Name: Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Impara a isolare vescicole extracellulari da tessuti interi con elevata purezza. Questo metodo consente la caratterizzazione morfologica e immunofenotipica di vescicole interstiziali, applicabile a campioni tumorali cerebrali e polmonari.

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Gli autori ringraziano il Dr. Richard Nowakowski e la Florida State University laboratorio animale risorse per fornire e la cura per gli animali utilizzati per sviluppare questo protocollo, rispettosamente. Ringraziamo Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e il Florida State University traslazionale Science Laboratory per assistenza con il lavoro di spettrometria di massa utilizzato per la caratterizzazione della vescicola a valle, come pure del fondo per la FSU biologico Scienza Imaging Resource l'utilizzo del microscopio elettronico trasmissione in questo studio. Infine, ringraziamo il dottor Mandip Sachdeva (Florida A & M University) per la donazione degli esemplari del tumore utilizzato nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca di la Florida reparto di salute Ed ed Ethel Moore Alzheimer malattia assegnato a d. G.M. e J.M.O (6AZ11) e il National Cancer Institute, del National Institutes of Health, premio numero R01CA204621 assegnato a d. G.M.

Tutto cervelli sono stati ottenuti con approvazione dall'uso animale istituzionale e cura Committee (IACUC) della Florida State University. Un totale di dodici cervelli di topo (3 cervelli da ogni gruppo d'età: 2, 4, 6 e 8 mesi) da un C57BL/6 J sfondo sono stati utilizzati per l'estrazione di EV, come descritto in precedenza16. Esemplari del tumore del polmone sono stati generosamente donati da Dr. Mandip Sachdeva sotto approvazione del Florida agricola e meccanica Università IACUC. Tumori del polmone sono stati derivati dalla linea cellulare umana dell'adenocarcinoma H1975 coltivato in immunodeficienti topi nudi di Balb/c nu/nu. Dati da due repliche rappresentativo del tumore sono evidenziati in questo studio.
Nota: Una descrizione schematica del metodo di isolamento e purificazione di vescicola è fornita nella Figura 1.
1. tessuto dissociazione e centrifugazione differenziale
<ol><li>Preparare 10 mL di tampone di dissociazione (10 mg di papaina; 5,5 mM L-cisteina; 67 µM 2-mercaptoetanolo; 1,1 mM EDTA) nel mezzo di sospensione-E a circa 0,4-1,0 g di tessuto. Si noti che tutte le soluzioni utilizzate per la purificazione e l'arricchimento di EV devono essere diluite in acqua ultrapura filtrata.</li>
	<li>Aggiungere tessuto intero fresco o congelato a buffer di dissociazione in una provetta conica da 50 mL e incubare in un acqua calda vasca a 37 ° C per 20 min. del tessuto può essere tagliato in frammenti più piccoli prima dell'incubazione, se necessario.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, aggiungere inibitori di proteasi e fosfatasi per una concentrazione finale di 1 x per il buffer di dissociazione che contiene il tessuto.</li>
	<li>Versare la soluzione contenente il tessuto in un omogeneizzatore lisata-morbida e delicatamente dissociare il tessuto utilizzando circa 30 colpi lenti per campione. Il numero di tratti può essere regolato in base alla consistenza del tessuto.</li>
	<li>Tessuto di trasferimento dissociato nel buffer di una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule e i rimanenti frammenti di tessuto fibroso o coesivi.</li>
	<li>Trasferire il surnatante di un tubo conico pulito da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g per 10 min a 4 ° C di pellet e scartare grandi detriti cellulari.</li>
	<li>Trasferire il surnatante nuovamente un tubo conico pulito da 50 mL e centrifugare a 10.000 x g per 40 min a 4 ° C a pellet indesiderate più grandi vescicole o corpi apoptotici piccolo. Nota: Questo pellet possono essere salvate per ulteriore studio delle vescicole più grande se lo si desidera.</li>
	<li>Decantare il supernatante attraverso un filtro a 0,45 µm in una provetta di ultracentrifugazione di mL 12 pulita. Nota: Campioni di tessuto densamente fibrotico non possono essere facilmente filtrati. Questi campioni possono essere filtrati attraverso un colino di cella 40 µm, quindi passavano in serie più piccoli aghi (18 G, 20 G, 22 G) prima di filtraggio attraverso il filtro da 0,45 µm.</li>
	<li>Ultracentrifuga il campione a 100.000 x g per 2 h a 4 ° C a pellet piccola EVs.</li>
	<li>Decantare il supernatante e lasciare i tubi di ultracentrifugazione invertiti per 5-10 min, toccando spesso per rimuovere il liquido residuo sui lati dei tubi. Liquido residuo può anche essere aspirato per mezzo di una pipetta sottovuoto ad aspirazione.</li>
	<li>Risospendere il pellet di EV in 1,5 mL di tampone di 0,25 M saccarosio (10 mM Tris, pH 7.4). È importante garantire completa risospensione del pellet in questo passaggio. A tale scopo, coprire le provette con parafilm prima Vortex EVs in soluzione. I tubi di ultracentrifuga per 15-20 minuti a temperatura ambiente prima di un mix di vortice finale della roccia.</li>
