Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

Questo metodo consente di studiare il meccanismo di base della mielinazione e della remielinazione a livello cellulare e tisulare. Questa tecnica è al crocevia tra culture primarie e approcci in vivo. È un modello veloce e accessibile con il principale vantaggio di preservare l'architettura tissutale.

A dimostrare la procedura saranno Melina Thetiot, ricercatrice post-dottorato e Remi Ronzano, dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, inserire delicatamente una piccola forbice nel forame magnum e tagliare il cranio facendo un'incisione laterale verso il lato, quindi tagliare tutto intorno al cranio della testa. Per recuperare la parte dorsale del cranio, utilizzare una forcep fine e dritta per sollevare con cura la parte dorsale del cranio.

Quindi introdurre attentamente le forcep tra il cranio ventrale e il cervello. Capovolgere delicatamente il cervello e tagliare i nervi ottici e trigeminali con piccole forbici. Quindi, capovolgere la testa o la parte dorsale del cranio appena sopra un piatto di coltura cellulare di 60 millimetri contenente mezzo di dissezione ghiacciata per aiutare il cervello a cadere per gravità.

Usando forcep fini, orientare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto e il lato ventrale sdraiato. Al microscopio binoculare, utilizzare le forcep sottili e dritte per immobilizzare il cervello sul lato delencefalo. Quindi, separare il cervello posteriore dal resto del cervello.

Tagliare i peduncoli cerebellari sotto il cervelletto per separare il cervelletto dal resto del cervello posteriore. Una volta isolato il cervelletto, utilizzare forcette sottili e dritte per strappare con cura le meningi. Tenere delicatamente il cervelletto con le forcelle fini e curve e posizionarlo con il lato dorsale verso l'alto sulla piattaforma di plastica, perpendicolarmente alla lama del rasoio chopper.

Successivamente, con una punta sterile e sottile di pipetta attaccata a una pipetta da un millilitro, aspirare qualsiasi accesso al mezzo di dissezione intorno al cervelletto. Quindi, con un elicottero tissutale, affettare sezioni saggitali spesse 300 micrometri del cervelletto. Quindi, aggiungere delicatamente una goccia di mezzo di dissezione sul cervelletto affettato.

Quindi, con un'ampia punta di pipetta di cinghiale attaccata alla pipetta da un millilitro, aspirare lentamente il cervelletto affettato e trasferirlo di nuovo nel piatto di coltura cellulare da 60 millimetri contenente mezzo di dissezione ghiacciato. Quindi, utilizzare due forcep sottili e dritte per separare singole fette. Quindi, con un'ampia punta di pipetta di cinghiale attaccata alla pipetta da un millilitro, trasferire fino a quattro fette selezionate dai parassiti, insieme a qualche mezzo di dissezione su un inserto di coltura di una piastra a sei pozzetti.

Rimuovere qualsiasi accesso al mezzo di dissezione intorno alle fette utilizzando una punta di pipetta sottile. Per la demielinazione, rimuovere tutto il mezzo di coltura al di sotto degli inserti di coltura dopo sei giorni in vitro e sostituirlo con un millilitro per pozzo del mezzo di coltura fresco preri riscaldato contenente 0,5 milligrammi per millilitro LPC. Incubare per 15-17 ore a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5%.

Dopo l'incubazione, lavare gli inserti posizionandoli in una piastra di Petri da 25 millilitri contenente un millilitro di mezzo di coltura preri riscaldato. Quindi, trasferire immediatamente gli inserti di coltura in un nuovo piatto di sei pozza, contenente un mezzo di coltura fresco e preri riscaldato. Per iniziare l'immunoistochimica, utilizzare prima le forcep per sollevare gli inserti di coltura e rimuovere il mezzo di coltura sottostante.

Quindi, aggiungere due millilitri di 4%PFA in 1x PBS, ph 7.4, sugli inserti della membrana per fissare le fette cerebellari. Dopo 30 minuti, lavare le fette tre volte con due millilitri di 1x PBS per 10 minuti ciascuno lavaggio. Successivamente, al microscopio binoculare, utilizzando un ingrandimento da 25x a 30x, utilizzare un bisturi o un pennello per staccare delicatamente le fette dagli inserti della membrana.

Quindi, utilizzare un pennello per trasferire le fette galleggianti nei pozzi di una piastra di quattro pozzatti, contenente 1x PBS per limitare il consumo di anticorpi. Quindi, aspirare il PBS da ogni pozzo e incubare le fette in etanolo pre-raffreddato al 100% a meno 20 gradi Celsius per 15-20 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare l'etanolo al 100% e lavare brevemente le fette con 1x PBS.

Quindi, lavarli due volte a temperatura ambiente con 1x PBS per 10 minuti ogni lavaggio. Per bloccare siti di fissazione degli anticorpi non specifici, aspirare il PBS e incubare le fette in una soluzione contenente 1x PBS, 5%NGS e 0,3% detergente non ionico a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Successivamente, aggiungere anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco e incubare le fette a quattro gradi Celsius durante la notte.

Dopo l'incubazione notturna, lavare le fette tre volte con 1 PBS per 10 minuti ciascuno lavaggio. Quindi aggiungere gli anticorpi secondari, diluiti nella soluzione di blocco, a un rapporto di diluizione da uno a 500 e incubare le fette a temperatura ambiente al buio per tre ore. Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare le fette tre volte in 1x PBS al buio per 10 minuti ogni lavaggio.

Successivamente, sotto un microscopio binoculare, posizionare 100 microlettrici di 1x PBS sullo scivolo e con un pennello, trasferire le fette nel PBS e appiattirle sullo scivolo. Rimuovere qualsiasi accesso a PBS. Infine, posizionare una goccia di mezzo di montaggio direttamente sullo scivolo di copertura del vetro e coprire delicatamente le fette.

Immunosottenizioni di mielina in fette cerebellari organotipiche, ottenute dai giorni postnatali da 9 a 10 C57 neri sei topi di tipo selvatico sono stati osservati a 11 giorni in vitro con nodi di ronviae arricchiti in canali di sodio gated di tensione, affiancati dal dominio di giunzione assiogliale paranodale. Gli stessi risultati sono stati osservati per i topi transgenici PLP-GFP. La mielinzione delle cellule del parkengy si ottiene principalmente dopo una settimana di coltura.

Il trattamento LPC demielinizza completamente le fette, che si remielinano spontaneamente e sono completamente mielinate sei giorni dopo la demielinizzazione. Questa procedura dovrebbe richiedere 25 minuti al massimo. E' davvero il punto più critico.

La coltura di fette organotipiche è adatta per lo studio di imaging dal vivo delle dinamiche mielinationi. Può anche essere utilizzato per indirizzare gli esperimenti di screening dei farmaci. Questa tecnica consente un approccio facile e quantitativo per studiare i processi di mielinizzazione e remielinizzazione.

Gli sperimentatori devono seguire le procedure di sicurezza di base applicabili al benessere degli animali, alla mielinazione eccessiva e acuta.