Name: Ensemencement et Implantation d’un greffon biosynthétique de trachéale tissulaire dans un modèle murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez l'ensemencement et l'implantation d'une trachée tissulaire biosynthétique chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires de régénération des greffons et d'évaluer l'impact des cellules mononucléées de moelle osseuse.

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Nous aimerions remercier Robert Strouse et la recherche Information Solutions division d’Innovations à l’hôpital de l’enfant dans tout le pays pour leur soutien dans la conception graphique. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (NHLBI K08HL138460).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’hôpital de l’enfant dans tout le pays.
1. fabrication d’échafaudage
<ol><li>Préparer une solution de précurseur de nanofibres de polymère par : 1) dissolution 8 % en poids de PET en 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol et la solution à 60 ° C et de chauffage par 2) dissolution de 3 % en poids d’unité centrale en 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol à température ambiante.</li>
	<li>Une fois refroidi, mélanger les solutions pour créer un mélange polymère final de PET et PU (20-80).</li>
	<li>Electrospin la solution PET+ PU sur une tige en acier inoxydable (diamètre de 1 mm) en utilisant une aiguille pointe émoussée de 20 G sur une seringue de 60 mL, remplie de la solution de PET:PU à l’aide d’un ensemble d’alimentation haute tension DC alimentation à + 14 kV sur l’aiguille, une autre haute tension DC fournir ensemble à -3 kV , un débit de 5 mL/h et une distance de pointe-à-substrat de 20 cm. Faire pivoter la tige à 350 tr/min pendant la déposition de la fibre.</li>
	<li>Continuer électrofilage jusqu'à obtenue l’épaisseur désirée échafaudage de 300 µm. Glissez l’échafaud au large de la tige, puis maintenez-le sous vide pendant la nuit pour éliminer n’importe quel solvant résiduel.</li>
	<li>Stériliser à l’échafaud en utilisant une dose de lumière ultraviolette de 350 mJ/cm2 avant l’implantation.</li>
</ol>2. dérivés de la moelle osseuse des cellules mononucléées (BM-MNC) récolte
<ol><li>Euthanasier un 6-8 semaines vieux, femme, C57BL/6 souris avec un cocktail de kétamine (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg) et le kétoprofène (10 mg/kg). Vérifiez l’euthanasie complet en méthode queue-pincée. N’oubliez pas de suivre les directives locales d’euthanasie.</li>
	<li>Dans des conditions stériles, enlever la peau sur les fémurs et tibias pour exposer l’os à l’aide des ciseaux et pinces micro-Adson. Utilisez Dumont #5 pinces et pinces Dumont #5/45 pour enlever le fascia et les tendons. Séparez les os et coupez chacun d’eux sur les deux extrémités. À l’aide d’une seringue de 5 mL et une aiguille 25G, rincer la moelle osseuse dans une boîte de pétri contenant 30 mL de médias Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Filtrer cette RPMI avec la moelle osseuse à travers un tamis de cellule 70 µm en nylon dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Dans une armoire de sécurité biologique, placer 5 mL de diatrizoate de polysurcrose et de sodium dans un tube de 15 mL. Doucement ajouter le RPMI contenant des cellules mononucléaires de moelle osseuse sur le côté du tube pour éviter le mélange des deux couches. Centrifugeuse à 461 x g pendant 30 min avec « frein 1 », à 24 ° C. Remarque : Sur notre centrifugeuse, frein 1 correspond à la plus longue s’épuiser pendant la décélération.</li>
	<li>Sur les trois couches formées, jetez la couche supérieure (rose) de plasma et recueillir la couche intermédiaire (claire), comprenant les cellules mononucléaires de la moelle osseuse. Jeter le précipité des globules rouges.</li>