	<li>Centrifugare brevemente le provette a una velocità non superiore a 1.000 x g per recuperare la sospensione liquida nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Procedere con i passaggi di purificazione gradiente qui sotto, o se necessario, conservare EV sospensione a 4 ° C durante la notte.</li>
</ol>2. densità gradiente purificazione
<ol><li>Aggiungere 1,5 mL di iodixanol 60% (soluzione in acqua) nel buffer di saccarosio/Tris di 1,5 mL contenente EVs per creare una soluzione finale che contiene 30% iodixanol. Pipettare fino e giù più volte per mescolare la soluzione. Essere cauti per evitare di perdere la soluzione nella punta della pipetta, come la concentrazione di iodixanol alta è abbastanza viscosa.</li>
	<li>Trasferire la soluzione tampone di iodixanol 30% contenente EVs il fondo di una provetta di ultracentrifugazione 5,5 mL.</li>
	<li>Preparare almeno 1,5 mL di 20% e 10% soluzioni di iodixanol per campione in acqua ultrapura dalla soluzione madre di iodixanol di 60%.</li>
	<li>Misura 1,3 mL di iodixanol di 20% e con attenzione il livello sopra il livello di sfumatura di fondo utilizzando una siringa e un ago da 18 G. Per evitare gli strati all'interfaccia densità di miscelazione, la smussatura dell'ago a contatto con l'interno del tubo ultracentrifugazione appena sopra il menisco e aggiungere goccia a goccia la soluzione.</li>
	<li>Strato di 1,2 mL di soluzione di 10% iodixanol sopra lo strato di iodixanol 20% usando la stessa tecnica come sopra.</li>
	<li>Attentamente equilibrio e caricare i tubi ultracentrifugazione in bucket di rotore e della centrifuga in un rotore di swing-benna a 268.000 x g per 50 min a 4 ° C. Impostare la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga i tassi minimi ammessi per evitare perturbazioni degli strati di densità.</li>
	<li>Etichetta dieci provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni campione corrispondono a frazioni di 1 a 10 del gradiente di densità. Frazione 1 viene designato come la frazione più in alto che verrà prima rimosso, mentre la frazione 10 è la frazione di fondo Ultima rimossa.</li>
	<li>Una volta completata l'ultracentrifugazione di pendenza, delicatamente togliere le provette dal rotore secchi e posto in un supporto stabile. Una banda visibile delle vescicole spesso sarà visibili nella frazione di interesse. Pipettare seriale dieci frazioni di 490 µ l dalla parte superiore della sfumatura nelle provette corrispondenti. Ci sarà una piccola quantità di liquido restante nella parte inferiore del tubo che probabilmente contiene proteine contaminanti. Questo esempio può essere scartato, o mantenuto come frazione 11 Se si desidera.</li>
	<li>Misurare gli indici di rifrazione delle frazioni utilizzando un rifrattometro. Ciò può anche essere eseguito con una sfumatura di controllo eseguita in parallelo, se è necessaria la conservazione del campione. Pipettare 20-30 µ l di ciascuna frazione contenente iodixanol sulla superficie del rifrattometro e stimare la densità confrontando gli indici di rifrazione di iodixanol noto densità. Si noti che le frazioni possono essere memorizzate durante la notte nella soluzione contenente iodixanol se necessario prima di procedere al passaggio successivo per la lavaggio ultracentrifugazione.</li>
	<li>Trasferire ogni frazione in una provetta di ultracentrifugazione mL 12 pulita. Aggiungere 5 mL di tampone fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 2mm KH2PO4, pH 7.4): 1x tubo e mescolare pipettando lentamente su e giù. Nota: PBS aggiunto ai campioni deve essere priva di particelle, assicurata da PBS sterile che filtra attraverso un filtro da 0,22 µm e la conservazione a temperatura ambiente per evitare la precipitazione del sale.</li>
	<li>Aggiungere un ulteriore 6 mL di 1X PBS all'inizio e ancora una volta mescolate con cura.</li>
	<li>Ultracentrifuga i tubi a 100.000 x g per 2 h a 4 ° C a ri-pellet piccole vescicole. Decantare il supernatante e toccare i tubi asciutte prima di lisi delle vescicole per l'analisi della proteina (passaggio 3) o risospensione di EVs per analisi morfologica (passo 5).</li>
</ol>3. Lisi e Immunoblot conferma delle proteine di EV
Nota: Se la conservazione delle vescicole tutta per la caratterizzazione morfologica o attività biologica è voluta, i ricercatori possono procedere direttamente al passo 5. Negli esperimenti iniziali, o prima dell'analisi di spettrometria di massa, dovrebbero essere analizzate tutte le frazioni recuperate da immunoblot per confermare le frazioni con proteine di EV.
<ol><li>Per lisare EVs per l'analisi della proteina, aggiungere 40 µ l di tampone di lisi forte (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% 2-mercaptoetanolo, urea 8 M) con l'aggiunta dell'inibitore di proteasi a pellet EV in tubo ultracentrifuga. Nota: Se le condizioni non riducenti sono desiderate per il rilevamento di anticorpi delle proteine, sostituire acqua ultrapura per 2-mercaptoetanolo nel buffer di lisi forte.</li>
