Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l'acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.

Questa tecnica di preparazione del campione è progettata per combinare la migliore qualità di conservazione dell'ultrastruttura con il contrasto più adatto per la modalità di imaging in un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato. Questo protocollo è particolarmente utile per i campioni che richiedono la preparazione mediante congelamento ad alta pressione per una conservazione affidabile dell'ultrastruttura ma non ottengono abbastanza contrasto durante la sostituzione del congelamento per l'imaging del volume. Per un incorporamento minimo della resina è essenziale rimuovere quanta più resina possibile per consentire un corretto targeting in seguito nel microscopio elettronico a scansione del fascio ionico focalizzato.

Per iniziare, utilizzare la pipetta per gocciolare una goccia di 20%PVP PBS sul tappetino da taglio. Immergere il nervus tibialis sezionato nella goccioline. Utilizzare il bisturi per tagliare due millimetri di lunghezza del campione.

Utilizzare forcep fini per posizionare il campione in un portacampioni metallico di tipo A profondo 0,2 millimetri. Trasferire il supporto nella piastra centrale della cartuccia. Posizionare il supporto di tipo B rivestito con esadecano sulla parte superiore come coperchio.

Chiudere l'assieme abbassando la metà superiore della cartuccia. Chiudere la cartuccia a tre pezzi nella stazione di carico del congelatore ad alta pressione. Premere il pulsante di processo e procedere secondo le istruzioni operative del produttore.

In un bagno di azoto liquido, mettere i portatori di campioni in fiale crio contenenti due millilitri di acido tannico e acetone congelati allo 0,1% e chiudere i tappi. Posizionare le fiale criogeniche nell'unità di sostituzione del congelamento impostata a meno 90 gradi Celsius. Avviare il programma e conservare i campioni lì per 100 ore.

Nell'unità di sostituzione del congelamento, lavare i campioni con due millilitri di acetone tre volte per 30 minuti. Inserire il 2%di tetrossido di osmio nell'acetato di 0,1% di uranil nell'unità di sostituzione del congelamento per il raffreddamento e aggiungerlo ai campioni per una colorazione continua di sette ore a meno 90 gradi Celsius. Quando la temperatura del programma nell'unità di sostituzione del congelamento raggiunge meno 20 gradi Celsius, tieni i campioni lì dentro per altre 16 ore.

Quando la temperatura sale a 4 gradi Celsius, scartare il liquido nelle fiale e riempire l'acetone puro. Rimuovere le fiale criogeniche dall'unità di sostituzione del congelamento. La manipolazione del campione prima del congelamento e dopo l'osmoficazione è fondamentale poiché il campione può essere gravemente danneggiato.

In una cappa aspirante, utilizzare forcep fini per rimuovere i supporti metallici dalle fiale criogeniche e trasferire i campioni dai supporti per sommergirli in un piatto di vetro da orologio profondo 150 millimetri pieno di acetone. Utilizzare forcep fini per trasferire i campioni in due tubi di reazione millilitro riempiti di acetone. Impostare il microonde a 250 watt per 40 secondi e avviare il microonde per lavare i campioni e ripetere quattro volte.

Pipettare un millilitro di soluzione di tiocarboidrazide all'1% nel tubo di reazione e metterlo nel microonde. Accendere la funzione vuoto con due minuti di su e due minuti di riposo, iterando per un totale di 14 minuti e impostarla a 150 watt. Inizia il microonde.

Lavare il campione quattro volte in acetone come in precedenza. Pipetta un millilitro di soluzione di tetrossido di osmio al 2% nel tubo di reazione. Posizionare il campione nel microonde e utilizzare le stesse impostazioni del microonde del tiocarboidrazide.

Lavare il campione quattro volte in acetone come in precedenza. Pipetta un millilitro di 25% di resina in acetone nel tubo di reazione e metterlo nel microonde. Accendere la funzione di vuoto per tre minuti e impostarla a 250 watt.

Inizia il microonde. Utilizzare uno stuzzicadenti per rimuovere il nervus tibialis dal tubo di reazione e posizionarli su un pezzo di pellicola di plastica. Posizionare una lampada alogena vicino ai campioni per riscaldare la resina.

Utilizzando uno stuzzicadenti, spingere delicatamente il campione sulla pellicola di plastica fino a quando non viene rilevata alcuna resina rimanente. Mettere la pellicola di plastica con il campione sopra nel forno e impostare la temperatura a 60 gradi Celsius per polimerizzare i campioni per almeno 48 ore. Utilizzare una lama di rasoio per ritagliare i campioni polimerizzati insieme alla pellicola di plastica di dimensioni che si adattano allo stub SEM.

Utilizzare uno stuzzicadenti per aggiungere resina d'argento conduttiva sugli stub SEM e attaccarti i campioni tagliati. E poi aggiungere resina intorno ai campioni. Mettere gli stub SEM nel forno per polimerizzare a 60 gradi Celsius per almeno 4 ore o durante la notte.

Dopo la polimerizzazione, posizionare gli stub SEM in un rivestimento sputter. Impostare il rivestimento dello sputter a 35 milliampere e applicare un rivestimento o un cappotto in oro spesso 10 nanometri per un minuto. Dopo il rivestimento, posizionare gli stub SEM all'interno del microscopio elettronico a scansione del fascio ionico focalizzato.

In questo studio, è stato eseguito un protocollo migliorato per il nervus tibialis del mouse e c.elegans per illustrare la conservazione e il contrasto ottimali per eseguire l'imaging del volume 3D con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato. I protocolli standard spesso soffrono di una mancanza di contrasto della membrana in cui, poiché il protocollo avanzato fornisce un forte contrasto della membrana. Le immagini a sezione trasversale di C.elegans con protocollo avanzato e protocollo standard mostrano una differenza distintiva.

Così come per le immagini a sezione trasversale di nervus tibialis, il protocollo avanzato aiuta a mostrare un contrasto della membrana più forte rispetto al protocollo standard. Dopo la post-elaborazione, i dati del microscopio elettronico vengono visualizzati utilizzando IMOD, un programma di elaborazione e modellazione delle immagini. L'area evidenziata in blu mostra gli assoni segmentati.

L'area evidenziata in rosso mostra i bundle Remak. Le aree evidenziate dal giallo e dall'arancione mostrano suone di mielina. E l'area evidenziata dal turchese mostra i mitocondri.

La resliquiatura virtuale e il modello tridimensionale illustrano l'architettura dei tessuti fini e aiutano a comprenderne la funzione. Possono essere utilizzati anche altri metodi di microscopia elettronica a scansione di volume come la microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi e la tomografia array. Questo protocollo può anche essere utilizzato per la microscopia elettronica a trasmissione e altri tipi di campioni come campioni del sistema nervoso centrale.

Il tetrossido di osmio, il tiocarboidrozide e l'acetato di uranile sono sostanze chimiche tossiche e devono essere usati con attenzione. Anche la resina è dannosa e deve essere utilizzata con cura. I dispositivi di protezione individuale come guanti e camice da laboratorio devono essere indossati per il protocollo completo.