Name: Induzione dellepatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Scopri un modello immunologico in vivo in topi BALB/c per studiare l'epatite autoimmune indotta da farmaci, analizzando le differenze sessuali nella patogenesi e le risposte immunitarie epatiche.

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Il Dr. Njoku vorrebbe ringraziare il Dr. Noel R. Rose, MD PhD, per la sua guida e le discussioni approfondite che hanno portato alla formulazione di questo modello.

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali.
1. Trifluoroacetilazione di proteine citosoliche epatiche S-100 o di un epitopo del CYP2E1
NOTA: In primo luogo, preparare l'epitopo trifluoroacetilato S100 (TFA-S100) e trifluoroacetilato CYP2E1 (TFA-JHDN5). Perché le proteine S100 singeniche sono necessarie per le vaccinazioni e i topi BALB / c sono necessari per produrre l'immunogeno. La preparazione produce una grande quantità di immunogeno; quindi, anticipa di eseguire questa porzione circa quattro volte l'anno. Un metodo identico sarà utilizzato per realizzare il TFA-JHDN5. L'epitopo CYP2E1 (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, può essere sequenziato o acquistato.
<ol><li>Isolamento della frazione S100 del fegato.
	<ol>
<li>A seguito della sedazione di 5 – 10 topi BALB/c con 40-60 mg/kg di ketamina miscelata con 4 - 6 mg/kg di xilazina, confermare la corretta profondità dell'anestesia osservando una riduzione del tono muscolare e nessuna risposta a stimoli dolorosi, come un pizzico di punta (riflesso di astinenza), oltre alla perdita dei riflessi di raddrizzamento e alla perdita dei riflessi palpebrali.</li>
		<li>Usando le forbici microchirurgiche, esporre il contenuto intra-addominale usando un'incisione della linea mediana e fare un piccolo taglio nella vena cava inferiore per rimuovere il sangue.</li>
		<li>Posizionare un angiocatetere calibro 24 nella vena porta e perfondere il fegato di 10 ml/min con 40 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4 a bagnomaria a 4 °C. Rimuovere e pesare i fegatini raggruppati e tagliarli a pezzetti (10 – 15 mm). NOTA: L'eutanasia è indotta dall'iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina aggiuntiva (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguita da lussazione cervicale e apertura della cavità toracica per collassare i polmoni. Questo metodo fornisce il minimo dolore e disagio agli animali. Questo metodo è coerente con le raccomandazioni del gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association.</li>
		<li>Aggiungere 4 volte il peso del tampone di omogeneizzazione del saccarosio (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) (pH 7,4) integrato con compresse cocktail con inibitore completo della proteasi (vedere Tabella dei materiali) secondo le raccomandazioni dei produttori. Omogeneizzare in un tubo di polipropilene da 15 mL, utilizzando un omogeneizzatore tissutale di laboratorio generale a media velocità su ghiaccio fino a che liscio. Omogeneizzare sul ghiaccio per evitare che il tessuto si scaldi durante l'omogeneizzazione.</li>
		<li>Centrifugare gli omogeneizzati epatici a 1500 x g per 10 minuti e poi versare il surnatante. Centrifugare il surnatante per 1 ora a 100.000 x g. Congelare a scatto il surnatante e conservare a -80 °C. Il surnatante è il citosolico S-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Trifluoroacetilazione di S100 e JHDN5 NOTA: La trifluoroacetilazione dei gruppi ε-amminici dei residui di lisina di S-100 verrà eseguita secondo la procedura di Satoh18. Tutte le parti di questo esperimento, ad eccezione degli ultimi giorni di dialisi, vengono eseguite nella cappa aspirante.<ol>
<li>Determinare la concentrazione proteica totale del citosolico S-100 utilizzando il test dell'acido bicinchoninico (bcA assay)7. Diluire 20 mg di BALB/c mouse S100 o JHDN5 a 10 mL con dH2O in un matraccio Erlenmeyer da 50 mL. Regolare il pH a 10 con 1N KOH.</li>
		<li>Aggiungere 4,7 mmolo di S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA) alla soluzione. Mantenere il pH tra 9,9 – 10,0 con 1N KOH somministrando KOH in goccioline per circa 1 ora. Registrare il volume totale di KOH per ogni reazione.</li>
		<li>Trasferire le soluzioni in cassette di dialisi separate (non riempire eccessivamente). Dializzare le cassette per 72 h contro 4 L di dH2O con tre cambi al giorno. Dopo la dialisi, registrare il volume finale di TFA-S100 o TFA-JHDN5 e quindi aliquota in tubi etichettati. Surgelare e conservare a –80 °C.</li>
		<li>Una concentrazione stimata è determinata dividendo la quantità iniziale di S100 o JHDN5 (in mg) per il volume finale dopo dialisi (mL). Per determinare la modifica percentuale della proteina nativa19, diluire 1,0 mg di ciascuna proteina nativa e alterata da TFA (se la concentrazione finale è superiore a 1,0 mg) a 1,0 ml con dH2O in provette separate e preparare un bianco usando 1,0 ml di dH2O. Se la concentrazione della proteina alterata dal TFA è inferiore a 1,0 mg, non diluire<ol>