	<li>Garantire la completa risospensione del pellet e lisi del SVE nel buffer mettendo parafilm sopra l'ultracentrifugazione tubo Vortex vigorosamente, poi a dondolo per 20 min a temperatura ambiente prima di un vortice finale.</li>
	<li>Centrifugare brevemente a 1.000 x g per 30-60 s recuperare il volume del campione intero. Trasferire il campione di un nuovo microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione.</li>
	<li>Per preparare lisati purificato per l'analisi di immunoblot, aggiungere 5 x Laemmli tampone (10% SDS, 250 mM Tris-HCl pH 6.8, 1 mg/mL di bromofenolo, 0,5 M DTT, glicerolo al 50%, 5% 2-mercaptoetanolo) ai campioni per una concentrazione finale di 1 x. Nota: Se le condizioni non riducenti sono desiderate, è possibile sostituire il DTT e 2-mercaptoetanolo con acqua ultrapura.</li>
	<li>Se intero tessuto omogeneato controlli sono desiderati, lisare il tessuto nell'urea-che contiene forte buffer di lisi dettagliata sopra con l'inibitore della proteasi, poi Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a scartare i rimanenti della matrice extracellulare, le cellule intere, o detriti cellulari intatti. Aggiungere 5 x Laemmli tampone omogeneato del tessuto per una concentrazione finale di 1 x.</li>
	<li>Far bollire la sample buffer contenente campioni di omogenato EV o tessuto a 95 ° C per 5-10 minuti, quindi uguale volume di carico (dall'equivalente di 0,1-0,3 g di tessuto materiale di partenza; 1-2 µ g di proteina purificata EV) delle frazioni 1-10 in un gel di SDS-PAGE 10%. Carico uguale massa dell'omogeneato del tessuto. Maggiore volume dei campioni può essere necessaria per il rilevamento di anticorpi meno sensibili.</li>
	<li>Procedere con elettroforesi e Western blot analisi come precedentemente dettagliate21 per confermare proteine di EV nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di EV in frazioni. Nota: Una volta EV proteina è stata dimostrata in modo riproducibile in frazioni coerente, il lavaggio finale ultracentrifugazione descritto nel passo 2.12 può essere limitato a gradiente frazioni di interesse.</li>
</ol>4. quantificazione della proteina EV
<ol><li>Utilizzare un'analisi di fluorescenza-basata di detersivo e urea compatibili se sensibili quantificazione delle proteine di EV è desiderato per ulteriori analisi (Vedi Tabella materiali). Si noti che alcune analisi di fluorescenza-based sono compatibili con il blu di bromofenolo presente nel buffer del campione di Laemmli, facilitando lisi diretta del pellet EV (a passo 2.12) in questo buffer, se si preferisce.</li>
	<li>Se viene utilizzato il kit di quantificazione della suddetta proteina basata a fluorescenza, spot 1 µ l di campione o standard in almeno duplicare della carta da filtro fornita e continuare quantificazione di proteine secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>5. caratterizzazione della morfologia di EV
<ol><li>Per esaminare tutta vescicole dopo la centrifugazione finale lavare in passo 2.12, accuratamente risospendere EV pellet in PBS 1X priva di particelle. Archivio EVs a 4 ° C per non più di una settimana fino al procedimento per evitare cicli di gelo-disgelo. Nota: È utile in precedenza hanno confermato le frazioni contenenti costantemente arricchito EV proteina dall'analisi del immunoblot per limitare l'analisi morfologiche alle frazioni di interesse.</li>
	<li>Eseguire nanoparticella analisi di rilevamento su intero EV campioni per determinare la concentrazione e le dimensioni delle vescicole nelle preparazioni, come precedentemente dettagliate22.</li>
	<li>Caratterizzare la morfologia EV e confermare le misure da microscopia elettronica delle vescicole, se lo si desidera. Griglie di EM possono essere preparati da sospensioni di vescicola seguendo passo 5.123, o in alternativa possono essere elaborate come blocco preparati24 da pellet seguendo passo 2.12.</li>
</ol>6.-gel di purificazione e digestione della tripsina per analisi di spettrometria di massa
<ol><li>Se si desidera la caratterizzazione dei proteomi EV mediante spettrometria di massa, carico uguale massa (almeno 10 µ g di proteina) di frazioni contenenti SVE in un prefabbricato gel di poliacrilammide per separare e purificare proteine. Gel pre-cast forniti dal produttore sono preferiti per ridurre i livelli di potenziale contaminazione proteine (ad es., cheratina) introdotti nei campioni.</li>
	<li>Eseguire l'esempio almeno 0,5 pollici in gel di poliacrilammide per purificazione della proteina, quindi difficoltà e macchia con colorante Coomassie, come precedentemente descritto in dettaglio25.</li>
	<li>Tagliare le corsie a 1 mm3 cubi per la digestione della tripsina, come in precedenza dettagliate19,26.</li>
	<li>Caricare 5 µ l di campione digerito peptide in LC-MS/MS strumento per separazione sulla colonna analitica e successiva analisi mediante spettrometria di massa secondo i parametri specificati in dettaglio16.</li>
</ol>

