Name: Isolamento di cellule rigenerative di derivazione adiposa per il trattamento della disfunzione erettile a seguito di prostatectomia radicale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Scopri il protocollo di isolamento di cellule rigenerative di derivazione adiposa per trattare la disfunzione erettile dopo prostatectomia radicale. Questo metodo standardizzato facilita la ricerca sulle cellule staminali adipose.

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Questo lavoro è stato fondato dall'Ospedale Universitario di Odense (11/31936), dal Centro Danese di Medicina Rigenerativa (14/50427) e dalla Danish Cancer Society.

Tutti i metodi descritti nel protocollo sono stati approvati dal Comitato etico nazionale danese (n. 37054), dall'Autorità danese per la salute e i medicinali (numero EUDRA-CT 2013-004220-11) e dall'Agenzia danese per la protezione dei dati (2008-58-0035). Lo studio è stato registrato presso ClinicalTrials.gov (NCT02240823). Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki monitorata dall'unità di buona pratica clinica (GCP) dell'ospedale universitario di Odense. La preparazione dell'ADRC è stata effettuata in uno stabilimento dei tessuti autorizzato per la manipolazione di tessuti e cellule umani presso l'ospedale universitario di Odense (Autorità danese per la salute e i medicinali, autorizzazione n. 29035).
1. Reclutamento del paziente/partecipante
<ol><li>Per partecipare allo studio reclutare pazienti che soddisfino i seguenti criteri di inclusione.<ol>
<li>Reclutare pazienti di età superiore ai 18 anni, sessualmente attivi prima della RP e non infettati dalle malattie sessualmente trasmissibili, ad esempio l'infezione da virus dell'immunodeficienza umana, la sifilide o l'epatite.</li>
		<li>Assicurarsi che soffrano di disfunzione erettile dopo una RP che è stata eseguita a causa del cancro alla prostata. NOTA: In questo studio, i pazienti sono stati arruolati nello studio 5-18 mesi dopo la RP e sono stati inclusi indipendentemente dal metodo chirurgico: aperto / robotico assistito o nervesparing / non nervesparing.</li>
		<li>Assicurarsi che il valore dell'antigene prostatico specifico (PSA) non dovesse essere rilevabile al follow-up clinico dopo la RP.</li>
		<li>Assicurarsi che i pazienti fossero sessualmente attivi prima della RP e che esprimessero ancora il desiderio di rimanere sessualmente attivi dopo la RP. Assicurarsi che l'intervento farmacologico con un inibitore della fosfodiesterasi di tipo 5 (inibitore della PDE5 ) o un analogo sintetico della prostaglandina E1 (PGE1) sia stato provato prima di partecipare e ritenuto insufficiente.</li>
		<li>Inoltre, assicurarsi che i pazienti abbiano abbastanza grasso sottocutaneo sull'addome o sulla coscia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Escludere i pazienti dallo studio, se ci sono stati eventi gravi in anestesia durante la RP o se sono stati trattati con anticoagulanti.</li>
</ol>2. Liposuzione
NOTA: La liposuzione è un'operazione che rimuove il grasso o i lipociti dall'area sottocutanea. Questa parte del protocollo viene eseguita come una liposuzione standard e la procedura viene eseguita in condizioni sterili in una sala operatoria. Tutti gli strumenti utilizzati nell'ambito della procedura devono essere sterili e il chirurgo deve indossare scrub, camice chirurgico sterile, guanti sterili, maschera chirurgica e cappello.