<li>Per separare i pozzetti di una piastra da 96 pozzi, aggiungere 50 μL delle proteine vuote, native e alterate. Aggiungere 50 μL di NaHCO3 al 4% seguito da 50 μL di acido solfonico 2,4,6-trinitrobenzene allo 0,1% di acido solfonico a ciascun pozzetto.</li>
			<li>Incubare la piastra a 40 °C per 2 ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 μL di 10 % SDS a ciascun pozzetto seguito da 25 μL di 1N HCl.</li>
			<li>Leggere a OD di 334 nm e quindi registrare l'assorbanza di ciascun composto da 200 – 600 nm per confermare il calo caratteristico dell'assorbanza a 334 nm. Calcola la modifica percentuale dei residui di lisina da parte del TFA, usando la seguente formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Immunizzazione dei topi per indurre l'epatite
NOTA: DIH è modellato in topi BALB/c mediante vaccinazioni con proteine citosoliche epatiche che sono state alterate covalentemente dal cloruro di trifluoracetile (TFA), un farmaco-metabolita modello, TFA-S1006 o un epitopo del CYP2E1 alterato covalentemente da TFA9, TFA-JHDN5 che induce epatite, cellule T autoreattive e autoanticorpi CYP2E1. I topi mostrano una fase di attivazione splenica 2 settimane dopo l'immunizzazione iniziale e una fase epatica di 3 settimane caratterizzata da infiammazione granulocitica. I topi FEMMINA BALB / c sono più suscettibili dei maschi all'epatite in questo modello.
<ol><li>Il giorno 0, immunizzare per via sottocutanea topi BALB/c di 6-8 settimane alla base del collo con 200 μg di TFA-S100 o 100 μg di TFA-JHDN5 emulsionati in volumi uguali di coadiuvante di Freund completo (CFA). Il giorno 0, immunizzare i topi con 50 ng di tossina pertosse, per via intramuscolare in una delle zampe posteriori. Il giorno 7, immunizzare i topi per via sottocutanea alla base della coda con 200 μg di TFA-S100 o 100 μg di TFA-JHDN5 emulsionati in volumi uguali di CFA per garantire che ogni topo riceva due iniezioni dello stesso immunogeno. NOTA: I topi vengono monitorati ogni ora per le prime 6 ore successive all'immunizzazione e poi almeno due volte al giorno per una settimana. Se i topi mostrano segni di dolore o angoscia, come postura curva o pelliccia arruffata, gli analgesici devono essere somministrati in conformità con l'ACUC locale. Se si nota dolore o angoscia significativi, i topi devono essere valutati da un veterinario per determinare se l'eutanasia è necessaria.</li>
	<li>Determinazione delle risposte immunitarie delle cellule T CD4+ a intere autoproteine, epitopi di autoproteine o TFA hapten utilizzando la citometria a flusso
	<ol>
<li>Dopo la sedazione dei topi con 40-60 mg/kg di ketamina miscelata con 4-6 mg/kg di xilazina tramite iniezione intraperitoneale, confermare la corretta profondità di anestesia come descritto nel punto 1.1.1 e quindi identificare la milza dopo aver esposto la cavità intra-addominale utilizzando forbici microchirurgiche. Tagliare la milza al peduncolo e metterla in una capsula di Petri con PBS/2% siero fetale di vitello (FCS). NOTA: L'eutanasia sarà indotta nei topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina aggiuntiva (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguita da lussazione cervicale e apertura della cavità toracica per collassare i polmoni. Questo metodo fornisce il minimo dolore e disagio agli animali. Questo metodo è coerente con le raccomandazioni del gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association.</li>
		<li>Rilasciare le celle utilizzando vetrini di vetro smerigliato e trasferirle in un tubo conico in polipropilene da 50 ml. Lavare con PBS/2% FCS portando il volume fino a 50 ml e centrifugando a 335 x g utilizzando una centrifuga refrigerata da banco. Versare il surnatante e ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Rimuovere i globuli rossi utilizzando 1 mL di tampone di lisatura ACK per 1 minuto e portare il volume fino a 50 ml con PBS/2% FCS. Centrifugare a 335 x g e versare il surnatante.</li>
		<li>Contare le celle. Etichettare le celle con CFSE per 30 minuti sul ghiaccio al buio, secondo le istruzioni del produttore. Sospendere le sospensioni a cella singola in 6 piastre di pozzetto da 3x106 celle/mL per pozzetto in PBS/2% FCS.</li>
		<li>Stimolare le cellule marcate con CYP2E1, JHDN5 o TFA-OVA (10 μg/mL) per 72 ore a 37 °C in 5% CO2, 95% aria (umidificata). Dopo l'incubazione, colorare le cellule con CD4-APC (1:100) per 30 minuti sul ghiaccio e analizzarle mediante citometria a flusso entro 3 giorni.</li>
		<li>Utilizzare la seguente strategia di gating per identificare le cellule CD4 + CFSE +: le cellule CD4 + CFSE + saranno identificate dalle cellule vive gated e visualizzate come istogrammi di cellule proliferanti.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento di cellule immunitarie infiltrate da topi immunizzati. 
	<ol>