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<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Interesse molto scientifico è stato generato per quanto riguarda i ruoli che piccoli EVs giocare nel microambiente tumorale, come pure in funzione, la maturazione e lo sviluppo dell'organo. Nel complesso, questo studio fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l'estrazione del SVE intatti da intero cervello o esemplari del tumore. Mentre qui abbiamo semplicemente dimostrare l'applicabilità di questa tecnica per EVs derivate da tumore del polmone, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per lavoro su altri te...

Piccole vescicole extracellulari (SVE) includono endosomal-derivato esosomi e microvescicole membrana-capannone piccolo di ampio interesse biomedico. Piccoli SVE sono composti da una popolazione eterogenea di vescicole di membrana-limitano nm 50-250 contenenti proteine biologicamente attive, i lipidi e gli acidi nucleici che collettivamente sono creduti per svolgere ruoli importanti in una moltitudine di processi di malattia. Progresso della ricerca è particolarmente implicata queste vescicole in neurodegenerative e malattie da prioni, processi infettivi, condizioni infiammatorie o autoimmuni e la crescita del tumore e metastasi1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ricerca biomedica in rapida crescita del significato di EVs nella patogenesi della malattia ha generato interesse parallela allo sviluppo di metodi riproducibili e rigorosi per l'isolamento e la purificazione di queste vescicole.
Una sfida storica e attuale nella caratterizzazione di EV è stata l'incapacità di separare completamente piccola EV sottopopolazioni. Questa sfida è in gran parte a causa della nostra comprensione limitata dei differenti meccanismi molecolari che regolano la biogenesi delle vescicole distinte. Sovrapposizione di dimensioni, densità e carico biologico tra sottopopolazioni ulteriormente spire queste distinzioni. Parte di questa sfida è stato anche l'uso di diverse tecniche di arricchimento, fornendo un'incoerenza in analisi a valle delle vescicole isolate attraverso laboratori e minare lo sforzo globale per illuminare categorico EV popolazioni ampiamente.
Vale la pena notare che la maggior parte della caratterizzazione EV è stata eseguita da collezione in vitro della coltura delle cellule surnatante, con studi in vivo più recenti che descrivono le tecniche per isolare le vescicole da fluidi corpo umani o animale, tra cui plasma, urina e la saliva. Mentre SVE sono presenti in grandi quantità in circolazione, ha anche riconosciuto che queste vescicole svolgono un ruolo importante negli eventi di comunicazione cellula-cellula e sono presenti nell'interstizio dei tessuti cellulari. Nel contesto di cancro, EVs interstiziale può essere particolarmente importante nella modulazione del microambiente tumorale per la semina delle cellule di cancro e crescita metastatica14,15. Di conseguenza, non c'è valore nello sviluppo e nell'ottimizzazione delle tecniche per estrarre le vescicole da campioni di tessuto solido. Questi metodi fornirà un mezzo per studiare direttamente organo - o tumore - derivato EVs raccolti da campioni clinici, tra cui piccole biopsie e resezioni organo parziale o completo.
In questo studio e in un precedente rapporto pubblicato dal nostro laboratorio16, intendiamo affrontare parecchie preoccupazioni attuali principali nella metodologia di arricchimento EV: 1) per descrivere una tecnica riproducibile per isolare e purificare EVs ai più alti standard attualmente accettato nel campo; 2) per tentare di isolare piccole sottopopolazioni EV altamente arricchite in endosomal-derivato esosomi; e 3) per fornire un protocollo per l'estrazione di queste vescicole da campioni di tessuto solido ai fini di ulteriore caratterizzazione.
Recentemente, Kowal e colleghi descritti una pendenza di densità relativamente piccoli iodixanol per separare e purificare le sottopopolazioni di EV con maggiore efficacia rispetto paragonabile saccarosio densità gradienti17. Nello studio citato, EVs di derivati da cellule dendritiche catturato in una frazione di densità relativamente leggera, coerenza con una densità di 1,1 g/mL, altamente sono stati arricchiti in proteine endosomal credute di essere più coerente con una proporzione elevata degli esosomi presenti in questo frazione. Secondo gli autori, queste proteine "bona fide" exosomal includevano gene di suscettibilità del tumore 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e diversi annessina proteine17. Più tardi abbiamo adattato questa tecnica per avere successo un metodo di dissociazione del tessuto descritto da Gonzalez Perez et al.18 e un protocollo di successiva centrifugazione differenziale per isolare l'intero cervello-derivato SVE16. Inoltre, abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo nella caratterizzazione dei proteomi EV combinando un protocollo sequenza per la spettrometria di massa a valle quantitativo e comparativo della proteina vescicolare, precedentemente descritta dal nostro laboratorio19. Questo lavoro era equivalente a quello del laboratorio di Hill, in cui SVE sono state arricchite dalla corteccia frontale del cervello20.
In questo studio, abbiamo elaborato su questa tecnica ed estendere l'applicazione del protocollo recentemente pubblicato dal nostro laboratorio all'isolamento del SVE da tumori solidi del polmone. A nostra conoscenza, questo è il primo studio per descrivere un protocollo per arricchire SVE da ex vivo esemplari del tumore. Visto il diffuso interesse verso EVs come nuovi biomarcatori diagnostici e il loro ruolo nella tumorigenesi, questo metodo probabilmente si rivelerà prezioso per un numero crescente di ricercatori scientifici. Da un punto di vista clinico, EVs interstiziale potrebbe porto grande valore diagnostico, in particolare negli esemplari dove la valutazione istologica è limitata. La nostra speranza è che il metodo descritto qui fornirà un fondamento per una tecnica riproducibile raccogliere EVs in freschi o surgelati umani o animali esemplari chirurgici, spianando la strada per il lavoro futuro scoprire i ruoli significativi nella patogenesi della malattia questi piccoli le vescicole possono giocare.