	<li>Diluer les cellules mononucléaires de la moelle osseuse (BM-MNC) en tampon phosphate salin (PBS) dans un rapport 1:1 et centrifuger à 461 x g pendant 10 min avec « frein 9 » à 24 ° C.</li>
	<li>Retirez le surnageant et diluer le culot avec 5 mL de PBS. Centrifugeuse à 461 x g pendant 10 min avec « frein 9 » à 24 ° C.</li>
	<li>Retirez le surnageant et diluer le culot avec environ 10 mL de milieu RPMI.</li>
	<li>Diluer 10 µL de la solution de BM-MNC avec un volume égal de 0,4 % trypan bleu dans un tube de 1 mL. Déposer 10 µL de la solution dans une cellule de comptage des diapositives de la chambre. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Répétez l’étape et calculer le nombre moyen de cellules. Remarque : Un nombre moyen de cellules de 1 X 108 cellules provenaient de l’utilisation de deux souris de donateurs. Cela équivaudrait à deux fémurs et deux tibias qui OS à moelle est isolé.</li>
	<li>Centrifuger la solution BM-MNC à 461 x g pendant 10 min avec « Frein 9 » à 24 ° C. Retirez le surnageant et diluer la concentration en cellules à 107 cellules/greffon. NOTE : Nous avons étudié l’ensemencement efficacité entre 1, 10 et 100 millions de cellules et trouvé que 10 millions de cellules par greffon fournit la plus grande efficacité de semis.</li>
</ol>3. cellule ensemencement sur les greffes
<ol><li>Mesurer les longueurs des échafaudages et le cas échéant, les couper à une longueur de 5 mm.</li>
	<li>Pré humide l’échafaud 5 µl de RPMI pendant 5 min. retirer le RPMI.</li>
	<li>Ajouter 5 µL de la solution de BM-MNC à la lumière de l’échafaudage pendant 10 min.</li>
	<li>Passez une aiguille 21G, grâce à la lumière de la prothèse et incuber le greffon pour 1000 µL de RPMI pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur.</li>
</ol>4. Implantation de greffe
Remarque : Il faut maintenir une technique aseptique pendant la procédure d’implantation de prothèse.
<ol><li>Utiliser les souris C57BL/6 femelles âgées de 6-8 semaines comme bénéficiaires pour les greffes de cellules ensemencées. Injecter l’enrofloxacine (10mg/kg) par voie sous-cutanée 24h avant la chirurgie et juste avant l’incision.</li>
	<li>Peser la souris et administrer une dose de 0,1 mL/10 g du cocktail anesthésique kétamine (100 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) et le kétoprofène (5 mg/kg) comme l’analgésie par voie intrapéritonéale.</li>
	<li>Vérifier si le plan de l’anesthésie a été réalisé par la méthode queue-pincement. Confirmant le niveau de sédation, appliquer un onguent ophtalmique stérile pour les yeux et couper les cheveux sur le site de la chirurgie du menton aux clavicules. Placez l’animal sur un coussin en position couchée dorsale. Désinfecter le site chirurgical en utilisant d’abord un tampon alcoolisé povidone-iode, suivie d’un tampon alcoolisé (alcool à 70 %) et une fois de plus un tampon alcoolisé povidone-iode.</li>
	<li>Placez l’animal sous le microscope à dissection avec sa tête loin du chirurgien. Faire une incision médiane allant de clavicules à l’os hyoïde, avec l’aide des ciseaux et pinces micro-Adson. Nettoyer le carénage avec Dumont #5 et Dumont #7 des pinces fines, avec un tampon de coton stérile, si nécessaire, insérez un rétracteur de Colibri autoblocants.</li>
	<li>Ouvrez les muscles de la sangle (Figure 3A) avec une pince fine Dumont #5 et #7 de Dumont pour exposer le cartilage thyroïde, le cartilage cricoïde et la trachée. Carrément la trachée séparer les nerfs laryngés récurrents en parallèle de chaque côté, suivie d’une séparation circonférentielle de la trachée de le œsophage (Figure 3B).</li>
	<li>À l’aide d’une aiguille de 20G et marqueur chirurgical, détachant la partie antérieure de la trachée.</li>