<ol><li>Anestetizzare il paziente.<ol>
<li>Assicurarsi che il paziente sia in anestesia generale durante la procedura e questa parte venga eseguita da un anestesista.</li>
		<li>Disinfettare la pelle dell'addome e dello scroto con clorexidina 0,5% (spirito di clorhexidina, 96% di clorexidina digluconato medicato con etanolo 77% W/W = 83% v/v). Utilizzare un marcatore chirurgico per disegnare le aree sull'addome in cui verrà eseguita la liposuzione. L'area di solito sarà l'area tra la sinfisi e l'ombelico.</li>
	</ol></li>
	<li>Fai due incisioni larghe 6 mm nella pelle dell'addome con un bisturi (numero 11). Posizionare le incisioni simmetricamente e lateralmente dall'area di risalita della liposuzione.<ol>
<li>Metti un po 'di lubrificante come la vaselina sulle incisioni, per assicurarti che la cannula di infiltrazione scivoli dentro e fuori dalle incisioni facilmente durante la liposuzione.</li>
	</ol></li>
	<li>Introdurre una cannula di infiltrazione di dimensioni 14 G attraverso le incisioni nella pelle. Iniettare la soluzione di Kleins modificata per via sottocutanea nelle aree contrassegnate parallelamente alla superficie cutanea. Iniettare così tanta soluzione che il tessuto bersaglio diventa gonfio e sodo, o tumescente. NOTA: La soluzione di Kleins modificata è costituita da una soluzione di 1.000 mL di lattato di Ringers e 1 mg di adrenalina (epinefrina (1:1.000.000)). Non ass anestesia locale alla soluzione, in quanto potrebbe avere un impatto negativo sugli ADRC.<ol>
<li>Iniettare un volume di soluzione di Kleins modificata che corrisponde al rapporto 1:1 con il tessuto adiposo.</li>
		<li>Attendere 10 minuti per massimizzare l'effetto dell'adrenalina e ridurre la quantità di sangue nel tessuto adiposo raccolto.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire una liposuzione standard utilizzando una liposuzione a infusione a getto per raccogliere 200-300 ml di tessuto adiposo. Utilizzare cannule smussate che sono cave, a cui sono integrati un tubo di infusione e un ugello. Collegare la cannula a un dispositivo di aspirazione per la liposuzione. NOTA: Un'infusione continua di acqua a forma di ventaglio scioglie il tessuto adiposo in frammenti che possono essere facilmente aspirati attraverso l'apertura nella cannula.<ol>
<li>Introdurre una siringa da 3 mm con una punta smussata attraverso le incisioni sull'addome</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere il tessuto adiposo in un lipo-collettore per preservare il lipoaspirato in un ambiente sterile. Il lipoaspirato inizierà a separarsi dalla fase acquosa.</li>
	<li>Utilizzare siringhe sterili da 50 ml per aspirare il lipoaspirato dal lipo-collettore.<ol>
<li>Ridurre al minimo il volume di acqua aspirata nelle siringhe e avvitare un tappo sulla punta delle siringhe per mantenere sterile il tessuto adiposo.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare le siringhe con la punta verso il basso in un sacchetto di plastica sterile per iniziare la separazione del lipoaspirato dalla fase acquosa. Mettere il sacchetto in un contenitore sterile ancora con le punte rivolte verso il basso per continuare la separazione.<ol>
<li>Coprire il contenitore con un drappo sterile per fissare l'ambiente sterile durante il trasporto. NOTA: Secondo il manuale d'uso della macchina utilizzata per l'isolamento, il lipoaspirato può essere conservato fino ad un massimo di 4 ore prima dell'isolamento degli ADRC, tuttavia, lo elaboriamo sempre immediatamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Chiudere le incisioni cutanee con il materiale di sutura preferito dai chirurghi. Posizionare un indumento compressivo, un legante addominale, intorno all'addome per ridurre l'edema postoperatorio.</li>
	<li>Fare un blocco del pene iniettando 20 mL di bupivacaina 5 mg/mL contenenti 5 μg di adrenalina.<ol>
<li>Utilizzare una siringa da 20 ml e applicare con un ago da 23 G, lungo 1 1/4 di pollice.</li>
		<li>Applicare 5 ml di bupivacaina in ogni quadrante del sottocute.</li>
		<li>Iniettare la bupivacaina in due siti, uno posto ventralmente l'altro dorsalmente. Introdurre l'ago in tutta la sua lunghezza nel tessuto sottocutaneo puntando l'ago lateralmente a destra e iniettare l'anestesia mentre l'ago viene retratto. Ripetere l'iniezione puntando l'ago a sinistra. NOTA: Il paziente può ora essere svegliato dall'anestesia generale dall'anestesista.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolamento degli ADRC
NOTA: Il processo di isolamento degli ADRC viene eseguito come descritto in dettaglio nel manuale utente che segue il dispositivo (vedere Tabella dei materiali). È importante che la procedura venga eseguita in condizioni sterili per garantire che il lipoaspirato non sia esposto a contaminanti durante la purificazione degli ADRC. Il tempo necessario per l'isolamento degli ADRC dipende dal volume di lipoaspirato, ma l'intera procedura richiederà circa 2,5 ore utilizzando il dispositivo semiautomatico come descritto qui.