<table><tbody><tr><td>0,45 & micro; m filter</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga da 12 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>provette per ultracentrifuga da 5,5 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Alix</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7129</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Calnexina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11397</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD63</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD81</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9158</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Flotillin 2 Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-25507</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo HSC70</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7298</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Syntenin-1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100336</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-TSG101 Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-7964</td><td></td></tr><tr><td>EZQ kit di quantificazione di proteine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-6-30 rotore&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5820715006</td><td></td></tr><tr><td>FEI CM120 Microscopio elettronico</td><td>TSS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio capra anti-coniglio IgG (frammento Fab)</td><td>Genetex</td><td>27171</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della fosfatasi HALT (soluzione 100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi HALT (soluzione 100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>Ibernazione E media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 rotore a secchiello oscillante</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Ultracentrifuga da banco</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-100 ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>60% di iodixanolo in soluzione di acqua sterile</td></tr><tr><td>Q Spettrometro di massa HF esattivo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coniglio anti-capra</td><td>IgG Genetex</td><td>26741</td><td></td></tr><tr><td>coniglio anti-topo IgG</td><td>Genetex</td><td>26728</td><td></td></tr><tr><td>Refracto 30PX (rifrattometro)</td><td>Mettler Toledo</td><td>51324650</td><td></td></tr><tr><td>S-4-104 rotore</td><td>Eppendorf</td><td>5820759003</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti a secchio oscillante Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Circolante e interstiziale piccole membrana-limita (SVE) vescicole di extracellulare rappresentano un bersaglio promettente per lo sviluppo di saggi di nuovo biomarcatore diagnostico o prognostico e probabilmente servono come giocatori importanti nella progressione di un vasto spettro di malattie. Ricerca corrente è focalizzata sulla caratterizzazione delle vescicole secernuta da cellule multiple e tipi di tessuto al fine di meglio comprendere il ruolo di EVs nella patogenesi di condizioni tra cui neurodegenerazione, infiammazione e cancro. Tuttavia, globalmente coerenti e riproducibili tecniche per isolare e purificare le vescicole rimangono in corso. Inoltre, a malapena vengono descritti metodi per l'estrazione del SVE da tessuto solido ex vivo . Qui, forniamo un protocollo dettagliato per estrarre piccoli EVs di interesse dai tessuti intero freschi o congelati, compreso i campioni del cervello e del tumore, per ulteriore caratterizzazione. Dimostriamo l'adattabilità di questo metodo per analisi multiple a valle, tra cui la microscopia elettronica e immunophenotypic caratterizzazione delle vescicole, così come la spettrometria di massa quantitativa delle proteine di EV.