	<li>Identifier la trachée et faites une incision sous le troisième anneau trachéal cartilage et la trachée, à l’aide d’une paire de ciseaux de Vannas-Tubingen printemps et une paire de pinces fines Dumont #7 du transect. Tenant à la fine pince courbée, garantir la trachée distale au sternum en utilisant stérile suture nylon 9-0 pour créer une trachéostomie temporaire (Figure 3C). Remarque : Un matériel de suture alternative qui peut être utilisé est le PDS de 9-0 pour les rerapprochement de l’implantation et le muscle trachéal.</li>
	<li>Avec une aiguille de 20G et un marqueur chirurgical, tacher le greffon pour représenter la partie antérieure.</li>
	<li>Implanter la prothèse insertion proximale-postérieur, proximaux bilatéraux et des points de suture proximale-antérieure, dans cet ordre à l’aide de sutures stériles en nylon de 9-0 (Figure 3D), Dumont #7 fines pinces et un porte-aiguille.</li>
	<li>Tourner les animaux 180° pour placer sa queue loin du chirurgien. Communiqué de la trachéotomie temporaire. La trachée distale est incomplètement recoupée afin de permettre l’utilisation du segment réséqué comme une souche de rétraction. Quand n’est plus nécessaire, le segment de trachée de 5 MM est supprimé complètement.</li>
	<li>Terminez l’anastomose distale en plaçant les sutures de la même façon comme l’anastomose proximale.</li>
	<li>Re-approximativement la position de la prothèse et les muscles de la sangle. Refermer l’incision à l’aide de sutures stériles en nylon 9-0 dans un modèle en cours d’exécution.</li>
	<li>Injecter par voie sous-cutanée de 0,1 mL de la buprénorphine (0,1 mg/kg) et placer l’animal dans une cage de récupération placée sur un coussin chauffant sans autres animaux dans la cage.</li>
	<li>Observer la souris jusqu'à ce qu’il est conscient et capable de marcher, puis transférer la souris à une nouvelle cage avec literie molle, chow humide et l’eau médicamentée (ibuprofène, 30 mg/kg) pendant 48 h. Après ce laps de temps, retourner la souris à une cage normale avec les autres souris. NOTE : La souris qui maintiennent une détresse respiratoire ou diminution de l’activité après l’implantation sont observées par le personnel de laboratoire ou animales dans un incubateur à 32 ° C. Si le problème persiste pendant plus de 48 h, puis les souris devraient être euthanasiés.</li>
</ol>5. histologie et l’immunohistochimie
NOTE : Hématoxyline et éosine taches effectuées utilisant la technique standard de Nationwide Children Hospital morphologie Core. L’immunohistochimie a été réalisée conformément à la procédure ci-dessous.
<ol><li>Déparaffiner les diapositives à l’aide de xylène 1) pour 5 min, xylène 2) pendant 5 min, 3) 100 % éthanol pendant 5 min, 4) 90 % éthanol pendant 5 min, 5) 70 % éthanol pendant 5 min, 6) distillée H2O (dH2O) pendant 5 min.</li>
	<li>Plonger les diapositives de tampon citrate et placer dans l’autocuiseur rempli d’eau. Chauffer pendant 10 min puis laisser refroidir à température ambiante. Laver avec 0,1 % d’albumine sérique bovine dans du PBS (BSA-PBS) pendant 5 min. rincer avec dH2O. Remarque : Chauffage peut aussi être fait avec un bain d’eau chaude ou le micro-ondes pendant 15 min.</li>
	<li>Incuber les lames avec 3 % de sérum de chèvre normal en PBS pendant 1 h à température ambiante. Laver avec 0,1 % BSA-PBS pendant 5 min. incuber en anticorps primaire avec des concentrations de kératine 5 (1 : 1000)6, la kératine 14 (1/250)6 et F4/80 (1/100) de7 à 18 h pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Laver avec 0,1 % BSA-PBS deux fois pendant 10 min chacun se laver. Incubation avec l’anticorps secondaire approprié à la concentration de 1/500 pour K5/K14 et 1 : 300 F4/80 pendant 1 h à température ambiante. Laver avec 0,1 % BSA-PBS deux fois pendant 10 min chacun se laver.</li>
	<li>Montage à l’aide de 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) contenant le support média et verre de lamelles. Laisser pour reposer pendant 30 min avant l’imagerie.</li>
</ol>

