Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

La malattia epatica e la cirrosi sono la sesta causa più comune di morte negli adulti di età compresa tra 25 e 64 anni. La DILI idiosincratica, a volte indicata come epatite indotta da farmaci, autoimmune o immuno-mediata, è la terza causa più comune di insufficienza epatica acuta negli Stati Uniti ed è il più comune processo di iposensibilizzazione indotta da farmaci epatico. Questo processo si verifica in circa il 9-12% dei pazienti con epatite autoimmune e questa forma di epatite è il motivo più comune per cui un farmaco viene rimosso dal mercato commerciale.

La stragrande maggioranza dei pazienti con epatite indotta da farmaci sono donne. Questo protocollo descrive le caratteristiche critiche osservate nei pazienti come l'epatite, gli autoanticorpi e le differenze di sesso. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua riproducibilità in un modello murino in vivo, che offre agli scienziati la possibilità di osservare lo sviluppo della malattia e le sue sequele.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo scoperto un epitopo comune nell'epatite anestetica e virale che è un epitopo dominante nei pazienti con epatite anestetica ed è significativamente associato alla fibrosi nei pazienti con epatite virale. Riteniamo che queste informazioni possano essere utilizzate per sviluppare test diagnostici specifici per l'epatite virale o indotta da farmaci o la fibrosi associata che, si spera, possano prevedere gli individui a rischio di sviluppare questa malattia o le loro sequele. Le tecniche scritte possono essere travolgenti perché utilizziamo sempre diversi controlli e contrappesi per garantire la riproducibilità dei nostri risultati.

La prima volta che fai l'esperimento, concediti abbastanza tempo. Dopo la prima volta, passa abbastanza velocemente. Dopo l'eutanasia del topo BALB/c, utilizzare un'incisione sulla linea mediana per esporre il contenuto intraaddominale con forbici microchirurgiche e praticare un piccolo taglio nella vena cava inferiore per rimuovere il sangue.

Quindi posizionare un angiocatetere calibro 24 nella vena porta. Mantenere il PBS a bagnomaria a quattro gradi Celsius e utilizzare una pompa peristaltica per cospargere il fegato con 40 millilitri di PBS alla velocità di 10 millilitri al minuto. Con le microforbici, rilasciare con cautela il fegato dall'addome e pesare il fegato su una barca di pesatura tarata.

Tagliare il fegato in piccoli pezzi da 10 a 15 millimetri. Aggiungere i campioni di fegato e il tampone di omogeneizzazione, quattro volte il peso di un fegato di topo, in una provetta di polipropilene da 15 millilitri e integrare con compresse complete di inibitori della proteasi secondo il manoscritto. Utilizzare un omogeneizzatore di tessuti da laboratorio generico a velocità media per omogeneizzare i campioni con ghiaccio fino a renderli lisci.

Centrifugare l'omogeneizzazione del fegato a 1.500 volte G per 10 minuti e poi versare il surnatante citosolico S100 Dopo la centrifugazione di nuovo a 100.000 volte G, congelare il surnatante citosolico S100 in ghiaccio secco e congelare la provetta a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare la trifluoroacetilazione, scongelare l'S100 a temperatura ambiente. Quindi, in un pallone di Erlenmeyer, diluire 20 milligrammi di S100 di topo a 10 millilitri con acqua deionizzata.

Con il pHmetro, regolare il pH a 10 con idrossido di potassio 1-normale. In una cappa aspirante, aggiungere 4,7 millimoli di S-ETFA alla soluzione. Mantenere il pH tra 9,9 e 10,0 somministrando idrossido di potassio 1-normale in goccioline per circa un'ora.

Registrare il volume totale di idrossido di potassio per ogni reazione. Trasferire le soluzioni in cassette di dialisi separate. Mettere le cassette in quattro litri di acqua deionizzata a dializzare per 72 ore con tre cambi al giorno.

Dopo la dialisi, registrare il volume finale di S100 trifluoroacetilato e quindi aliquotare in provette marcate. Congelare i tubi in ghiaccio secco e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Con la concentrazione proteica determinata secondo il manoscritto, se è maggiore di un milligrammo per millilitro, aggiungere un milligrammo di ciascuna proteina nativa e alterata con TFA a un millilitro di acqua deionizzata in tubi a proiettile separati.

Preparare un pezzo grezzo nel tubo del proiettile usando un millilitro di acqua deionizzata. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 50 microlitri di proteine bianche, native e alterate ciascuna, in duplicato. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di bicarbonato di sodio al 4% seguiti da 50 microlitri di acido 0,1%2, 4, 6-trinitrobenzensolfonico in ciascun pozzetto.

Incubare la piastra a 40 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di SDS al 10% in ciascun pozzetto, seguiti da 25 microlitri di acido cloridrico 1-normale. Dopo l'immunizzazione e l'anestesia del topo, utilizzare le forbici microchirurgiche per esporre la cavità intraaddominale.

