Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto
15 marzo 2019
Questo protocollo dimostra iniezione di un vettore virale retrogradely trasportabile nel tessuto del midollo spinale del ratto. Il vettore è preso alla sinapsi e trasportato al corpo cellulare dei neuroni bersaglio. Questo modello è adatto per l'analisi retrograda di importanti vie spinali o cellule targeting per applicazioni di terapia genica.
I vettori virali possono introdurre materiale genetico nelle cellule per compensare i geni difettosi, per regolare importanti proteine della crescita o per produrre marcatori in grado di tracciare i circuiti neurali. Introdurre vettori virali nel sistema nervoso è impegnativo a causa delle barriere biologiche innate. L'iniezione diretta nel tessuto del midollo spinale aggira queste barriere, consentendo l'accesso a corpi cellulari o sinapsi.
Indirizzare correttamente i livelli spinali da L1 a L4 può essere difficile. È importante utilizzare punti di riferimento per verificare il bersaglio e ricordare che questi segmenti si allineano alle vertebre da T11 a T13. Il giorno della procedura, collegare l'iniettore alla micropompa e posizionare la micro-pompa in un micromanipolatore con una scala vernier.
Utilizzare una siringa con un ago flessibile per caricare con cura una tintura colorata in uno degli aghi di vetro e inserire l'ago di vetro nell'iniettore. Quindi confermare che l'ago viene seminato correttamente nelle rondelle e che il cappuccio dell'iniettore è avvitato su stretto e che l'ago dell'iniettore in acciaio viene esteso circa tre quarti della lunghezza dell'ago di vetro. Prima di iniziare la procedura, scongelare almeno un microlitro, più un piccolo volume di virus extra per iniezione dalla conservazione del congelatore, e confermare la mancanza di risposta del pizzico in un ratto anestetizzato.
Radersi lungo la linea mediana dorsale dai fianchi all'angolo inferiore delle scapole dell'animale, tirando la pelle tesa per una rasatura più facile e precisa, e disinfettare la pelle esposta con 5%iodio sequenziale e 70% scrub di etanolo. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi. Quindi posizionare l'animale su un panno sterile e posizionare la garza sotto la vescica per raccogliere qualsiasi urina.
Per identificare il sito dell'incisione cutanea, premere delicatamente le dita all'ultima costola per localizzare la vertebra L1. Usando questa vertebra come punto di riferimento e tenendo la pelle tesa da una delicata diffusione mentre si preme saldamente con il bisturi, utilizzare una lama chirurgica numero 10 per fare un'incisione scuoiata da tre a quattro centimetri che termina appena inferiore a L1 per esporre il muscolo. Usa le forcep e le forbici per sentire i processi spinosi.
Fare piccoli tagli rostrali per lasciare spazio per afferrare saldamente su un processo superiore con forcende di denti a topo. E fare due lunghi tagli profondi il più vicino possibile ai processi. Dopo aver assicurato i muscoli laterale in posizione, cancellare il muscolo intorno ai processi per determinare la forma delle loro teste.
Quindi visualizzare le forme delle teste dei processi spinosi al fine di identificare il sito di laminectomia. I processi T11 e T12 e T13 di giunzione saranno il sito della laminectomia. Una volta che l'area bersaglio è stata correttamente identificata, stendere delicatamente le vertebre per rivelare i legamenti intervertebrali e utilizzare i rongeurs per prendere piccoli morsi dei processi spinosi e l'aspetto dorsale delle vertebre.
Rimuovere l'osso dalla linea mediana in modo che il vaso sanguigno della linea mediana possa essere osservato, lasciando una finestra che rivela chiaramente il tessuto del midollo spinale ed è privo di detriti. Quindi fissare le forcep stabilizzanti ai processi spinosi rostrali e caudali alla finestra della laminectomia per fissare l'animale in un supporto spinale. E sollevare l'addome dell'animale per negare l'effetto dei movimenti respiratori.
Per caricare il virus nell'iniettore, pipettare circa cinque microlitri del materiale scongelato su un pezzo di Parafilm e posizionare gli aghi di vetro in modo che la punta sia all'interno della goccia. Utilizzare la micropompa per prelevare fino a quattro microlitri di virus ad una velocità da 20 a 100 nanolitri al secondo e impostare il controller per iniettare prima di rilasciare una piccola quantità di virus dalla punta dell'ago per assicurarsi che non sia bloccato. Pulire qualsiasi virus in eccesso con una salvietta da laboratorio e posizionare i micromanipolatori in modo che la scala vernier sia visibile.
Posizionare l'ago sulla linea mediana del midollo spinale e utilizzare la scala vernier sul micromanipolatore per dirigere l'ago lateralmente di 0,8 millimetri. Quindi abbassare l'ago alla corda spinale fino a quando non sta rientrando, ma non forando, la dura, e utilizzare un rapido movimento di torsione per forare la dura con l'ago fino a quando la punta dell'ago non è affondata a una profondità di 1,5 millimetri. Una volta che l'ago è in posizione, programmare l'iniettore per consegnare il virus ad una velocità di 400 nanolitri al minuto e confermare che il virus sta entrando nella corda spinale osservando l'avanzamento del fronte del colorante.
Una volta terminata l'iniezione, lasciare riposare l'ago nel midollo spinale per due o cinque minuti per facilitare la diffusione del virus, prima di ritirare lentamente l'ago per il posizionamento nel sito di iniezione successivo. Dopo l'ultima iniezione, rimuovere l'animale dal supporto spinale per consentire la rimozione di tutti i dispositivi utilizzati per diffondere il muscolo laterale. Quindi chiudere il muscolo con una sutura di catgut cromato 4.0 e graffettare la pelle con clip ferite da nove millimetri.