<li>Per isolare le cellule immunitarie infiltrate nel fegato il giorno 14 o il giorno 21, anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale con 40-60 mg/kg di ketamina miscelata con 4-6 mg/kg di xilazina e confermare la corretta profondità dell'anestesia come descritto nel punto 1.1.1. Dopo la laparotomia utilizzando un'incisione della linea mediana fatta con micro forbici chirurgiche come descritto al punto 1.1.2, cannulare la vena porta con un ago calibro 25 e quindi tagliare la vena cava inferiore sotto le vene renali.</li>
		<li>Perfondere ciascun fegato ad una portata di 10 ml/min con 40 mL di PBS a bagnomaria a 37 °C. Dopo la perfusione, usando le forbici microchirurgiche, tagliare il fegato al peduncolo epatico, rimuovere la cistifellea e quindi tagliare il fegato al laccio.</li>
		<li>Interrompere il fegato su un setaccio in acciaio inossidabile a rete utilizzando un pestello di siringa sterile da 20 ml e PBS freddo. Filtrare la sospensione cellulare risultante in tubi centrifughi pre-sterilizzati da 50 mL utilizzando uno schermo a 300 maglie. Portare ogni sospensione a 50 ml utilizzando PBS freddo e quindi lavare la sospensione mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 x g.</li>
		<li>Scartare il surnatante e quindi raggruppare ogni pellet mediante trattamento in nuovi tubi da 50 ml (si consiglia un tubo per topo; tuttavia, se i campioni vengono raggruppati, si consigliano 2-4 pellet / tubo). Sospendere il pellet aggregato in 45 mL Percoll 35% (in PBS) e 100 UI/ mL di eparina.</li>
		<li>Ruotare ogni tubo a 500 x g per 10 minuti a 20 °C. Scartare il surnatante e sospendere il pellet in 5 mL di PBS e quindi aggiungere 1 mL di tampone di lisi ACK a ciascun pellet per 10 minuti su ghiaccio.</li>
		<li>Portare ogni tubo a 50 ml con PBS e lavare per centrifugazione per 10 minuti a 370 x g. Scartare il surnatante e quindi lavare le cellule con PBS/2% FCS mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 x g. Contare le celle.</li>
		<li>
Analisi del tipo di cellula mediante citometria a flusso NOTA: Ecco un esempio di come è possibile rilevare Foxp3+Tregs indotti.<ol>
<li>Incubare 1x106 cellule con reagente bloccante FcR e colorazione con 1:100 diluizioni di CD4-FITC, CD25-PE e CD45-PerCP per 30 minuti su ghiaccio. Quindi, macchiare le cellule intracellulari con FoxP3-APC.</li>
			<li>Fissare le cellule con 250 μL di tampone di fissazione (vedere Tabella dei materiali) e conservare a 4 °C fino all'analisi mediante citometria a flusso entro 3 giorni.</li>
			<li>La seguente strategia di gating è raccomandata al fine di rilevare Foxp3 + Tregs indotti in sospensioni monocellulari da fegato, milza o linfonodi utilizzando la citometria a flusso: Identificare le cellule vive utilizzando il kit di macchie Di cellule morte Aqua Fixable Live / Dead. Successivamente, gate sulle cellule epatiche che sono CD45 + (PerCP, clone RA3-6B2) e gate cd4 + cellule (FITC, cloneGK1.5) dal gate CD45 +. Dalle celle CD4+, identificare le percentuali di cellule CD25+(PE, clone 7D4) e FoxP3+ (APC, clone 3G3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi istologica dei tessuti epatici per l'epatite
	<ol>
<li>Il giorno 21, fissare le sezioni epatiche (5 μm di spessore) in formalina tamponata neutra al 10% e macchiare con ematossilina ed eosina.</li>
		<li>Determinare i punteggi istologici prima a bassa potenza (40X) in una media di 2 visualizzazioni e confermare a 64X. Segna le sezioni tissutali come segue: Grado 0 = nessuna infiammazione o necrosi; Grado 1= infiammazione lobulare minore senza necrosi; Grado 2 = infiammazione lobulare che coinvolge &lt;50% della sezione; Grado 3 = infiammazione lobulare che coinvolge ≥ 50% della sezione; e Grado 4 = infiammazione con necrosi.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinazione dei livelli di citochine tissutali nella milza e nel fegato. 
	<ol>
<li>Il giorno 14 o il giorno 21, omogeneizzare i campioni di fegato o milza (1 g) di ciascun topo in 1 ml di RPMI/2% FCS fino a che liscio utilizzando un omogeneizzatore di laboratorio generale su impostazione media. Mantenere il campione freddo sul ghiaccio.</li>
		<li>Centrifugare l'omogeneizzato per 15 min a 1455 x g a 4 °C utilizzando una centrifuga desktop refrigerata. Congelare a scatto il surnatante e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso. I livelli di citochine e chemochine possono essere misurati con kit ELISA commerciali, secondo le istruzioni del kit. Standardizzare i livelli di citochine convertendo i livelli (in mL o μL) in pg/g di tessuto.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevazione di anticorpi sierici contro il CYP2E1, l'epitopo DEL CYP2E1 JHDN5 e il metabolita del farmaco TFA.
	<ol>
<li>Nei giorni 14 o 21, sedare i topi con 40-60 mg / kg di ketamina mescolata con 4-6 mg / kg di xilazina. Confermare la corretta profondità dell'anestesia osservando una riduzione del tono muscolare e nessuna risposta a stimoli dolorosi, come un pizzico della punta (riflesso di astinenza), oltre alla perdita dei riflessi di raddrizzamento e alla perdita dei riflessi palpebrali. Utilizzare un ago da 25 G attaccato a una siringa di tubercolina e avvicinarsi al cuore facendo avanzare lentamente l'ago nella cavità toracica sotto le costole e immediatamente lateralmente al processo xifoide. Raccogliere il sangue usando la puntura intracardiaca.</li>