<ol><li>Posizionare tutti i materiali di consumo e gli enzimi in modo asettico su un tavolo coperto da un asciugamano chirurgico monouso sterile. NOTA: un kit di procedure contiene tutti i materiali di consumo e gli enzimi necessari per l'isolamento degli ADRC da un paziente. Oltre a questo, devono essere disponibili tre sacche per infusione da 37-39 °C da un litro di suonerie lattate insieme a indumenti sterili, guanti e asciugamani ed etanolo per la disinfezione. Annotare tutti i numeri di lotto di materiali di consumo ed enzimi e anche la temperatura delle suonerie lattate, quando collegate al sistema.<ol>
<li>Pulire il dispositivo con etanolo e seguendo le istruzioni del produttore</li>
		<li>Caricare il set di materiali di consumo sul dispositivo e collegare un sacchetto di suonerie lattate al sistema.</li>
		<li>Eseguire la serie di test semiautomatici (controllo del sistema e test di tenuta) prima di aggiungere il lipoaspirato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare riposare il lipoaspirato in tubi da 50 ml mentre vengono eseguiti i passaggi in 3.1. Ciò consentirà al grasso di separarsi dalla fase liquida. Annotare la quantità totale (in ml) di tessuto adiposo e utilizzarla per assicurarsi che la quantità di grasso caricato sia nell'intervallo della capacità del dispositivo.</li>
	<li>Caricare il tessuto quando richiesto dal dispositivo. La macchina ora scaricherà il liquido in eccesso e peserà la quantità di tessuto adiposo caricato prima di essere lavato con suonerie lattate.<ol>
<li>Quando il tessuto è stato lavato e drenato di nuovo, collegare una nuova sacca per infusione con suonerie lattate a 37-39 °C quando richiesto dalla macchina.</li>
		<li>Ricostituire l'enzima disponibile in commercio contenente collagenasi e proteasi in 5 mL lattato Ringers (una fiala di enzima è sufficiente per quantità di grasso fino a 270 ml).</li>
		<li>Assicurarsi che il dispositivo visualizzi la quantità di enzima (in base al peso del tessuto) da iniettare nel contenitore con il tessuto adiposo. Una volta iniettata, la digestione enzimatica che viene effettuata sotto agitazione durerà circa 20 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la digestione dei tessuti, lasciare che l'agitatore si fermi e controllare che il contenuto sia separato in due fasi: una fase gialla contenente lipidi superiori e uno strato rosa inferiore che contiene gli ADRC. Lasciare che quest'ultimo strato venga drenato nella camera di elaborazione cellulare (che va nella centrifuga incorporata nel dispositivo) del set di materiali di consumo, lasciando lo strato lipidico dietro.</li>
	<li>Lasciare che gli ADRC si concentrino nella camera di lavorazione cellulare durante più cicli di centrifugazione. Ora aggiungi 10 ml di Intravase (contiene DNasi, che aiuta ad evitare l'aggregazione nella sospensione finale ad ADRC) ricostituita in Suonerie lattate. La reazione enzimatica dura 10 minuti dopo di che gli ADRC vengono lavati. NOTA: questo passaggio è completamente automatico e la macchina informerà al termine del processo.</li>
	<li>Quando l'isolamento degli ARDRC è completato, risospese le cellule in 5 mL di Ringer Lactate. Aspirare la soluzione in una siringa da 5 ml.</li>