<ol><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li>
<li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+A+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li>
<li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+basal+cells%3A+A+facultative+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li>
<li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li>
<li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li>
<li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery+%28United+States%29%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li>
<li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li>
<li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pediatric+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Développement d’un modèle de souris de trachées de tissu conçu est essentiel dans la compréhension des facteurs qui ont limité la traduction clinique des TETGs ; nommément greffe s’effondrer, sténose et retardé l’épithélialisation4. Quelques-uns des facteurs qui contribuent à ces limitations incluent la sélection du greffon, le procédé de fabrication, conception d’échafaudage et cellule ensemencement des protocoles. Ce modèle permet une évaluation plus rapide de ces facteurs pour comprendre les mé...

Long segment trachéales congénitales peuvent présenter comme des affections congénitales rares tels que les anneaux trachéaux complets et l’agénésie trachéale, ainsi qu’un traumatisme, malignité et l’infection. Cas de dépassement de 6 cm en adultes, soit 30 % de la longueur trachéale chez les enfants, ces défauts ne peuvent être traités par reconstruction chirurgicale. Tentatives de remplacer les voies respiratoires par tissus autologues, greffes cadavériques et des constructions artificielles ont été en proie à une infection chronique, granulation, défaillance mécanique et une sténose.
Tissu machiné trachéales greffes (TETGs) peuvent potentiellement résoudre ces problèmes tout en évitant la nécessité d’une immunosuppression toute la vie. Au cours de la dernière décennie, TETGs ont été testées dans des modèles animaux et utilisés cliniquement dans de rares cas d’un usage compassionnel1,2,3. Dans les cliniques et les grandes études animales, convalescence postopératoire de tissu conçu des voies aériennes remplacement requis nombreuses interventions pour sténose combattre (définie comme > 50 % de rétrécissement Luminale) et maintenir la perméabilité des voies aériennes. Des travaux supplémentaires de TETG a cherché à réduire cette sténose par le biais de l’évaluation du rôle de cellule ensemencement de choix, de vascularisation et de design de l’échafaudage. Cellule semis choix et conception d’échafaudage visant à restaurer la trachée native structure/fonction ont principalement portés sur les cellules épithéliales respiratoires et chondrocytes ensemencés sur des échafaudages résorbables, non résorbables et decellularise diverses. Comme susceptibles de vascularisation joue un rôle majeur dans le développement de la sténose, autres groupes ont mis l’accent sur l’optimisation in vitro ou modèles hétérotopiques pour accélérer la revascularisation ou néoangiogénèse4. Réalisation de vascularisation avec succès tout en conservant un TETG mécaniquement compétent et fonctionnel reste néanmoins un défi. Malgré des progrès récents, minimisant la sténose demeure un obstacle critique traduction clinique.
Pour étudier cette réponse histopathologique à TETG implantation in vivo, nous développé un modèle ovin de tissu conçu remplacement trachéale. La prothèse était composée d’un mélange de polyéthylène téréphtalate (PET) et polyuréthane échafaudage d’électrofilées (PU), ensemencé avec la moelle osseuse des cellules mononucléaires (BM-PTM). Dans cette petite cohorte, nous avons démontré qu’ensemencés autologue BM-PTM accéléré réépithélialisation et retardé la sténose5. Bien que l’ensemencement avec autologue BM-PTM amélioré la survie, le mécanisme cellulaire par lequel BM-PTM module la formation de neotissue fonctionnelle ne sait pas.
Enquête sur le développement nécessaire niveau cellulaire d’un modèle murin de tissu conçu remplacement trachéale. Semblable à l’étude de l’espèce ovine, nous avons utilisé un échafaudage d’électrofilées PET:PU ensemencé avec BM-PTM. en accord avec le modèle ovin, sténose TETG développé au cours des deux premières semaines suivant l’implantation1,2,3 ,,5. Cela suggère que le modèle murin récapitulé la pathologie observée plus tôt, ce qui nous permet d’interroger davantage les mécanismes cellulaires qui sous-tendent la sténose des voies respiratoires.
Dans ce rapport, nous détaillons notre protocole pour tissulaire génétiquement modifié, remplacement trachéale chez la souris y compris fabrication d’échafaudage, isolation BM-MNC, greffon ensemencement et l’implantation (Figure 1, Figure 2).

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium injectable à 0,9 %</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10cc</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>18G 1,5 po. Aiguille</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 25cc</td><td>Falcon</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>25G 1in. Aiguille</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>tube 50cc</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’alcool</td><td>Fisher Healthcare</td><td>NDC 69250-661-02</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloxacine) solution Bayer</td><td>Healthcare, LLC</td><td>NDC 0859-2267-01</td><td></td></tr><tr><td>Suture monofilament en polyamide noir, 9-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T05A09N10-13</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/ 6, femelle</td><td>Jackson laboratories</td><td>664</td><td>6-8 semaines</td></tr><tr><td>Citrate Buffer pH 6.0 20x concentré</td><td>ThermoFisher</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Colibri retractors</td><td>F.S.T</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs à embout en coton</td><td>Fisher scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Cytokératine 14 Anticorps monoclonal</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pince</td><td>F.S.T</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Pince fine</td><td>F.S.T</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Anticorps anti-souris Rat</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497R</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins - Sharp-blunt</td><td>F.S.T</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Cover Glasses</td><td>ThermoFisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Supports de montage avec DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG Secondaire IgG Chèvre-anti-souris Alexa Fluor 594 ThermoFisher</td><td></td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>TAnticorps IgG TIgG Chèvre-Anti Lapin Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre-anti Rat IgG Secondaire Anticorps Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofène</td><td>Dose de précision, Inc</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’iode</td><td>Disposable professionnels international, Inc.</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal à la kératine 5, BioLegend purifié</td><td></td><td>905501</td><td></td></tr><tr><td>injection de chlorhydrate de kétamine</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Pince micro-Adson</td><td>F.S.T</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Éponges non tissées</td><td>Covidien</td><td>441401</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Dechra Produits vétérinaires</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PET/PU (Polyéthylène téréphtalate et Échafaudages en polyuréthane)</td> Solutions <td></td><td>en nanofibres</td> Boîte de Pétri <td>commandée sur mesure</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TISH Porte-aiguilles/Pince</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml ; bingen Spring Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Recirculateur d’eau chaude</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine solution stérile</td><td>Akorn santé animale</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ensemencement et implantation d’un greffon biosynthétique de trachéale tissulaire dans un modèle murin

