Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida
27 febbraio 2019
Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività del Shigellacidal degli anticorpi nel siero. Siero è mescolato con batteri e complemento esogeno, incubate, e la miscela di reazione è placcata su piastre di agar. Batteri vitali formano colonie che sono contati, utilizzando un enumeratore di Colonia automatizzato e utilizzata per determinarne il titolo battericida.
Il campo di ricerca di Shigella attualmente manca di saggi ben definiti per esaminare il ruolo funzionale degli anticorpi generati dall'immunizzazione o dall'infezione. Questo saggio rappresenta un metodo ben definito per qualificare queste risposte immunitarie e misurare l'attività battericida di anticorpi specifici di Shigella. Il vantaggio principale di questo saggio è che consente un'analisi ad alta produttività di più campioni.
Le tecniche utilizzate in questo protocollo riducono notevolmente il tempo pratico e il tempo complessivo di dosaggio per misurare l'uccisione batterica diretta di anticorpi e campioni di siero. Per iniziare, incubare i campioni in un bagno d'acqua calda a 56 gradi Celsius per 30 minuti per riscaldare e attivare i campioni di prova. Ottenere una piastra di dosaggio e 20 microlitri di tampone di dosaggio alle colonne da una a dodici di righe da A a G.Aggiungere 20 microlitri di tampone di dosaggio alle colonne uno e due di fila H.Load 30 microlitri di ciascun campione di prova e duplicare alla riga H della piastra di dosaggio.
Per iniziare a eseguire diluizioni seriali triplicate dei campioni di prova, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere 10 microlitri dai pozzi da 3H a 12H. Trasferire i campioni nei pozzi corrispondenti di fila G e pipetta su e giù da 8 a 10 volte per mescolare bene il campione. Quindi, rimuovere 10 microlitri da questi pozzi.
Trasferire nei pozzi corrispondenti in fila F e pipetta su e giù da 8 a 10 volte per mescolare. Continuare questo processo di diluizione seriale attraverso la riga A.Dopo aver mescolato i pozzi nella fila A, rimuovere e scartare 10 microlitri dai pozzi da 3A a 12A in modo che il volume finale in tutti i pozzi sia di 20 microlitri. Recuperare una fiala di calcio batterico bersaglio congelato e scongelarla a temperatura ambiente.
Quindi, diluire i batteri in 20 millilitri di tampone di dosaggio. in base al fattore di diluizione ottimale predeterminato. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 microlitri di batteri diluiti ad ogni pozzo della piastra di dosaggio.
Recupera una fiala di baby rabbit complimento congelato e una fiala di BRC attivato dal calore congelato. Utilizzare acqua corrente fredda per scongelare le fiale a temperatura ambiente. Quindi, mescolare 100 microlitri di BRC attivato dal calore con 400 microlitri di tampone di dosaggio.
Aggiungere 50 microlitri di questa soluzione BRC attivata termicamente al 20% a tutti i pozzi della prima colonna. Mescolare un millilitro di BRC nativo con quattro millilitri di tampone di dosaggio. Aggiungere 50 microlitri di questa miscela del 20% a tutti i pozzi nelle colonne da due a dodici.
Posizionare la piastra uno uno shaker per 10-15 secondi per mescolare delicatamente la piastra di dosaggio. Incubare la piastra di dosaggio in un'incubatrice microbiologica per due ore. Nel frattempo, rimuovere i coperchi dalle due piastre LB Agar e posizionare le piastre a faccia in su in un armadietto di sicurezza biologico per 40-60 minuti per asciugare.
Al termine dell'incubazione, trasferire la piastra di dosaggio sul ghiaccio umido e incubare per 10-20 minuti per interrompere la reazione. Utilizzando una pipetta a dodici canali, mescolare i pozzi in fila H e individuare 10 microlitri della miscela di reazione sul fondo di una piastra LBA. Inclinare immediatamente la piastra e lasciare correre le macchie per circa 1,5-2 centimetri.
Ripetere questa procedura per le righe G, F ed E, individuandole sopra la riga precedente. Incubare le piastre LBA a temperatura ambiente fino a quando la soluzione non viene assorbita nelle piastre LBA. Quindi, metti i coperchi sulle piastre e trasferiscili a testa in giù in un incubatore microbiologico per incubare durante la notte.
Il giorno successivo, aggiungere 25 millilitri di Agar sovrapposto a 55 gradi celsius, contenenti 100 microgrammi per millilitro TTC e 0,1% di azide di sodio a ogni piastra LBA. Incubare a 37 gradi celsius per due ore per consentire ai batteri sopravvissuti di sviluppare un colore rosso. Quindi, usa una fotocamera digitale per fotografare le lastre.
Trasferisci le immagini su un computer e usa il software di enumerazione delle colonie integrate del NIST per analizzare le immagini come delineato nel protocollo di testo. Le piastre LBA rappresentative dimostrano che lo sviluppo del colore ha avuto luogo dopo l'incubazione notturna e l'aggiunta di sovrapposizione, con tutte le colonie sopravvissute visibili in rosso. L'uccisione batterica è chiaramente visibile per tutti i campioni testati nelle prime tre diluizioni.
Una diminuzione dell'uccisione batterica è vista come campioni vengono diluiti più in alto nella piastra e il siero è meno concentrato. I conteggi dei microcoloni vengono quindi eseguiti utilizzando il software NIST. Viene quindi calcolato il conteggio CFU medio per ogni diluizione di ogni campione, così come il valore di uccisione del 50%.
