un lettore di micropiastrine automatizzato. Impostare la temperatura a 30 gradi Celsius e impostare un programma cinetico per 24 ore con frequenza di lettura di due minuti.

Ciò si traduce in 721 letture totali in un periodo di 24 ore per pozzo. Impostare lo scuotimento a continui scuotimenti orbitali veloci. Impostare le letture ottiche per misurare la dispersione della luce a una lunghezza d'onda di 600 nanometri per misurare la densità ottica e impostare la luce da leggere dal basso della piastra.

Dopo 24 ore, registrare le letture finali della densità ottica vuota e utilizzare la formula nel protocollo di testo per determinare il volume necessario per diluire ciascuno dei campioni fino a una densità ottica di 0,1. Per elaborare in batch il volume di diluizione da utilizzare da ogni pozzo sperimentale, esportare i dati dal software lettore di lastre e utilizzare un software per fogli di calcolo per inserire la stessa formula di una funzione. Ogni 24 ore, utilizzare lo stesso supporto del giorno zero per diluire ciascuno dei campioni a una densità ottica di 0,1 usando la formula.

Assicurarsi di utilizzare la formula per diluire tutti i pozzi fino a una densità ottica di 0,1. Ciò include i pozzi che potrebbero aver iniziato a mostrare una certa ripresa nel loro difetto di crescita. Salva tutte le curve di crescita generate giornalmente.

Si noti ogni singola colonia che mostra un aumento del tasso di crescita giudicato da una densità ottica finale che è significativamente superiore al resto della coorte con lo stesso sfondo genetico o da una curva di crescita simile a quella delle colonie di tipo selvatico. Questo saggio di solito richiede da sette a 14 giorni. Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili.

Dall'ultimo giorno del saggio del lettore di lastre, alcune colture liquide hanno un tasso di crescita notevolmente recuperato presumibilmente ottenendo una mutazione soppressore che può alleviare il fenotipo della mutazione parentale. Per conservare le colture fenotipicamente recuperate, trasferire e mescolare 250 microlitri di coltura liquida su un criotubo contenente 250 microlitri di glicerolo al 50%. Flash congela le cellule in azoto liquido e salva i ceppi in meno 80 gradi Celsius indefinitamente.

Per confermare che la mutazione del soppressore è un elemento geneticamente ereditabile, usa metodi di incrocio genetico standard per attraversare le tue cellule P mutanti preferite con le tue cellule S mutanti preferite. Quando due cellule aploidi con un tipo di accoppiamento gratuito vengono mescolate e sottoposte a fame di azoto, possono generare uno zigote che sporula per formare un tetrado di quattro spore. I materiali genetici parentali si segregano durante la meiosi seguendo le regole della genetica mendeliana.

Dopo la sporulazione, le singole spore degli stessi tetradi possono essere sezionate e formare quattro singole colonie osservate verticalmente su una piastra. Posizionare uniformemente le spore una per una sulla piastra usando un microneedle. Dopo la dissezione, lasciare che le cellule crescano in un'incubatrice di 30 gradi Celsius per alcuni giorni fino a quando non compaiono le colonie.

Se la mutazione del soppressore è un elemento geneticamente eviabile, questa croce dovrebbe produrre tetradi in cui due colonie hanno il fenotipo di malattia del ceppo parentale e due colonie hanno il tasso di crescita di recupero del ceppo soppressore. Scegli tre colonie con il fenotipo soppressore e tre colonie con il fenotipo parentale dalla stessa croce genetica e procedi con i passaggi di estrazione e sequenziamento del DNA genomico come descritto nel protocollo di testo. Quindi eseguire analisi bioinformatiche per l'identificazione delle mutazioni soppressori come descritto nel testo.

Le curve di crescita delle singole colonie sono state registrate nel momento iniziale e per sei giorni con monitoraggio continuo utilizzando il lettore di piastre. Come previsto, le colonie di tipo selvaggio non mostrano cambiamenti evidenti nelle loro curve di crescita durante l'esperimento. In particolare, quattro colonie con lo sfondo di cancellazione di elf1 e una colonia di cancellazione fal1 mostrano un drammatico cambiamento nella crescita dalla crescita lenta ad alcuni livelli variabili di crescita simili a quelli delle colonie di tipo selvaggio.

Drammaticamente, tutti i mutanti clr6 mostrano un recupero fenotipico coerente che cresce a un ritmo più veloce entro la fine del test. Due dei cambiamenti non sinonimi identificati, la mutazione cue2 e la mutazione rpl2702 sono stati ricostruiti in laboratorio utilizzando protocolli standard per la mutagenesi diretta dal sito. I doppi mutanti Cue2 elf1 e i doppi mutanti rpl2702 elf1 sono stati incrociati con il ceppo mutante di eliminazione elf1 gratuito.

L'incrocio genetico ha dimostrato che le mutazioni soppressori identificate sono efficaci nel sopprimere il fenotipo a crescita lenta del mutante di eliminazione elf1 e sono ereditabili. Durante la diluizione giornaliera della piastra da 96 po ', è importante diluire tutti i pozzi alla stessa concentrazione al fine di evitare il recupero artificiale della crescita. Questo metodo consente l'isolamento delle mutazioni del soppressore in modo ad alta produttività accelerando la scoperta di centinaia di geni che non sono stati ben caratterizzati nel lievito di fissione e in altri microrganismi.

Questo metodo può essere utilizzato per isolare i soppressori per tutti i microrganismi che hanno mutazioni che causano difetti di crescita e che possono essere coltivati a una grande popolazione in coltura liquida. Identificare le mutazioni soppressori nel lievito di fissione potrebbe avere potenziali implicazioni nel trovare geni che causano malattie in percorsi sovrapposti, specialmente quando si tratta di vie altamente conservate dal lievito all'uomo.