		<li>Una volta raccolto il sangue, lasciarlo coagulare a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni di sangue a 295 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela i sieri, aliquotare i sieri e congelare a scatto a -20 °C.</li>
		<li>Applicare 100 μL di antigeni di prova CYP2E1, JHDN5 o TFA-ovalbumina (OVA) (5 μg/mL in PBS) a 96 piastre di pozzetto per almeno 18 ore a 4 °C durante la notte. Il giorno successivo, lavare le piastre con tampone di lavaggio (PBS / 2% FCS), 2 cicli (4 lavaggi ciascuno).</li>
		<li>Applicare 100 μL di sieri di topo (1:100) in PBS/2% FCS in triplice copia sulle piastre e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo 2 ore, lavare le piastre con tampone di lavaggio come descritto al punto 2.6.2.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di anticorpi secondari alcalini fosfatasi (AKP)-capra anti-topo IgG, AKP-rat anti-topo IgG1 o AKP-rat anti-topo IgG2a (1:1000) per 2 ore seguita da una fase di lavaggio di 1 ciclo con tampone di lavaggio e 1 ciclo con PBS. Rileva gli anticorpi utilizzando un kit di substrato AKP e misura a OD 405 nm ogni 15 minuti con uno spettrofotometro. Il TFA di solito si sviluppa completamente in 15 minuti mentre il CYP2E1 e l'epitopo CYP2E1 possono svilupparsi da 30 a 60 minuti7.</li>
	</ol></li>
	<li>Studi sullo sviluppo dello stress ossidativo indotto da JHDN5 IgG in vitro.
	<ol>
<li>Utilizzando 12 piastre di pozzetto, incubare 106 cellule epatiche differenziate terminalmente per pozzetto su scivoli di copertura ricoperti di fibronectina in 1000 μL di mezzi Williams E integrati con glutammina e integratore generale (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C, 5% CO2, 95% di umidità per 7 giorni come raccomandato per massimizzare l'attività del CYP2E1.</li>
		<li>Aggiungere JHDN5 IgG (1:40) o mouse IgG (1:1000) per separare i pozzetti e incubare per 2 ore a 37 °C, 5% CO2, 95% di umidità. Hybridoma sera era molto diluito. Aggiungere un rilevatore di anticorpi fluorescenti rosso intenso (vedere Tabella dei materiali) per altri 30 minuti a tutti i pozzi.</li>
		<li>Lavare i pozzetti 3x con 1 mL di PBS al buio. Fissare le cellule in formaldeide al 3,7% per 10 minuti. Esaminare al microscopio confocale entro 24 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Studi di co-localizzazione di JHDN5 IgG con organelli intracellulari come i mitocondri in vitro. 
	<ol>
<li>Per dimostrare la co-localizzazione di JHDN5 IgG con mitocondri, cellule epatiche differenziate terminalmente scarsamente coltivate (~ 30%) su scivoli di copertura ricoperti di fibronectina per 7 giorni in mezzi E di Williams privi di coloranti integrati come descritto nel passaggio 2.7.</li>
		<li>Dopo aver determinato le corrette lunghezze d'onda di assorbimento, aggiungere la fluorescenza verde, 488 nm -coniugato mouse IgG o JHDN-5 (1:100) e la fluorescenza rossa, 594-coniugata Mito-tracker Red (1:100) per 2 ore (37 °C), 5% CO2, 95% di umidità.</li>
		<li>Montare i coperchi con fibronectina etichettati con il reagente anti-dissolvenza con DAPI ed esaminare al microscopio confocale.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Note generali del protocollo
<ol><li>Utilizzare strumenti di grado non farmaceutico quando i composti non sono disponibili in una formulazione per uso clinico. Tuttavia, ottenere ciascuno di questi strumenti da fornitori commerciali affidabili identificati in questo metodo. Utilizzare sempre sostanze chimiche conformi alle specifiche definite dal Comitato sui reagenti analitici dell'American Chemical Society di almeno il livello di grado reagente. Per i nostri metodi, utilizzare reagenti di livello analitico quando possibile.</li>
	<li>Seguire una rigorosa tecnica asettica per la formulazione delle proteine alterate dal TFA al fine di prevenire contaminazioni che potrebbero influire negativamente sul benessere degli animali o sull'interpretazione dei dati.</li>
	<li>Conservare e utilizzare formulazioni di grado non farmaceutico a durate per le quali la formulazione rimarrà potente, secondo le informazioni tecniche disponibili. Conservare CFA a temperatura ambiente, CYP2E1 e i suoi epitopi a -20 o -80 °C. Conservare le proteine alterate dal TFA a -80 °C e lasciare arrivare a 4 °C prima dell'emulsione con CFA. Conservare le proteine alterate dal TFA a -80 °C e conservare in aliquote per evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La forza di questo protocollo risiede nella sua riproducibilità; quindi, è fondamentale aderire ai passaggi suggeriti. La formulazione dell'immunogeno può essere una barriera per alcuni; tuttavia, abbiamo riprodotto il nostro modello utilizzando l'epitopo descritto nel nostro documento, che elimina la necessità di isolare la frazione S100 del fegato. È probabile che ulteriori epitopi o proteine possano essere alterati e indurre l'epatite dopo le vaccinazioni; tuttavia, descriviamo quelle proteine che abbiamo usato con ri...

Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere un modello murino di epatite autoimmune indotta da farmaci che si sviluppa in vivo e dimostrare come può essere utilizzato per indagare le basi molecolari, immunologiche e genetiche di questa malattia. L'obiettivo a lungo termine dei nostri studi è quello di scoprire i meccanismi responsabili dello sviluppo di infiammazione e lesioni epatiche croniche studiando la DIH in pazienti sensibili. Le malattie del fegato e la cirrosi costituiscono la sesta causa più comune di morte negli adulti di età compresa tra 25 e 64 anni. La DILI idiosincratica, a volte indicata come epatite autoimmune indotta da farmaci (DIH), è la terza causa più comune di insufficienza epatica acuta negli Stati Uniti. La DIH è il più comune processo di ipersensibilizzazione indotta da farmaci epatici osservato in circa il 9-12% dei pazienti con epatiteautoimmune 1. La stragrande maggioranza dei pazienti con DIH sono donne 2,3,4. Un tipo di DIH si sviluppa in individui sensibili dopo la somministrazione di anestetici volatili alogenati come isoflurano, sevoflurano, desflurano o alotano. Questi anestetici si legano covalentemente alle proteine del fegato con prodotti reattivi del loro metabolismo, creando così nuovi autoantigeni in grado di suscitare risposte allergiche o autoimmuni5.
Lo studio dei meccanismi patogenetici coinvolti nello sviluppo dell'anestetico e di qualsiasi forma di DIH è stato precedentemente ostacolato dalla mancanza di un modello animale che imiti da vicino l'induzione della malattia umana. Abbiamo sviluppato un modello murino sperimentale di DIH con caratteristiche simili al DILI immuno-mediato nei pazienti. L'epatite è indotta dall'immunizzazione con uno dei due autoantigeni che sono stati modificati covalentemente dal metabolita del cloruro di trifluoroacetile (TFA) che si forma in seguito al metabolismo ossidativo dell'anestetico dall'enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1)5. Un autoantigene è la frazione epatica citosolica S100 epatica, che è una miscela di diverse proteine6, e il secondo autoantigene è un epitopo del CYP2E1 che viene riconosciuto dai sieri di pazienti con DILI7 immuno-mediato anestetico. Utilizzando topi BALB/c, che sono relativamente resistenti all'epatite autoimmune sperimentale, distinguiamo il nostro modello dal modello di immunizzazione indotta da S100 dell'epatite autoimmune nei topi C57Bl/ 6J8.
A causa delle sue diverse presentazioni cliniche, DIH è difficile da studiare nei pazienti. Modelli sperimentali traslazionali offrono la capacità di valutare la patogenesi della malattia in vivo e in vitro. Allo stato attuale, non ci sono altri metodi alternativi per indurre DIH che esaminano completamente in vivo o in vitro risposte immunitarie adattive o innate senza l'uso di animali. Inoltre, poiché la trifluoroacetilazione di S-100 o dell'epitopo cyp2E1 non sembra produrre un immunogeno irritante e stiamo inducendo DIH mediante immunizzazione con proteine alterate da TFA, questi animali non riceveranno etere, alcun anestetico alogenato, barbiturico o alcol prima dell'immunizzazione o di altre procedure, considerando che questi agenti possono alterare i parametri che stiamo studiando. Anche così, abbiamo ridotto il nostro utilizzo del mouse utilizzando la simulazione al computer per confermare le preferenze di legame del nostro epitopoCYP2E1 9 scoperto e abbiamo rispecchiato il DIH umano che implica il sesso femminile dimostrando che i topi BALB / c femminili sviluppano un DIH10 più grave.
Nonostante le diverse presentazioni di DIH nei pazienti e le sfide nello studio della malattia clinica, la modifica post-traduzionale delle proteine native da parte dei metaboliti reattivi dei farmaci è un meccanismo chiave accettato nella patogenesi DIH che segue gli anestetici alogenati11. Gli investigatori accettano anche che il CYP2E1 è un autoantigene importante in questo processo12,13. Il ruolo delle cellule CD4+T interleuchinate (IL)-upregolate che riconoscono un CYP2E1 post-traduzionalmente modificato e altre proteine epatiche è un iniziatore accettato del DIH anestetico attirando neutrofili, eosinofili e mastociti nel fegato14, e questo meccanismo è stato confermato in molte forme di DIH 15,16. Le cellule CD4+CD25+T indotte che esprimono FoxP3 (Tregs) riducono la gravità del DIH e le carenze relative di queste cellule nella milza peggiorano il DIH 10,7. Pertanto, la maggior parte dei progressi nella comprensione del DIH sono stati resi possibili utilizzando modelli murini in vivo per valutare i meccanismi genetici, metabolici e immunologici del DIH sia in vivo che in vitro.
Poiché noi e altri ricercatori abbiamo scoperto ruoli per IL-4, neutrofili ed eosinofili nell'inizio della DIH utilizzando diversi modelli murini, riteniamo che questa osservazione supporti la nostra tesi che, indipendentemente dal modello DIH utilizzato, l'epatite e le lesioni sono indotte da IL-4. La forza del nostro protocollo risiede nell'utilizzo della metodologia in vivo, sia maschi che femmine, e nella ripetizione di istologia, saggi di proliferazione delle cellule T CD4 + e citochine. Il punto di forza del nostro uso di studi in vitro è che riducono il numero di topi necessari fornendo al contempo la metodologia per isolare le interazioni cellulari che guidano il DIH. Raccomandiamo l'uso di topi maschi e femmine perché questo riduce la possibilità di pregiudizi inconsci nell'interpretazione dei risultati e rafforza il potenziale di traduzione dei nostri studi poiché l'incidenza, la prevalenza e la gravità della DIH sono più elevate nelle donne17. Raccomandiamo che i topi siano ottenuti da un unico fornitore; tuttavia, se ciò non è possibile, ottenere controlli di cucciolata o topi selvatici dallo stesso fornitore dei topi geneticamente modificati.