	<li>Montare un Luer-lock femmina a 3 vie sulla siringa da 5 mL contenente gli ADRC e aspirare 4 mL di DRDC in un'altra siringa sterile da 5 mL.</li>
	<li>Trasferire gli ultimi 1 mL in una siringa da 1 mL. Utilizzare questo 1 mL per la caratterizzazione ADRC, ad esempio, conteggio cellulare, vitalità cellulare, analisi dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso e capacità di differenziazione ADRC.</li>
	<li>Indossare un ago da 25 G sulla siringa da 5 mL contenente i 4 mL di ADRC prima di essere confezionato in un drappo sterile. Utilizzare gli ADRC per iniezione nel ricevente. In questo caso, la soluzione di ADRC conterrà in media 8,4-32,7 milioni di celle.</li>
</ol>4. Impianto degli ADRC nei corpi cavernosi
NOTA: Questa è una procedura sterile. Tutti gli strumenti devono essere sterili e la persona che inietta la soluzione contenente le cellule staminali nei corpi cavernosi deve indossare guanti sterili. Il paziente è sveglio durante questa procedura e riceverà le proprie cellule staminali. Gli ADRC vengono iniettati senza contare le cellule prima dell'iniezione.
<ol><li>Mantenere omogenea la soluzione di DRRC inclinando delicatamente la siringa fino a quando non viene iniettata nei corpi cavernosi.</li>
	<li>Posiziona un drappo di apertura sopra il pene. Posizionare un laccio emostatico alla radice del pene utilizzando un anello di vaso in silicone. Stringere il cappio e fissarlo con pinze curve pean. Rendere il laccio emostatico abbastanza stretto da fermare il flusso di sangue dal pene.</li>
	<li>Utilizzare due scambi antisettici per disinfettare la pelle del pene nel sito di iniezione (sito laterale dei corpi cavernosi). Iniettare 1 mL della soluzione contenente ADDRC, in un angolo diretto nei corpi cavernosi sul lato destro in due punti diversi, ripetere questo passaggio in seguito nel cavernoso dei corpi sinistro. Il volume totale degli ARDRC iniettati è di 4 ml.</li>
	<li>Attendere 30 minuti e quindi rimuovere il laccio emostatico.</li>
	<li>Dimettere il paziente dopo 2 ore di osservazione dopo l'iniezione di ADRCs, per garantire che il paziente sia ben recuperato dopo l'anestesia.</li>
</ol>5. Cura postoperatoria
<ol><li>Raccomandare al paziente di non fare alcuna prestazione fisica che possa aumentare la pressione sanguigna entro la prima settimana, per prevenire lo sviluppo di ematomi.</li>
	<li>Raccomandare al paziente di indossare il legante addominale per 24 ore i primi 14 giorni dopo l'intervento chirurgico e successivamente per 14 giorni durante il giorno.</li>
	<li>Trattare il dolore postchirurgico con paracetamolo orale (ad esempio, paracetamolo; 1.000 mg, 4 volte al giorno) e antinfiammatorio orale (ad esempio, ibuprofene; 400 mg 3 volte al giorno).</li>
</ol>

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</ol>

L'autore Søren P. Sheikh è CEO di Blue Cell Therapeutics, Copenhagen, Danimarca.

La procedura presentata per isolare gli ADRC non è limitata ad essere utilizzata solo per la terapia ED, ma può essere utilizzata in molteplici altre forme di trattamento ed esperimenti. Il nostro studio ha dimostrato che gli ADRC autologhi e appena isolati sono sicuri da usare e il trattamento è ben tollerabile in un follow-up di 12 mesi.