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Options de traitement pour les défauts trachéale segment long congénitale ou secondaire ont historiquement été limitées en raison de l’incapacité de remplacer des tissus fonctionnels. Génie tissulaire est très prometteur comme une solution possible, grâce à sa capacité à intégrer les cellules et molécules de signalisation dans un échafaudage en 3 dimensions. Des travaux récents avec tissu machiné trachéale greffes (TETGs) a connu quelques succès, mais leur traduction a été limitée par une sténose greffon, effondrement de greffe et retardé l’épithélialisation. Afin d’étudier les mécanismes conduisant à ces questions, nous avons développé un modèle murin pour l’implantation de prothèse trachéale tissu machiné. TETGs ont été construits à l’aide d’électrofilées polymères en polyéthylène téréphtalate (PET) et polyuréthane (PU) dans un mélange d’animal de compagnie et d’unité centrale (20 80 pour cent de poids). Les échafaudages ont été ensemencées puis à l’aide de la moelle osseuse des cellules mononucléaires isolés de 6 à 8 semaines-vieilles souris C57BL/6 par centrifugation en gradient. 10 millions de cellules par greffon ont été ensemencées dans le lumen de l’échafaudage et incubés pendant la nuit avant l’implantation entre les troisième et septième trachées anneaux. Ces greffes ont réussi à récapituler les résultats de la sténose et retardé l’épithélialisation tel que démontré par l’analyse histologique et le manque de kératine 5 et 14 de la kératine les cellules épithéliales basales sur immunofluorescence. Ce modèle servira comme outil pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’hôte de remodelage.

La figure 1 illustre un schéma du TETG ensemencement et implantation. La moelle osseuse a été récoltée de souris C57BL/6 et cultivés in vitro. BM-multinationales ont été isolés par centrifugation de densité et ensemencés sur le TETG. TETGs graines ont été implantés en souris destinataire syngénique C57BL/6.
La figure 2 est une vue d’ensemble de l’échafaudage TE...

Sténose de la greffe constitue un obstacle critique en remplacement de tissu conçu des voies respiratoires. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires qui sous‑tendent la sténose, nous utilisons un modèle murin de remplacement trachéale tissu machiné avec ensemencé la moelle osseuse des cellules mononucléaires (BM-MNC). Ici, nous détaillons notre protocole, y compris la fabrication d’échafaudages, BM-MNC isolement, semis de la greffe et l’implantation.

Ensemencement et Implantation d’un greffon biosynthétique de trachéale tissulaire dans un modèle murin

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Les applications cliniques de la trachée tissulaire ont été limitées en raison de la sténose de greffe et de l’épithélialisation retardée. Un modèle muriaque de remplacement trachéal orthotopique permet l’étude des mécanismes cellulaires conduisant à la régénération. Les défauts à long segment des voies respiratoires peuvent dépasser ce que les thérapies actuelles sont capables de guérir.La trachée d’ingénierie tissulaire offre le potentiel de créer un organe de remplacement pour ces conditions. Ce modèle peut être appliqué aux animaux ayant des propriétés transgéniques et de traçage de lignée. Nous pouvons ensuite moduler les facteurs hôtes contribuant à la régénération de la greffe.L’un des principaux défis dans la production des échafaudages sera de mesurer et de déterminer que les paramètres d’électrospinning sont les mêmes à chaque fois. Ainsi, chaque fois que vous produisez un échafaudage, vous devez mesurer la distance de pointe-à-collecteur, l’humidité, et la température pour s’assurer que les échafaudages sont les mêmes à chaque fois. Le raffinement des techniques microchirurgicales et l’entretien du plan correct d’anesthésie pour permettre une ventilation spontanée tout a

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Bioingénierie

Des avancées significatives dans l'identification de cellules souches sont continuellement en cours. Pour traduire ces découvertes, cependant, de nouvelles méthodes pour la livraison cellulaires doivent être élaborées. Ici je signale que les voies respiratoires fournir un itinéraire sûr pour la transplantation de cellules souches pour les poumons.