<table><tbody><tr><td>0,1% acido 2,4,6-trinitrobenzensolfonato (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Substrato Kit</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c topi</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; Kit di proliferazione cellulare CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante FcR</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento generale</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&commerce cellule crioconservate</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Kit colorante Aqua Dead Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr>Elenco<td>delle tossine della pertosse</td><td>Biologici</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponato soluzione salina pH 7.4</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Mini compresse di inibitori della proteasi, senza EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per dialisi Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade; Soluzione SDS, 10%</td> <td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi balb / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

L'epatite autoimmune indotta da farmaci (DIH) è il più comune processo di ipersensibilizzazione indotta da farmaci epatici osservato in circa il 9-12% dei pazienti con epatite autoimmune. La stragrande maggioranza dei pazienti con DIH sono donne. I meccanismi alla base di queste differenze sessuali nella prevalenza non sono chiari a causa della scarsità di modelli animali che imitano la malattia umana. Anche così, i meccanismi sottostanti sono ampiamente ritenuti associati agli aplotipi dell'antigene leucocitario umano e agli ormoni sessuali. Al contrario, utilizzando un modello murino DIH, abbiamo scoperto che le cellule T CD4+ avviate da IL-4 dirette contro un epitopo del citocromo P450 2E1 inducono l'afflusso di neutrofili, macrofagi e mastociti nel fegato di topi BALB/ c femminili. Utilizzando questo modello, abbiamo anche dimostrato che le cellule T regolatorie FoxP3+ indotte da IL-33 conferiscono protezione contro il DIH nei topi femmina e maschio. Questo modello di DIH è indotto immunizzando i topi con un epitopo del CYP2E1 che è stato alterato covalentemente con un metabolita del farmaco che è stato associato al DIH. Questo epitopo è riconosciuto dai pazienti con DIH. Il nostro metodo induce epatite e autoanticorpi robusti e riproducibili che possono essere utilizzati per studiare la patogenesi della DIH. Mentre gli studi in vivo possono causare dolore e angoscia indebiti nei topi se eseguiti in modo improprio, il vantaggio di un modello in vivo è la capacità di valutare la patogenesi della malattia in un gran numero di topi. Inoltre, gli effetti biologici delle proteine epatiche alterate possono essere studiati utilizzando procedure invasive. L'aggiunta di studi in vitro al disegno sperimentale consente una rapida ripetizione e analisi meccanicistica a livello cellulare. Pertanto, dimostreremo il nostro protocollo modello e come può essere utilizzato per studiare i meccanismi in vivo e in vitro del DIH.

