Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino
1 aprile 2019
Stenosi dell'innesto per rappresentare un ostacolo critico in sostituzione di tessuto ingegnerizzato delle vie respiratorie. Per studiare i meccanismi cellulari alla base di stenosi, utilizziamo un modello murino di tessuti ingegnerizzati sostituzione tracheale con cellule mononucleari seminato del midollo osseo (BM-MNC). Qui, abbiamo dettaglio nostro protocollo, compreso produzione dell'impalcatura, BM-MNC isolamento, innesto semina e l'impianto.
Le applicazioni cliniche della trachea ingegnerizzata dai tessuti sono state limitate a causa della stenosi dell'innesto e dell'epitelializzazione ritardata. Un modello di topo di sostituzione tracheale ortotopica consente lo studio dei meccanismi cellulari che guidano la rigenerazione. I difetti a lungo segmento delle vie aeree possono superare ciò che le terapie attuali sono in grado di curare.
La trachea di ingegneria tissutale offre il potenziale per creare un organo sostitutivo per queste condizioni. Questo modello può essere applicato agli animali con proprietà transgeniche e di tracciamento del lignaggio. Possiamo quindi modulare i fattori ospiti che contribuiscono alla rigenerazione dell'innesto.
Una delle sfide principali nella produzione delle impalcature sarà misurare e determinare che i parametri di elettrofilatura sono sempre gli stessi. Quindi ogni volta che produci un'impalcatura, devi misurare la distanza da punta a collettore, l'umidità e la temperatura per assicurarti che le impalcature siano le stesse ogni volta. Fondamentale per il successo di questo modello è il perfezionamento delle tecniche microchirurgiche e il mantenimento del piano corretto dell'anestesia per consentire la ventilazione spontanea durante tutta la procedura.
Poiché la trachea ospite ha un diametro interno di circa un millimetro, la manipolazione e il posizionamento della sutura dei tessuti nativi sono importanti e meglio dimostrati visivamente. Inizia sciogliendo l'otto volte il peso percentuale di polietilene tereftalato, o PET, in esafluoroisopropanolo e riscaldando la soluzione risultante a 60 gradi Celsius. Mentre la soluzione viene riscaldata, sciogliere il tre volte il peso per cento di poliuretano, o PU, in esafluoroisopropanolo, combinando le soluzioni una volta raffreddata la soluzione pet.
Caricare una siringa da 60 millilitri dotata di un ago a punta smussata calibro 20 con la miscela polimerica. Utilizzare la siringa e un alimentatore CC ad alta tensione impostato su 14 kilovolt positivi sull'ago, un altro alimentatore CC ad alta tensione impostato su meno tre kilovolt, una portata di cinque millilitri all'ora e una distanza punta-substrato di 20 centimetri per elettrofilare il polimero su un'asta di acciaio inossidabile di un millimetro di diametro ruotata a 350 rotazioni al minuto. Continuare l'elettrofilatura fino a ottenere uno spessore della parete dell'impalcatura di 300 micrometri.
Quindi, far scorrere l'impalcatura dall'asta, posizionare l'impalcatura sotto vuoto durante la notte per rimuovere qualsiasi solvente residuo e sterilizzare l'impalcatura con un dosaggio di luce ultravioletta di 350 millijoule per centimetro squadrato per circa 15 minuti. In condizioni sterili, rimuovere la pelle dagli arti posteriori di un topo C57-Black/6 di sei-otto settimane, femmina, con forbici fini e forcep micro-Adson, e utilizzare le forcep Dumont numero cinque e le forcep Dumont numero 5/45 per rimuovere la fascia e i tendini. Separare le ossa per consentire a ciascuna di esse di essere tagliate su entrambe le estremità e utilizzare una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 25 per sciacquare il midollo osseo in una piastra di Petri contenente 30 millilitri di mezzo RPMI.
Una volta che tutte le ossa sono state larcate, filtrare il midollo osseo attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e trasferire il tubo in un armadio di biosicurezza. Aggiungere delicatamente la soluzione di cellule mononucleari filtrate lungo il lato di un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di polisucrose e diatrizoato di sodio senza mescolare gli strati e separare il plasma dai globuli bianchi e rossi per separazione del gradiente di densità. Alla fine della centrifugazione, raccogliere lo strato cristallino medio costituito dalle cellule mononucleari del midollo osseo e lavare le cellule mononucleari del midollo osseo con un rapporto uno a uno in PBS mediante centrifugazione.
Resuspend il pellet in cinque millilitri di PBS per un secondo lavaggio, seguito da resuspensione in 10 millilitri di mezzo RPMI fresco per il conteggio. Quindi, raccogliere le cellule con una centrifugazione aggiuntiva e diluire le cellule a una per 10 alle sette cellule per cinque microlitri di concentrazione di RPMI fresca. Prima di seminare l'impalcatura, tagliare il polimero a una lunghezza di cinque millimetri se necessario e bagnare l'impalcatura con cinque microlitri di mezzo RPMI per cinque minuti.
Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo in eccesso e caricare il lume dell'impalcatura con cinque microlitri della soluzione cellulare mononucleare del midollo osseo per 10 minuti. Quindi, inserire un ago calibro 21 attraverso il lume dell'impalcatura e posizionare l'innesto in un millilitro di mezzo RPMI durante la notte in un incubatore Celsius di 37 gradi. Dopo l'induzione dell'anestesia generale, confermare una mancanza di risposta al dito del piedi nell'animale ricevente e applicare unguento agli occhi dell'animale.
Ritagliare i capelli sul sito chirurgico dal mento alle claviole e posizionare l'animale su un cuscinetto chirurgico in una posizione reclinata dorsale. Utilizzando la tecnica aseptica, disinfettare il sito chirurgico con un povidone-iodio sequenziale, il 70% di etanolo, la serie di salviette povidone-iodio e spostare il mouse al microscopio sezionato con la testa a ore 12. Utilizzare forbici fini e forcelle micro-Adson per fare un'incisione della linea mediana dalle claviole all'osso ioide, e utilizzare le forcelle fini Dumont numero cinque e numero sette e un batuffolo di cotone sterile per pulire la fascia prima di inserire un retrattore Colibri autoserronte nell'incisione.
Usa le pinie per aprire i muscoli della cinghia per esporre la cartilagine tiroidea, la cartilagine cricoide e la trachea e separare senza mezzi termini la trachea dai nervi laringei ricorrenti che corrono paralleli su entrambi i lati del tessuto, seguita dalla separazione circonferenziale della trachea dall'esofago. Utilizzando un ago calibro 20 e un marcatore chirurgico, macchiare la porzione anteriore della trachea. Fai un'incisione sotto il terzo anello di cartilagine tracheale usando un paio di forbici a molla Vannas-Tubingen e un paio di forcette fini Dumont numero sette per resect una sezione a tre anelli di trachea.
Tenendo la trachea con le pinza curva fine, utilizzare una sutura sterile in nylon 9-0 per fissare l'estremità distale della trachea allo sterno per creare una tracheostomia temporanea e utilizzare l'ago calibro 20 e il marcatore chirurgico per macchiare la porzione anteriore dell'innesto. Per impiantare l'innesto, utilizzare una sutura di nylon sterile 9-0, dumont numero sette pinza fine e un portaaghi per inserire i punti prossimale-posteriore, prossimale-laterale e prossimale-anteriore e girare l'animale di 180 gradi. Quando il topo è in posizione, rilasciare la tracheostomia temporanea e fare un'incisione laterale a cinque millimetri di distanza dalla porzione anteriore dell'innesto per facilitare l'anastomosi distale.
Per completare l'anastomosi distale, posizionare le suture in modo simile all'anastomosi prossimale e ri-approssimare la posizione dell'innesto e i muscoli del cinturino. Quindi, chiudere l'incisione con 9-0 suture sterili in nylon in un modello di corsa e posizionare l'animale da solo in una gabbia di recupero posta su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino al pieno recupero. Due settimane dopo l'impianto, alcune cellule epiteliali basali possono essere osservate dalla cheratina cellulare basale cinque e 14 colorazione in sezioni di tessuto di innesto tracheale ingegnerizzate dai tessuti.
Le cellule basali vengono rilevate anche sulla superficie luminare dell'innesto a sette giorni dall'impianto. Dopo l'espianto e l'analisi istologica, la stenosi dell'innesto è stata identificata come il principale fattore che contribuisce nei topi impiantati innesto dimostrando segni di disagio respiratorio e stridor. Si noti che il telescopio dell'innesto e della trachea nativa è una scoperta comune come risultato della tecnica chirurgica.
La colorazione per F4/80 rivela macrofagi ospiti all'interno della regione stenotica dell'innesto in combinazione con la presenza delle cellule epiteliali basali. Evitare la manipolazione dei nervi laringei ricorrenti e assicurarsi che le suture prossimali e distale siano in posizione per consentire una tenuta ermetica all'anastomosi. Poiché questo protocollo riguarda le cellule mononucleari del midollo osseo derivate da topi agenti di livello uno di biosicurezza, è importante indossare dispositivi di protezione individuale adeguati per evitare la contaminazione.
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Panoramica
Questo studio analizza la stenosi dell'innesto in sostituzioni della via aerea ingegnerizzate mediante un modello murino. L'obiettivo è comprendere i meccanismi cellulari coinvolti nella rigenerazione dell'innesto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Medicina Rigenerativa
- Ingegneria Tissutale
Sfondo
- La stenosi dell'innesto rappresenta una sfida significativa nella trachea ingegnerizzata.