Nella Figura 1viene visualizzata una descrizione schematica della dissociazione del tessuto, centrifugazione differenziale e gradienti purificazione delle vescicole. Conferma della morfologica e immunophenotypic del gradiente-purificato sve è evidenziata nella Figura 2. Un diagramma di densità riproducibile dopo ultracentrifugazione di pendenza di iodixanol il 10-30% viene mostrato, con due popolazioni distinte della vescicola la...

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Questo protocollo fornisce una tecnica rigorosa e riproducibile per l'estrazione e l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da campioni di tessuto intero per analisi ex-vivo a valle. Con tra i più alti livelli di purezza attualmente raggiungibili, questo metodo facilita la caratterizzazione morfologica diretta, immunofenotipica e profonda delle vescicole interstiziali secrete in vari campioni di tessuto, compresi i tumori. Qui, dimostriamo l'isolamento dei veicoli elettrici tissutali dagli esemplari di tumore al cervello e ai polmoni.Tuttavia, questa tecnica può essere applicata anche a studi che utilizzano diversi, benigni o altri campioni di tumore. Per iniziare, preparare 10 millilitri di tampone di dissociazione nel mezzo Hibernate-E per ogni 0,4-1,0 grammi di tessuto. Aggiungere il tessuto intero fresco o congelato al tampone in un tubo da 50 millilitri e incubare in un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Dopo questo, aggiungere proteasi e inibitori della fosfatasi per una concentrazione finale di 1x nel tampone di dissociazione. Versare la soluzione con il tessuto in un omogeneizzatore di fit down sciolti. Utilizzare circa 30 colpi lenti per campione per dissociare delicatamente il tessuto.Quindi, trasferire il tessuto dissociato e la soluzione tampone in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifuga a 500x g e a quattro gradi celsius per cinque minuti per pellettare le cellule e le fibre rimanenti o frammenti di tessuto coesivi. Trasferire il supernatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e centrifugare a 2.000x g e a quattro gradi celsius per 10 minuti per pellet e scartare i grandi detriti cellulari.Trasferire questo supernatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e centrifugare a 10,000x g e a quattro gradi celsius per 40 minuti per pellettare eventuali vescicole più grandi indesiderate o piccoli corpi apoptotici. Decantare il supernatante attraverso un filtro da 0,45 micrometri in un tubo di ultracentrifugazione pulito da 12 millilitri. Successivamente, ultracentrifugare il campione a 100,000x g e a quattro gradi celsius per due ore, per pellet piccoli veicoli elettrici.Decantare il supernatante e lasciare i tubi di ultracentrifugazione invertiti per cinque-10 minuti, toccando frequentemente per rimuovere qualsiasi liquido residuo ai lati dei tubi. Quindi, resostigliere il pellet EV in 1,5 millilitri di tampone di saccarosio molare 0,25. Coprire i tubi con Parafilm, quindi vortice i veicoli elettrici in soluzione.Dondolare i tubi ultracentrifugo per 10-15 minuti a temperatura ambiente. E poi il vortice ancora una volta. Centrifugare brevemente i tubi a una velocità inferiore a 1.000x g per recuperare la sospensione liquida nella parte inferiore del tubo.Se necessario, conservare la sospensione a quattro gradi Celsius durante la notte. In primo luogo, aggiungere 1,5 millilitri di iodixanolo al 60%iodixanolo agli 1,5 millilitri del tris tampone di saccarosio che contiene i veicoli elettrici per creare una soluzione finale contenente il 30%iodixanolo. Pipetta su e giù più volte per mescolare accuratamente la soluzione.Trasferire questa soluzione sul fondo di un tubo di ultracentrifugazione da 5,5 millilitri. Quindi, mescolare lo stock di iodixanolo al 60% con acqua ultra pura per preparare almeno 1,5 millilitri sia di una soluzione del 20% che di uno iodixanolo al 10%. Utilizzando una siringa e un ago calibro 18, misurare 1,3 millilitri della soluzione di iodixanolo al 20% e stratificarlo con cura sopra il gradiente inferiore.Tenere la smussatura dell'ago a contatto con l'interno del tubo, appena sopra il menisco e aggiungere la soluzione per evitare di mescolare gli strati all'interfaccia di densità. Quindi, strato 1,2 millilitri della soluzione di iodixanolo al 10% sopra lo strato del 20%, utilizzando la stessa