Prima di utilizzare la procedura ci sono alcune considerazioni da fare. Uno svantaggio di questa procedura è che il paziente deve essere in anestesia generale durante la liposuzione. La liposuzione è possibile eseguire in anestesia locale, ma uno studio precedente ha dimostrato che una combinazione di anestetici locali e adrenalina può avere un impatto negativo sulla crescita cellulare dei fibroblasti20. Il rischio di essere in anestesia generale è generalmente basso, ma si vede ancora un esito negativo. Questo rischio deve essere tenuto presente quando i pazienti vengono selezionati per il trattamento. La liposuzione è una procedura chirurgica e, quindi, porterà sempre a rischio di complicanze. Come con tutte le altre procedure chirurgiche, esiste il rischio di sanguinamento post-operatorio con conseguente formazione di ematomi e rischio di infezione. Alcuni dei nostri pazienti hanno anche riportato una sensibilità transitoria ridotta della pelle addominale. Una complicazione immediata della liposuzione è il sanguinamento. È noto che i pazienti rischiano di avere complicazioni sistemiche quando vengono rimosse grandi quantità di tessuto. La liposuzione in questa procedura era relativamente piccola e quindi non considerata un fattore di rischio.
Le complicanze all'iniezione di cellule sono riportate come arrossamento transitorio, tenerezza ed ematomi.
Il dispositivo utilizzato per l'isolamento degli ADRC, è stato scelto perché il sistema è omologato CE. In Danimarca, è obbligatorio utilizzare apparecchiature approvate CE perché le autorità classificano il trattamento con cellule staminali come uno studio di test antidroga, quando l'ADRC viene utilizzato per l'iniezione nell'uomo.
Il dispositivo presenta vantaggi come la standardizzazione dell'intera procedura ed esecuzione in un ambiente sterile chiuso senza richiedere un laboratorio altamente classificato. Il rischio di contaminazione è quindi ridotto. Ciò garantisce che la procedura sia uniforme e riproducibile e che la qualità del prodotto finale sia sempre la stessa ogni volta (tuttavia, dipende anche dalla qualità del tessuto in ingresso). Eseguire l'isolamento sul dispositivo è facile e non richiede operatori appositamente istruiti.
Una limitazione del dispositivo è che l'ingresso minimo nella macchina è di 100 g di lipoaspirato drenato. Poiché la liposuzione è completamente terminata prima che inizi l'elaborazione cellulare (e nel nostro caso, in una posizione diversa, non in sala operatoria) nella nostra esperienza, ciò richiederà che la quantità di lipoaspirato sia di almeno 125 ml utilizzando la misura approssimativa delle siringhe da 50 ml. Altrimenti c'è il rischio che non ci sia abbastanza materiale per la macchina con cui procedere. Inoltre, l'utilizzo del limite finale superiore (l'ingresso massimo è di 425 ml) comporterebbe una procedura di isolamento molto lunga.
Le cellule staminali adulte sia dal tessuto adiposo che dal midollo osseo sembrano avere capacità di auto-rinnovamento e differenziazione come le cellule staminali embrionali. Uno dei vantaggi delle ADRC rispetto alle cellule staminali emopoietiche è una resa 100-500 volte superiore per volume tissutale rispetto al midollo osseo21,22 e, pertanto, le ADRC non hanno bisogno di essere coltivate. Inoltre, le cellule staminali emopoietiche sono più difficili e più dolorose da raccogliere dal paziente rispetto al tessuto adiposo. In molte situazioni, il tessuto adiposo è solo un prodotto di scarto dopo l'intervento chirurgico. È possibile coltivare cellule staminali per dare una resa più elevata adatta all'angiogenesi, tuttavia gli ADRC appena isolati possono avere un potenziale angiogenico più elevato rispetto aquelli coltivati 23.