Questo valore di killing del 50% viene quindi applicato ai CFC medi per ogni diluizione siere per determinare i valori necessari per calcolare il KI SBA. Questo protocollo si basa su una placcatura batterica coerente e uniforme su LB Auger. Una buona tecnica di placcatura e inclinazione dei punti consentirà la crescita di microcoloni discreti e un accurato conteggio delle colonie. Questa tecnica utilizza Shigella virulento vivo e richiede un'appropriata tecnica aseptica e DPI per garantire che i batteri siano maneggiati in modo sicuro secondo le procedure BSL 2.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la misurazione dell'attività shigellacida degli anticorpi nel siero. Il metodo consente un'analisi ad alto rendimento e riduce il tempo di manipolazione manuale durante la valutazione dell'attività battericida degli anticorpi specifici per Shigella.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Microbiologia
- Sierologia
Sfondo
- Il campo di ricerca su Shigella manca di saggi definiti per esaminare le risposte anticorpali.
- Questo protocollo qualifica le risposte immunitarie e misura l'attività battericida.
- Permette l'analisi di numerosi campioni in modo efficiente.
- Utilizza Shigella virulente vive in condizioni di BSL 2.
Scopo dello studio
- Stabilire un saggio affidabile per misurare l'attività shigellucidica.
- Facilitare la valutazione delle risposte immunitarie in seguito a vaccinazione o infezione.
- Fornire un metodo che minimizzi il tempo di manipolazione manuale e massimizzi la produttività.
Metodi Utilizzati
- Attivazione termica dei campioni di siero.
- Diluizioni seriali triplicate dei campioni in esame.
- Inoculazione delle piastre saggio con batteri diluiti e complemento.
- Conteggio delle colonie mediante software automatizzato dopo incubazione.
Risultati principali
- Misurazione riuscita dell'uccisione batterica attraverso diverse diluizioni.
- Visualizzazione chiara delle colonie sopravvissute in rosso dopo l'incubazione.
- Quantificazione dei conteggi di UFC e determinazione dei valori di uccisione al 50%.
- Dimostrazione dell'affidabilità e dell'efficienza del saggio.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo standardizzato per valutare la funzione degli anticorpi.
- Migliora la comprensione delle risposte immunitarie contro Shigella.
- Applicazioni future potrebbero includere studi sull'efficacia dei vaccini.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I saggi battericidi sierici (SBAs) specifici per Shigella ad alto rendimento colmano una lacuna fondamentale nella valutazione funzionale degli anticorpi per lo sviluppo di vaccini e terapie immunologiche. Permettendo una quantificazione robusta e riproducibile dell'attività battericida, questo saggio fornisce un'elevata affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta e nella ricerca traslazionale. Il suo flusso di lavoro standardizzato e scalabile migliora le decisioni relative al portafoglio e l'avanzamento calibrato sul rischio per i programmi mirati a Shigella.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Consente la misurazione diretta dell'uccisione batterica mediata da anticorpi funzionali per la validazione dell'obiettivo.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando la funzione effettrice immunitaria contro Shigella.
- Facilita la valutazione comparativa di antigeni candidati o strategie di immunizzazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma validata ad alto rendimento per lo screening di campioni di siero in diverse condizioni.
- Fornisce output quantitativi e riproducibili, adatti alla standardizzazione dei saggi e al confronto tra laboratori.
- Riduce il lavoro manuale e aumenta la produttività mediante l'uso di piastre a 96 pozzetti e il conteggio automatizzato delle colonie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Consente la valutazione delle risposte anticorpali funzionali prima e dopo l'esposizione all'antigene in modelli preclinici.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali collegando i titoli battericidi all'immunità protettiva.
- Facilita la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica per i candidati vaccini.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo SBA integra le fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione del composto guida e alla valutazione preclinica, fornendo un'uscita standardizzata per l'attività funzionale dell'anticorpo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo alla clearance batterica mediata da anticorpi e l'elucidazione dei meccanismi immunitari.
- Screening: Offre titoli battericidi quantitativi e riproducibili per il confronto tra candidati e coorti.
- Analisi: Utilizza il conteggio automatizzato delle colonie e il calcolo dell'indice di uccisione al 50% per ottenere dati robusti.
- Ricerca traslazionale: Correla le misurazioni della funzionalità degli anticorpi con gli endpoint delle risposte immunitarie precliniche e cliniche.
- Riutilizzo aziendale: Fornisce una piattaforma saggistica scalabile e trasferibile per l'impiego in più siti e programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella valutazione della risposta immunitaria funzionale.
- Valore operativo: Ottimizza i flussi di lavoro mediante automazione, riducendo la manodopera e aumentando la capacità di elaborazione dei campioni.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati funzionali quantitativi standardizzati.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei candidati a vaccini e immunoterapie in base all'attività funzionale degli anticorpi, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in immunologia, microbiologia e tecnica asettica per patogeni di livello di sicurezza biologica 2 (BSL-2).
- Necessita dell'accesso a strumentazione per la manipolazione di piastre a 96 pozzetti, software automatizzati per il conteggio delle colonie e incubatori microbiologici.
- Richiede standardizzazione tra diversi gruppi di lavoro per l'allestimento del saggio, la semina e l'analisi dei dati.
- Adattabile a diverse fonti di siero e ceppi di Shigella mediante ottimizzazione del protocollo.
- L'uso di Shigella virulenta vivente richiede rigoroso rispetto delle norme di sicurezza biologica e dell'uso dei dispositivi di protezione individuale (PPE).