Identificare la milza. Tagliare la milza sul peduncolo e metterla in una capsula di Petri con PBS contenente il 2% di siero fetale di vitello. Per rilasciare le cellule, incastrare la milza tra due vetrini smerigliati e strofinarli insieme.

Utilizzare una pipetta elettronica per trasferire le cellule in una provetta conica in polipropilene da 50 millilitri. Per il lavaggio, aggiungere PBS contenente il 2% di FCS alla provetta per raggiungere il volume di 50 millilitri e centrifugare a 335 volte G utilizzando una centrifuga refrigerata da banco. Versare il surnatante e ripetere la fase di lavaggio.

Aggiungere un millilitro di tampone di lisi ACK nella provetta per lavare per un minuto per rimuovere i globuli rossi. Quindi ripetere la fase di lavaggio PBS integrata con FCS. Dopo aver marcato le cellule con CFSE per 30 minuti, aggiungere 10 microgrammi per millilitro di citocromo-P450 2E1, JHDN5 o ovoalbumina trifluoroacetilata per stimolare le cellule marcate per 72 ore a 37 gradi Celsius nell'incubatore.

Dopo l'incubazione, colorare le cellule con CD4 marcato con alloficocianina in un rapporto di 1:100 per 30 minuti su ghiaccio. Dopo la laparotomia del topo immunizzato come descritto nel manoscritto, incannulare la vena porta con un ago calibro 25 e poi tagliare la vena cava inferiore sotto le vene renali. In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, perfondere ogni fegato con 40 millilitri di PBS a una velocità di flusso di 10 millilitri al minuto.

Dopo la perfusione, usando le forbici microchirurgiche, tagliare il fegato in corrispondenza del peduncolo epatico, rimuovere la cistifellea e quindi tagliare il fegato in corrispondenza dell'ilo. Su un setaccio in acciaio inossidabile da 300 maglie, utilizzare un pestello a siringa sterile da 20 millilitri e PBS freddo per distruggere il fegato. Con lo schermo, filtrare la sospensione cellulare risultante in provette da centrifuga pre-sterilizzate da 50 millilitri.

Portare ciascuna sospensione a 50 millilitri utilizzando PBS freddo e quindi lavare la sospensione mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 volte G Scartare il surnatante e quindi combinare i pellet mediante trattamento in nuove provette da 50 millilitri. Sospendi i pellet combinati in 45 millilitri di Percoll al 35% in PBS e 100 unità internazionali per millilitro di eparina. Quindi, centrifugare ogni tubo a 500 volte G per 10 minuti a 20 gradi Celsius.

Scartare il surnatante e sospendere il pellet in cinque millilitri di PBS, quindi aggiungere un millilitro di tampone lisanti ACK a ciascun pellet e conservare in ghiaccio per 10 minuti. Dopo aver lavato nuovamente con PBS per centrifugazione a 370 volte G, scartare il surnatante e quindi lavare le cellule con PBS integrato con FCS mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 volte G.Utilizzare un emocitometro elettronico per contare le cellule. In questo esperimento, le risposte immunitarie delle cellule CD4+T sono state determinate utilizzando la citometria a flusso.

I dati rappresentativi sulla proliferazione sono stati ottenuti il giorno 14 utilizzando CFSE in risposta al metabolita trifluoroacetilico, citocromo-P450 2E1, l'epitopo citocromo-P450 2E1, JHDN5. I pozzetti senza antigene sono stati utilizzati come controlli. Rispetto al controllo, i topi BALB/c hanno sviluppato proliferazione in risposta all'ovoalbumina trifluoroacetilata e al citocromo-P450 2E1, ma non a JHDN5.

Tre settimane dopo l'emulsione del TFA nell'immunizzazione adiuvante completa di Freund, le femmine di topo BALB/c hanno sviluppato più epatite autoimmune indotta da farmaci rispetto ai topi maschi BALB/c. L'analisi istologica dei tessuti epatici mostra anche un'infiammazione dell'epatite più grave nei topi femmina rispetto ai topi maschi. Il numero di cellule epatiche CD4+CD8+NK+ e NKT+ era significativamente più alto nelle femmine rispetto ai maschi.

mentre non ci sono state differenze nelle cellule B osservate tra questi topi Ricorda che sebbene sia una lunga giornata, questa formulazione durerà a lungo. Questa procedura può essere eseguita anche per trifluoroacetilare l'epitopo. Questa procedura ha permesso ai ricercatori di analizzare il decorso temporale dello sviluppo della malattia epatica e di aumentare il potenziale per nuove scoperte di proteine e percorsi.

L'S-etiltrifluorotioacetato è tossico e deve essere maneggiato in una cappa aspirante. Inoltre, si raccomandano vivamente buone pratiche e tecniche di laboratorio.