Le cellule staminali hanno la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule e secernono fattori paracrini che si pensa promuovano il processo di guarigione nel tessuto danneggiato 1,2,3,4. Sono, quindi, attraenti nel campo della medicina rigenerativa, perché possono rappresentare un possibile trattamento curativo.
La prostatectomia radicale (RP) è il trattamento curativo d'oro per i pazienti con carcinoma prostatico localizzato a basso / intermedio rischio e un'aspettativa di vita > 10 anni. Lo scopo dell'intervento chirurgico è l'eradicazione del cancro, ma ha diversi effetti collaterali. La prevalenza dell'incontinenza post-prostatectomia varia dal 2-60% e la disfunzione erettile (DE) è sperimentata dal 20-90% dei pazienti5. La tecnica nerve-sparing è un'opzione in alcuni pazienti (punteggio di Gleason < 7, basso rischio di malattia extracapsulare)5. Questa tecnica risparmia i nervi responsabili dell'erezione, ma anche se questo è possibile, molti pazienti riportano ancora ED postoperatorio.
Le opzioni di trattamento per la riabilitazione del pene dopo RP consistono principalmente nel trattamento con inibitori della PDE-5, nella terapia di iniezione o instillazione e nelle pompe per vuoto. I farmaci utilizzati per la riabilitazione del pene differiscono farmacologicamente, ma il loro meccanismo d'azione include il rilassamento delle cellule muscolari lisce nel corpo cavernoso. Tuttavia, molti pazienti sperimentano il fallimento del trattamento e non ottengono mai un effetto del farmaco che consente il rapporto sessuale6.
Si ritiene che l'ED che si verifica dopo RP sia dovuto a cambiamenti strutturalmente irreversibili7. Questi cambiamenti si verificano nel tessuto cavernoso e includono l'apoptosi della muscolatura liscia e delle cellule endoteliali e la fibrosi. Il meccanismo veno-occlusivo che è responsabile di una parte centrale dell'erezione, è compromesso dai cambiamenti, con conseguente riempimento e durezza del pene7.
Molti dei pazienti riferiscono che l'ED che sperimentano ha un impatto negativo sulla loro qualità di vita8. Non sono pronti a rinunciare alla loro attività sessuale dopo l'intervento chirurgico e, quindi, una terapia curativa per la disfunzione erettile è attraente, quando gli altri trattamenti disponibili per la riabilitazione del pene falliscono.
In studi precedenti, tra cui animali e piccoli studi di fase 1 sull'uomo, le cellule staminali hanno mostrato risultati promettenti come trattamento alternativo per ED 2,9,10,11,12. I risultati mostrano che è sicuro usare gli ADRC e che la funzione erettile è significativamente migliorata dopo una singola iniezione nei corpi cavernosi 2,9,10,11,12. Si ritiene che le cellule rigenerative di derivazione adiposa (ADRC) supportino la rigenerazione dei tessuti attraverso meccanismi paracrini attraverso la liberazione di più ormoni, fattori di crescita neurotrofici e di altro tipo, citochine e, possibilmente, micro-RNA13. Inoltre, gli ADRC sono in grado di differenziarsi in diversi tipi di cellule mature tra cui cellule muscolari endoteliali e vascolari, cellule cartilaginee, osteociti e neuroni14,15. Queste proprietà rendono le cellule staminali interessanti per lo sviluppo di un nuovo trattamento permanente per la disfunzione erettile.
Le cellule staminali sono divise in diversi gruppi, fondamentalmente quelli derivati dall'embrione precoce (cellule staminali embrionali) e quelle dal tessuto adulto (cellule staminali adulte). Le cellule staminali adulte includono cellule staminali mesenchimali (MSC) che sono multipotenti e possono essere trovate nel midollo osseo, nel tessuto adiposo, nel sangue del cordone ombelicale, nella placenta e nella polpa dentale17.