Il programma di immunizzazione utilizzato per indurre la DIH mostrato nella Figura 1 rappresenta le due vaccinazioni richieste alla base del collo (giorno 0) e alla base della coda (giorno 7). La Figura 2 mostra i dati rappresentativi di proliferazione ottenuti il giorno 14 utilizzando CFSE in risposta al CYP2E1, JHDN5, all'epitopo CYP2E1 e al metabolita trifluoroacetile (TFA) degli anestetici. La Figura 3 mostra la strategia di gat...

Descriviamo un modello di epatite traslazionale di immunizzazione in vivo nei topi BALB / c che può essere utilizzato per studiare la patogenesi dell'epatite autoimmune indotta da farmaci, comprese le differenze di sesso osservate in questa malattia. Descriveremo come questo modello dimostra analisi riproducibili utilizzando tecniche sperimentali in vivo e in vitro.

Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

La malattia epatica e la cirrosi sono la sesta causa più comune di morte negli adulti di età compresa tra 25 e 64 anni. La DILI idiosincratica, a volte indicata come epatite indotta da farmaci, autoimmune o immuno-mediata, è la terza causa più comune di insufficienza epatica acuta negli Stati Uniti ed è il più comune processo di iposensibilizzazione indotta da farmaci epatico. Questo processo si verifica in circa il 9-12% dei pazienti con epatite autoimmune e questa forma di epatite è il motivo più comune per cui un farmaco viene rimosso dal mercato commerciale.La stragrande maggioranza dei pazienti con epatite indotta da farmaci sono donne. Questo protocollo descrive le caratteristiche critiche osservate nei pazienti come l'epatite, gli autoanticorpi e le differenze di sesso. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua riproducibilità in un modello murino in vivo, che offre agli scienziati la possibilità di osservare lo sviluppo della malattia e le sue sequele.Utilizzando questo protocollo, abbiamo scoperto un epitopo comune nell'epatite anestetica e virale che è un epitopo dominante nei pazienti con epatite anestetica ed è significativamente associato alla fibrosi nei pazienti con epatite virale. Riteniamo che queste informazioni possano essere utilizzate per sviluppare test diagnostici specifici per l'epatite virale o indotta da farmaci o la fibrosi associata che, si spera, possano prevedere gli individui a rischio di sviluppare questa malattia o le loro sequele. Le tecniche scritte possono essere travolgenti perché utilizziamo sempre diversi controlli e contrappesi per garantire la riproducibilità dei nostri risultati.La prima volta che fai l'esperimento, concediti abbastanza tempo. Dopo la prima volta, passa abbastanza velocemente. Dopo l'eutanasia del topo BALB/c, utilizzare un'incisione sulla linea mediana per esporre il contenuto intraaddominale con forbici microchirurgiche e praticare un piccolo taglio nella vena cava inferiore per rimuovere il sangue.Quindi posizionare un angiocatetere calibro 24 nella vena porta. Mantenere il PBS a bagnomaria a quattro gradi Celsius e utilizzare una pompa peristaltica per cospargere il fegato con 40 millilitri di PBS alla velocità di 10 millilitri al minuto. Con le microforbici, rilasciare con cautela il fegato dall'addome e pesare il fegato su una barca di pesatura tarata.Tagliare il fegato in piccoli pezzi da 10 a 15 millimetri. Aggiungere i campioni di fegato e il tampone di omogeneizzazione, quattro volte il peso di un fegato di topo, in una provetta di polipropilene da 15 millilitri e integrare con compresse complete di inibitori della proteasi secondo il manoscritto. Utilizzare un omogeneizzatore di tessuti da laboratorio generico a velocità media per omogeneizzare i campioni con ghiaccio fino a renderli lisci.Centrifugare l'omogeneizzazione del fegato a 1.500 volte G per 10 minuti e poi versare il surnatante citosolico S100 Dopo la centrifugazione di nuovo a 100.000 volte G, congelare il surnatante citosolico S100 in ghiaccio secco e congelare la provetta a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare la trifluoroacetilazione, scongelare l'S100 a temperatura ambiente. Quindi, in un pallone di Erlenmeyer, diluire 20 milligrammi di S100 di topo a 10 millilitri con acqua deionizzata.Con il pHmetro, regolare il pH a 10 con idrossido di potassio 1-normale. In una cappa aspirante, aggiungere 4,7 millimoli di S-ETFA alla soluzione. Mantenere il pH tra 9,9 e 10,0 somministrando idrossido di potassio 1-normale in goccioline per circa un'ora.Registrare il volume totale di idrossido di potassio per ogni reazione. Trasferire le soluzioni in cassette di dialisi separate. Mettere le cassette in quattro litri di acqua deionizzata a dializzare per 72 ore con tre cambi al giorno.Dopo la dialisi, registrare il volume finale di S100 trifluoroacetilato e quindi aliquotare in provette marcate. Congelare i tubi in ghiaccio secco e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Con la concentrazione proteica determinata secondo il manoscritto, se è maggiore di un milligrammo per millilitro, aggiungere un milligrammo di ciascuna proteina nativa e alterata con TFA a un millilitro di acqua deionizzata in tubi a proiettile separati.Preparare un pezzo grezzo nel tubo del proiettile usando un millilitro di acqua deionizzata. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 50 microlitri di proteine bianche, native e alterate ciascuna, in duplicato. Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di bicarbonato di sodio al 4% seguiti da 50 microlitri di acido 0,1%2, 4, 6-trinitrobenzensolfonico in ciascun pozzetto.Incubare la piastra a 40 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di SDS al 10% in ciascun pozzetto, seguiti da 25 microlitri di acido cloridrico 1-normale. Dopo l'immunizzazione e l'anestesia del topo, utilizzare le forbici microchirurgiche per esporre la cavità intraaddominale.Identificare la milza. Tagliare la milza sul peduncolo e metterla in una capsula di Petri con PBS contenente il 2% di siero fetale di vitello. Per rilasciare le cellule, incastrare la milza tra due vetrini smerigliati e strofinarli insieme.Utilizzare una pipetta elettronica per trasferire le cellule in una provetta conica in polipropilene da 50 millilitri. Per il lavaggio, aggiungere PBS contenente il 2% di FCS alla provetta per raggiungere il volume di 50 millilitri e centrifugare a 335 volte G utilizzando una centrifuga refrigerata da banco. Versare il surnatante e ripetere la fase di lavaggio.Aggiungere un millilitro di tampone di lisi ACK nella provetta per lavare per un minuto per rimuovere i globuli rossi. Quindi ripetere la fase di lavaggio PBS integrata con FCS. Dopo aver marcato le cellule con CFSE per 30 minuti, aggiungere 10 microgrammi per millilitro di citocromo-P450 2E1, JHDN5 o ovoalbumina trifluoroacetilata per stimolare le cellule marcate per 72 ore a 37 gradi Celsius nell'incubatore.Dopo l'incubazione, colorare le cellule con CD4 marcato con alloficocianina in un rapporto di 1:100 per 30 minuti su ghiaccio. Dopo la laparotomia del topo immunizzato come descritto nel manoscritto, incannulare la vena porta con un ago calibro 25 e poi tagliare la vena cava inferiore sotto le vene renali. In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, perfondere ogni fegato con 40 millilitri di PBS a una velocità di flusso di 10 millilitri al minuto.Dopo la perfusione, usando le forbici microchirurgiche, tagliare il fegato in corrispondenza del peduncolo epatico, rimuovere la cistifellea e quindi tagliare il fegato in corrispondenza dell'ilo. Su un setaccio in acciaio inossidabile da 300 maglie, utilizzare un pestello a siringa sterile da 20 millilitri e PBS freddo per distruggere il fegato. Con lo schermo, filtrare la sospensione cellulare risultante in provette da centrifuga pre-sterilizzate da 50 millilitri.Portare ciascuna sospensione a 50 millilitri utilizzando PBS freddo e quindi lavare la sospensione mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 volte G Scartare il surnatante e quindi combinare i pellet mediante trattamento in nuove provette da 50 millilitri. Sospendi i pellet combinati in 45 millilitri di Percoll al 35% in PBS e 100 unità internazionali per millilitro di eparina. Quindi, centrifugare ogni tubo a 500 volte G per 10 minuti a 20 gradi Celsius.Scartare il surnatante e sospendere il pellet in cinque millilitri di PBS, quindi aggiungere un millilitro di tampone lisanti ACK a ciascun pellet e conservare in ghiaccio per 10 minuti. Dopo aver lavato nuovamente con PBS per centrifugazione a 370 volte G, scartare il surnatante e quindi lavare le cellule con PBS integrato con FCS mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 volte G.Utilizzare un emocitometro elettronico per contare le cellule. In questo esperimento, le risposte immunitarie delle cellule CD4+T sono state determinate utilizzando la citometria a flusso.I dati rappresentativi sulla proliferazione sono stati ottenuti il giorno 14 utilizzando CFSE in risposta al metabolita trifluoroacetilico, citocromo-P450 2E1, l'epitopo citocromo-P450 2E1, JHDN5. I pozzetti senza antigene sono stati utilizzati come controlli. Rispetto al controllo, i topi BALB/c hanno sviluppato proliferazione in risposta all'ovoalbumina trifluoroacetilata e al citocromo-P450 2E1, ma non a JHDN5.Tre settimane dopo l'emulsione del TFA nell'immunizzazione adiuvante completa di Freund, le femmine di topo BALB/c hanno sviluppato più epatite autoimmune indotta da farmaci rispetto ai topi maschi BALB/c. L'analisi istologica dei tessuti epatici mostra anche un'infiammazione dell'epatite più grave nei topi femmina rispetto ai topi maschi. Il numero di cellule epatiche CD4+CD8+NK+ e NKT+ era significativamente più alto nelle femmine rispetto ai maschi.mentre non ci sono state differenze nelle cellule B osservate tra questi topi Ricorda che sebbene sia una lunga giornata, questa formulazione durerà a lungo. Questa procedura può essere eseguita anche per trifluoroacetilare l'epitopo. Questa procedura ha permesso ai ricercatori di analizzare il decorso temporale dello sviluppo della malattia epatica e di aumentare il potenziale per nuove scoperte di proteine e percorsi.L'S-etiltrifluorotioacetato è tossico e deve essere maneggiato in una cappa aspirante. Inoltre, si raccomandano vivamente buone pratiche e tecniche di laboratorio.