Quattro settimane dopo un'iniezione riuscita, si osserva una significativa espressione di GFP nei neuroni all'interno della materia grigia del midollo spinale toracico sul lato, ipsilaterale all'iniezione. Nella materia bianca, l'espressione della GFP si osserva negli assoni nel cordone ipsilaterale, specialmente nelle aree tipiche degli assoni propriospinali. Un maggiore ingrandimento dei neuroni della materia grigia rivela un esempio di tipica espressione del segnale nei corpi cellulari neuronali e nei dendriti.
L'espressione della GFP nei neuroni può essere osservata anche nei nuclei del tronco encefalico, come all'interno della formazione reticolare pontina. I fattori chiave per una procedura di iniezione del midollo spinale di successo sono il corretto targeting vertebrale e la garanzia che il virus entri nel tessuto Se viene eseguita una lesione del midollo spinale rostrale prima di questa procedura, è possibile utilizzare l'iniezione diretta per rintracciare i neuroni che ristabilivano le connessioni intorno alla lesione.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra l'iniezione di un vettore virale retrogradamente trasportabile nel tessuto del midollo spinale di ratti, permettendo il tracciamento dei circuiti neurali e potenziali applicazioni di terapia genica. La procedura permette al vettore di essere assorbito alla sinapsi e trasportato al corpo cellulare dei neuroni bersaglio, facilitando le conoscenze sui percorsi spinali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Terapia genica
- Neuroanatomia
Sfondo
- I vettori virali possono compensare geni difettosi e introdurre materiale genetico nelle cellule.
- L'iniezione diretta nel midollo spinale bypassa le barriere biologiche per un targeting efficace.
- Il targeting corretto dei livelli spinali è cruciale per risultati di successo.
- Punti di riferimento come le vertebre aiutano nell'approccio chirurgico.
Obiettivo dello Studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'iniezione di vettori virali nel midollo spinale.
- Permette di effettuare il tracciamento retrogrado dei percorsi spinali.
- Facilitare la ricerca nelle applicazioni di terapia genica.
Metodi Utilizzati
- Il protocollo prevede l'iniezione chirurgica direttamente nel midollo spinale del ratto.
- L'area bersaglio si estende dai livelli vertebrali L1 a L4, utilizzando punti di riferimento per un targeting accurato.
- Viene dettagliata l'amministrazione attenta dei vettori virali con tempistiche specifiche per l'iniezione e il monitoraggio.
- Le osservazioni post-iniezione si concentrano sull'espressione di GFP nei neuroni.
Risultati Principali
- Un'iniezione di successo porta a una significativa espressione di GFP nei neuroni e assoni vicini.
- I percorsi neuronali scoperti dimostrano l'efficacia del trasporto retrogrado del vettore virale.
- I modelli di espressione di GFP indicano un targeting e un'uptake di successo nel midollo spinale toracico.
- Le conclusioni sottolineano l'importanza di un targeting vertebrale accurato per applicazioni di successo.
Conclusioni
- Questo studio fornisce una metodologia affidabile per le iniezioni di vettori virali nel midollo spinale.
- La procedura migliora la nostra comprensione della connettività neuronale e delle potenziali strategie di terapia genica.
- Ha implicazioni per il tracciamento dei circuiti neurali e il targeting di specifiche popolazioni neuronali.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Direct spinal cord injection of lentiviral vectors enables targeted delivery of genetic material to specific neuronal populations, bypassing biological barriers that limit systemic approaches. This method supports mechanistic de-risking in target validation by allowing precise tracing of motor pathways such as rubrospinal and reticulospinal tracts. The approach provides predictive confidence in preclinical models by revealing neuronal connectivity patterns relevant to motor circuit function and repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing specific spinal motor pathways and their interconnections.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation through retrograde transport of viral vectors to neuronal cell bodies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying pathway engagement and neuronal uptake efficiency in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining neuronal targets with high anatomical fidelity.
- Operational Value: Ensures assay standardization through consistent viral delivery to propriospinal interneurons and brainstem nuclei.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across spinal cord segments and injury models for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates continuity from discovery to preclinical validation by mapping GFP expression in thoracic spinal cord and pontine reticular formation.
- Mechanistic De-risking: Highlights age-dependent integration patterns that inform risk-adjusted advancement decisions in neurodegenerative models.
- Predictive Confidence: Supports biomarker alignment by identifying neuronal populations that reestablish connections post-injury.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation, particularly for motor circuit disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling retrograde tracing of spinal pathways to clarify motor circuit architecture.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized viral injection and quantitative GFP expression readouts in defined neuronal populations.
- Analytics: Provides quantitative measurements of transduction efficiency and axonal transport that help compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by tracing neurons that reestablish connections around injury sites, informing repair mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for spinal cord targeting across multiple disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in spinal motor pathway engagement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through landmark-based targeting and controlled viral delivery parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early biological de-risking of targets involved in motor circuit function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on neuronal uptake patterns and pathway-specific transduction efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent spinal surgery and microsurgical techniques for accurate vertebral targeting.
- Depends on microsyringe pumps, micromanipulators with vernier scales, and sterile surgical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of viral titer, injection volume, and post-operative monitoring protocols.
- Involves adaptation considerations across rodent ages and injury models due to observed age-dependent integration into corticospinal tracts.
- Limited by the need for precise dorsal laminectomy and spinal stabilization to avoid tissue damage during needle insertion.