tecnica. Bilanciare e caricare con cura i tubi di ultracentrifugazione in benne del rotore.Impostare le velocità di accelerazione e decelerazione di un rotore a benna oscillante alle velocità minime e centrifugare a 268,000x g e a quattro gradi celsius per 50 minuti. Durante la centrifugazione del campione, etichettare 10 tubi di microcentrifugo da 10 1,5 millilitri per ogni campione che corrisponderanno con frazioni da uno a 10 del gradiente di densità. Una volta completata la centrifugazione, rimuovere delicatamente i tubi dalle benne del rotore e posizionarli in un supporto stabile.Pipetta 10 frazioni seriali di 490 microlitri dalla parte superiore del gradiente nei tubi corrispondenti. Utilizzando un rifrattametro, misurare gli indici di rifrazione delle frazioni. Quindi, trasferire ogni frazione in un tubo di ultracentrifugazione pulito da 12 millilitri.Aggiungere cinque millilitri di 1x PBS a ciascun tubo e pipetta su e giù lentamente per mescolare. Aggiungere altri sei millilitri di 1x PBS alla parte superiore del tubo e mescolare accuratamente di nuovo. Ultracentrifugare i tubi a 100.000x g e a quattro gradi celsius per ri-pellettizzare le piccole vescicole.Decantare il supernatante e toccare i tubi asciutti prima di leccare le vescicole per l'analisi proteica o di rimescolare i veicoli elettrici per l'analisi morfologica. Per lisciviare i veicoli elettrici per l'analisi proteica, aggiungere 40 microlitri di tampone di lisi forte contenente inibitore della proteasi ai pellet EV. Posizionare Parafilm su ogni tubo e vortice vigorosamente.Successivamente, dondolare di nuovo i tubi per 20 minuti a temperatura ambiente e vortice. Centrifugare brevemente il campione a 1.000x g per 30-60 secondi per recuperare l'intero volume del campione. Trasferire ogni campione in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e conservarlo a una temperatura compresa tra 20 e 80 gradi celsius fino a quando non è pronto per un'ulteriore lavorazione.Per preparare i lysati purificati per l'analisi immunoblot, aggiungere 5x Tampone campione di Laemmli ai campioni per una concentrazione finale di 1x. Far bollire il campione a 95 gradi celsius per cinque-10 minuti. Quindi, caricare un volume uguale di frazioni da una a 10 in un gel di pagina 10%SDS.Caricare una massa uguale di omogeneato tissutale. Eseguire l'elettroforesi e l'analisi western della macchia per confermare le proteine EV nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di veicoli elettrici in frazioni. In questo studio, le vescicole extracellulari vengono estratte e purificate da tutto il tessuto.A seguito dell'ultracentrifugazione del gradiente di iodixanolo dal 10 al 30%, si può vedere una popolazione di veicoli elettrici leggeri migrare fino alla frazione due, mentre una popolazione di veicoli elettrici densi può essere vista migrare fino alla frazione cinque, a seconda del tipo di tessuto. Le immunoblot rappresentative delle frazioni gradienti mostrano l'efficiente separazione e purificazione dei piccoli veicoli elettrici derivati dal tumore nella frazione cinque. In particolare, i campioni di tumore al polmone appaiono arricchiti in veicoli elettrici densi rispetto ai veicoli elettrici leggeri precedentemente raccolti da tutto il tessuto cerebrale.L'analisi rappresentativa del tracciamento delle nanoparticelle e la microscopia elettronica delle vescicole derivate dai tessuti nella frazione predominante contenente vescicole dimostrano l'arricchimento e la conservazione di intere vescicole. Coerentemente con le dimensioni e la struttura note dei piccoli veicoli elettrici. I veicoli elettrici interstiziali rappresentano obiettivi promettenti per lo sviluppo di nuovi test diagnostici o prognostici sul biomarcatore.Questa tecnica fornisce ai ricercatori strumenti per l'estrazione e la purificazione delle vescicole per l'utilità a valle. A seguito dell'estrazione di veicoli elettrici a tessuto intero o lysed, può essere eseguita un'ampia caratterizzazione di vescicole, comprese analisi proteomiche, genomiche e lipidomiche. Inoltre, i campioni possono essere utilizzati per approcci più mirati.Le vescicole isolate direttamente dai campioni di tessuto possono fornire ulteriori informazioni sui meccanismi della malattia, compresa la genesi del tumore, e possono fornire importanti strumenti diagnostici o prognostici in futuro.