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Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'infiammazione del colon nei topi mediante trasferimento adottivo di cellule T singeniche CD4+CD45RBin riceventi carenti di cellule T e B. Le caratteristiche cliniche e istopatologiche imitano le malattie infiammatorie intestinali umane. Questo metodo consente lo studio dell'inizio dell'infiammazione del colon e della progressione della malattia.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

Il trasferimento di linfociti bm12 in un ricevente C57BL/6 è un modello consolidato di lupus eritematoso sistemico. Qui descriviamo come iniziare la malattia utilizzando questo modello e come caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinale e le plasmacellule mediante citometria a flusso.

Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice

Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Qui vi mostriamo un approccio enzimatico per isolare epatociti primari da topi adulti, e descriviamo la quantificazione di una risposta infiammatoria con ELISA e PCR in tempo reale.

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

In questo protocollo, viene descritto un modello di colite di trasferimento adottivo delle cellule T antigene-antigene specifico per l'intestino. Le cellule T CD4+ sono isolate da topi transgenici CBir1 TCR. Questi sono specifici per un antigene del microbiota intestinale immunodominante CBir1 flagellina, che viene trasferito nei topi Rag1-/- riceventi, portando all'infiammazione intestinale.

Induzione dell'infiammazione intestinale mediante trasferimento adottivo di cellule T CBir1 TCR transgeniche CD4 + a topi immunodeficienti

L'encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell'EAE.

Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55

Scopri un modello immunologico in vivo in topi BALB/c per studiare l'epatite autoimmune indotta da farmaci, analizzando le differenze sessuali nella patogenesi e le risposte immunitarie epatiche.

Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

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