- Una epitelializzazione ritardata limita le applicazioni cliniche della trachea ingegnerizzata.
- I difetti dell'ariaia a lungo segmento superano le attuali capacità terapeutiche.
- Un modello murino consente lo studio dei meccanismi di rigenerazione.
Scopo dello studio
- Studiare i meccanismi cellulari che guidano la rigenerazione dell'innesto.
- Utilizzare un modello murino per lo studio della trachea ingegnerizzata tramite ingegneria tissutale.
- Valutare l'impatto delle cellule mononucleate del midollo osseo sugli esiti dell'innesto.
Metodi Utilizzati
- Produzione di impalcature per l'ingegneria tissutale.
- Isolamento di cellule mononucleate del midollo osseo (BM-MNC).
- Seeding dell'innesto con BM-MNC.
- Impianto della trachea ingegnerizzata in un modello murino.
Risultati principali
- Approfondimenti sui meccanismi cellulari che contribuiscono alla stenosi del trapianto.
- Valutazione dell'efficacia delle BM-MNC nell'integrazione del trapianto.
- Dimostrazione del potenziale della trachea ingegnerizzata in applicazioni cliniche.
- Identificazione dei fattori dell'ospite che influenzano la rigenerazione del trapianto.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un quadro per comprendere la stenosi dell'innesto.
- Evidenzia il ruolo delle BM-MNC nei sostituti tracheali ingegnerizzati.
- Applicazioni future potrebbero migliorare gli esiti clinici nei difetti delle vie aeree.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il trattamento delle lesioni tracheali a segmento lungo rimane una sfida critica nella medicina rigenerativa a causa delle limitazioni nel ripristino del tessuto funzionale. Questo modello murino di innesto tracheale ingegnerizzato tramite ingegneria tissutale consente un'indagine meccanicistica della stenosi dell'innesto e del ritardo nella epitelializzazione, due ostacoli principali alla traduzione clinica. La piattaforma supporta la riduzione predittiva del rischio e la validazione degli obiettivi per le strategie di ricostruzione delle vie aeree di nuova generazione nei portafogli di ricerca e sviluppo preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dell'integrazione e del fallimento del trapianto.
- Consente la validazione funzionale di tipi cellulari candidati e composizioni di scaffold per la rigenerazione delle vie aeree.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici modellando le interazioni tra ospite e trapianto e le risposte immunitarie.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema in vivo riproducibile per valutare la coerenza nella produzione di scaffold e i protocolli di semina cellulare.
- Consente una valutazione quantitativa dell'epitelializzazione e della stenosi mediante marcatori istologici e di immunofluorescenza.
- Permette la standardizzazione della selezione preclinica di costrutti tracheali ingegnerizzati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Modella difetti delle vie aeree rilevanti per la malattia e riproduce modalità di insufficienza clinica come la stenosi.
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori monitorando i marcatori delle cellule epiteliali e l'infiltrazione di macrofagi dell'ospite.
- Consente il progresso mirato alla riduzione del rischio di terapie ingegnerizzate con tessuti verso la prontezza clinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello murino costituisce un ponte tra la fase iniziale della scoperta e la validazione preclinica per innesti traqueali ingegnerizzati, favorendo un'ottimizzazione iterativa dalla progettazione del scaffold fino alla performance in vivo.
- Biologia della Scoperta: Illumina il rimodellamento dell'ospite e i meccanismi cellulari che determinano gli esiti del trapianto.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per stenosi ed epitelializzazione.
- Analisi: Utilizza analisi istologiche e di immunofluorescenza per confrontare le condizioni dei trapianti e le relative interazioni.
- Ricerca Translazionale: Garantisce continuità nella valutazione di terapie sperimentali in un modello di difetto clinicamente rilevante.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e scalabile per la ricerca ingegneristica dei tessuti su più programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle prestazioni del trapianto delle vie aeree e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione dei flussi di lavoro per la fabbricazione e l'impianto degli scaffold.
- Valore strategico: Informa le decisioni di proseguimento o interruzione modellando i principali rischi traslazionali, come la stenosi e il ritardo nella epitelializzazione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio degli asset della medicina rigenerativa rivolti alla ricostruzione delle vie aeree.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di microchirurgia e nella gestione dell'anestesia negli animali di piccola taglia.
- Richiede un controllo preciso dei parametri di elettrofilatura e della caratterizzazione del scaffold per garantire la riproducibilità.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture analitiche per istologia e immunofluorescenza.
- Comporta la standardizzazione intersquadre dei protocolli di isolamento cellulare, semina e intervento chirurgico.
- È limitato dalla complessità tecnica della chirurgia tracheale nei topi e dalla scalabilità del modello.