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Ricerca sul cancro

Questo video descrive la tecnica di estrazione di vescicole extracellulari da tessuti freschi o congelati. Le vescicole extracellulari isolate possono essere utilizzate per ulteriori analisi per scoprire il loro ruolo significativo nella patogenesi della malattia.

Estrazione di vescicole extracellulari: una tecnica per isolare le vescicole extracellulari da campioni di tessuto intero utilizzando la centrifugazione differenziale

Questo video dimostra il metodo di purificazione basato sull'ultracentrifugazione a gradiente di densità per isolare sottopopolazioni di vescicole extracellulari adatte per studi di caratterizzazione.

Purificazione di sottopopolazioni di vescicole extracellulari: una tecnica per purificare sottopopolazioni di vescicole extracellulari mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità

Questo è un protocollo per isolare le vesciche extracellulari del tessuto (EV) dal fegato. Il protocollo descrive un processo in due fasi che coinvolge la perfusione di collagenasi seguito da ultracentrifugazione differenziale per isolare gli EV del tessuto epatico.

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

Il protocollo qui dimostra che le vescicole extracellulari possono essere adeguatamente separate dai terreni di coltura cellulare condizionati utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Cromatografia ad esclusione dimensionale per separare le vescicole extracellulari dai terreni di coltura cellulare condizionati

Il presente protocollo descrive un metodo per estrarre vescicole extracellulari dal sangue periferico e dai tessuti solidi con successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici.

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Il presente protocollo descrive la centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentative (esosomi e microvescicole) da MSC umane in coltura. Ulteriori applicazioni di questi veicoli elettrici sono spiegate anche in questo articolo.

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Qui descriviamo l'arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.

Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

Qui, presentiamo un protocollo per isolare esosomi derivati dalla milza di topo utilizzando una combinazione di digestione con collagenasi di tipo I e ultracentrifugazione.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo

Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.

Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni

Impara a isolare vescicole extracellulari da tessuti interi con elevata purezza. Questo metodo consente la caratterizzazione morfologica e immunofenotipica di vescicole interstiziali, applicabile a campioni tumorali cerebrali e polmonari.

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