Trachéotomie: Une méthode pour la transplantation de cellules souches pour le poumon

Cette vidéo montre et compare deux modèles expérimentaux pour étudier le développement de maladies des voies respiratoires oblitérante (OAD) chez la souris, le modèle orthotopique transplantation hétérotopique et la trachée.

Hétérotopique et orthotopique transplantation trachéale chez des souris utilisées comme modèles pour étudier le développement de maladies des voies respiratoires oblitérante

Pour améliorer notre connaissance de la formation néo-tissu cellulaire et moléculaire, un modèle murin de la TEVG a été récemment mis au point. Les greffons ont été implantés en sous-rénaux des greffes de la veine cave d'interposition de souris C57BL / 6. Ce modèle permet d'obtenir des résultats similaires à ceux obtenus dans notre étude clinique, mais sur un temps bien sûr beaucoup plus courte.

Implantation de veine cave inférieure interposition de greffe en modèle de souris

Ici, nous présentons un protocole pour générer de l'ingénierie tissulaire greffes de vaisseaux qui sont fonctionnels pour le greffage dans des souris en double ensemencement partiellement induite sur les cellules souches pluripotentes (IPFPC) - dérivé des cellules musculaires lisses et l'IPFPC - cellules endothéliales dérivées sur une décellularisée navire échafaudage bioréacteur.

Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris

La sténose laryngotratrale résulte d'un dépôt pathologique de cicatrices qui rétrécit de façon critique les voies respiratoires trachéales et manque de thérapies médicales efficaces. À l'aide d'un stent PLLA-PCL (70% poly-L-lactiure et 30% de polycaprolactone) comme système local d'administration de médicaments, des thérapies potentielles visant à diminuer la prolifération des cicatrices dans la trachée peuvent être étudiées.

Conception d'un Stent trachéal trachéheal biocompatible dans des souris avec la sténose laryngotratrahéheal

Le protocole décrit un bioréacteur basé sur l’imagerie qui permet l’élimination sélective de l’épithélium endogène de la trachée du rat et la distribution homogène des cellules exogènes à la surface de la lumière, suivie d’une culture in vitro à long terme de la construction du tissu cellulaire.

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Le but de ce manuscrit est de décrire les étapes microchirurgicales nécessaires pour réaliser une greffe de larynx hétérotopique chez la souris. Les avantages de ce modèle murin par rapport à d’autres modèles animaux de transplantation laryngée sont son rapport coût-efficacité et la disponibilité de tests et de données immunologiques.

Un modèle murin hétérotopique pour étudier la transplantation laryngée

Le modèle de transplantation trachéale intrapulmonaire (IPTT) murine est précieux pour l’étude de la maladie oblitérante des voies respiratoires (OAD) après une transplantation pulmonaire. Il offre un aperçu du comportement immunologique et angiogénique spécifique du poumon dans l’oblitération des voies respiratoires après allotransplantation avec une reproductibilité élevée. Nous décrivons ici la procédure IPTT et ses résultats attendus.

Transplantation trachéale intrapulmonaire murine : un modèle pour étudier la maladie oblitérante des voies respiratoires après une transplantation pulmonaire

Cet article décrit comment créer des poumons de souris issus de la bio-ingénierie à l’aide de méthodes de décellularisation et de recellularisation. Il détaille également la transplantation pulmonaire orthotopique ultérieure.

Transplantation de poumon issu de la bio-ingénierie à l’aide de poumons de souris décellularisés et de cellules endothéliales humaines primaires

Ici, un protocole est présenté pour l’implantation d’un greffon vasculaire issu de l’ingénierie tissulaire dans l’artère carotide de souris à l’aide de la technique du ballonnet, fournissant un modèle animal approprié pour l’étude des mécanismes de régénération du tissu vasculaire.

Implantation d’une greffe vasculaire issue de l’ingénierie tissulaire dans l’artère carotide de souris via la technique du brassard

Découvrez l'ensemencement et l'implantation d'une trachée tissulaire biosynthétique chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes cellulaires de régénération des greffons et d'évaluer l'impact des cellules mononucléées de moelle osseuse.

Ensemencement et Implantation d’un greffon biosynthétique de trachéale tissulaire dans un modèle murin

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