Le cellule staminali del tessuto adiposo sono di facile accesso, a differenza delle cellule staminali derivate dal midollo osseo. La raccolta di cellule staminali dal midollo osseo è una procedura rischiosa e dolorosa rispetto alla liposuzione. Il numero di cellule che è possibile prelevare dal midollo osseo sarà limitato, mentre solo i depositi di tessuto adiposo del paziente stabiliscono il limite per il numero di cellule che possono essere raccolte. È quindi possibile isolare una grande quantità di cellule staminali dal tessuto adiposo senza una successiva necessità di coltivare le cellule per ottenere una quantità soddisfacente. Le cellule rigenerative di derivazione adiposa, spesso indicate anche come frazione vascolare stromale (SFV), sono composte da molti tipi di cellule tra cui MSC, cellule endoteliali, periciti, cellule immunitarie e progenitori qui di18. Questi possono tutti svolgere un ruolo nel processo rigenerativo.
Lo scopo del presente studio è quello di studiare l'effetto delle cellule staminali sulla disfunzione erettile dopo RP utilizzando 4 ml di DRDC autologhi isolati da tessuto adiposo appena raccolto dopo l'iniezione nel corpo cavernoso.

<table><tbody><tr><td><forte>Liposuzione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fasciante addominale</td><td>Dale</td><td></td><td>Dimensioni dipendenti dal paziente</td></tr><tr><td>Asciugamano OP adesivo</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>Adrenalina 1 mg/ml</td><td>Amgros I/s</td><td>74 44 23</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Forniture OP di base</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>97010873-07</td><td></td></tr><tr><td>lama in acciaio al carbonio 11</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>clorossidina etanolo</td><td>Faarborg Pharma</td><td>5% colorato</td><td></td></tr><tr><td>Set monouso Lipocollector 3</td><td>Human Med</td><td>670200</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di prolunga</td><td>Extrudan</td><td></td><td>5,8/8,3 mm, Ch 25, 3,5 M di lunghezza</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Rags Barrier</td><td>175201</td><td>30x45 cm</td></tr><tr><td>Jelonet</td><td>Smith and Nephew Medical Ltd</td><td>90509225</td><td>10 x 10 cm</td></tr><tr><td>Marcaina 5 mg/ml + Adrenalina 5 micrigrammi</td><td>Astra Zeneca</td><td></td><td>20 ml</td></tr><tr><td>Mesorb Bendaggio</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>677001</td><td>10x13 cm</td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td>18 G + 23 G</td></tr><tr><td>Sutura monocryl</td><td>Ethicon</td><td></td><td>04:00</td></tr><tr><td>Ringer-lactat</td><td>Fresinus Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili</td><td>Gammex</td><td>330052065</td><td></td></tr><tr><td>Camice chirurgico</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>690103-01</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore chirurgico</td><td>Richard-Allan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maschera chirurgica</td><td>Siringa 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Codan Medical</td><td>6,28,402</td><td>50/60 ml punta di catetere</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Becton Dickinson</td><td>700016181</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>WAL- Applikator per cannule 25/30 cm</td><td>Human Med</td><td>REF 500001</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolamento di ADRC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Siringa</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 303172</td><td></td></tr><tr><td>rubinetto a 3 vie</td><td>One Med</td><td>REF 10554-01</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo OP-asciugamano</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care AB</td><td>REF 906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>Cytori Celution 800IV dispositivo</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desinfection sostituisce</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>25G (0,5*25 mm)</td></tr><tr><td>Nitril Guanti</td><td>Abena</td><td></td><td>senza polvere</td></tr><tr><td>O telo per telo, 2 strati</td><td>Lohmann & Rauscher</td><td>REF 33005</td><td></td></tr><tr><td>Ringers Lattato</td><td>Fresinus Kabi</td><td>06756 (DK)</td><td></td></tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td><td></td>sterili</tr><tr><td>Camice</td><td></td><td></td><td></td>sterile</tr><tr><td>Kit supplementare per Cytori Celution 800IV dispositivo</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termometro</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>tracciabile</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di ADRC's</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aperture drape</td><td>One Med</td><td>REF1565-01</td><td>75*90 cm</td></tr><tr><td>Scambio di disinfezione</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Pean</td><td>Leibinger</td><td>32-01257</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Vessel Loop</td><td>Viola Chirurgico</td><td>REF PS3203</td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili</td><td>Sempermed</td><td></td><td>O Usa il tuo preferito</td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule rigenerative di derivazione adiposa per il trattamento della disfunzione erettile a seguito di prostatectomia radicale

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Le cellule staminali sono utilizzate in molte aree di ricerca all'interno della medicina rigenerativa in parte perché questi trattamenti possono essere curativi piuttosto che sintomatici. Le cellule staminali possono essere ottenute da diversi tessuti e sono stati descritti diversi metodi per l'isolamento. Il metodo presentato per l'isolamento delle cellule rigenerative di derivazione adiposa (ADRC) può essere utilizzato all'interno di molte aree terapeutiche perché il metodo è una procedura generale e, quindi, non limitata alla terapia della disfunzione erettile (DE). La disfunzione erettile è un effetto collaterale comune e grave della prostatectomia radicale (RP) poiché la disfunzione erettile spesso non è ben trattata con la terapia convenzionale. L'uso di ADRC come trattamento per la disfunzione erettile ha attirato grande interesse a causa dei risultati positivi iniziali dopo una singola iniezione di cellule nei corpi cavernosi. Il metodo utilizzato per l'isolamento degli ADRC è un processo semplice, automatizzato, riproducibile e che garantisce un prodotto uniforme. Inoltre, la sterilità del prodotto isolato è garantita perché l'intero processo avviene in un sistema chiuso. È importante ridurre al minimo il rischio di contaminazione e infezione poiché le cellule staminali vengono utilizzate per l'iniezione negli esseri umani. L'intera procedura può essere eseguita entro 2,5-3,5 ore e non richiede un laboratorio classificato che elimina la necessità di spedire il tissue a un off-site. Tuttavia, la procedura presenta alcune limitazioni poiché la quantità minima di lipoaspirato drenato per il funzionamento del dispositivo di isolamento è di 100 g.

La procedura presentata è stata utilizzata per uno studio clinico di fase 1 in aperto che ha coinvolto 21 pazienti19. L'endpoint primario dello studio era la sicurezza dell'uso di ADRC nell'uomo e l'endpoint secondario era l'effetto dell'ADRC sulla funzione erettile.
Ventuno uomini sono stati inclusi nello studio con un'età media di 60 anni (range 46-69) e un'erezione normale e una vita sessuale attiva prima della RP a causa del cancro alla prostata. Tutti hanno sofferto di disfunzione erettile dopo la RP, senza segni di recupero dalla medicina disponibile per la riabilitazione del pene. Sei uomini soffrivano di incontinenza come effetto collaterale alla RP. Tutti gli uomini hanno ricevuto una singola iniezione intracavernosa di ADRC isolata con il metodo presentato.
Tutti i 21 uomini sono stati seguiti con 4 visite in ambulatorio a 1,3,6 e 12 mesi dopo l'iniezione. La funzione sessuale è stata valutata con questionari convalidati – l'International Index of Erectile Function-5 (IIEF-5) e l'Erection Hardness Score (EHS) (allegati come appendici).
Non si sono verificati eventi gravi durante il periodo di osservazione. Otto uomini hanno riportato arrossamento transitorio e gonfiore nei siti di iniezione, tre hanno riportato reazioni nell'area del pene. Sono stati riportati otto eventi minori reversibili correlati alla liposuzione come leggero disagio addominale ed ematomi addominali minori. Nessun paziente ha riportato disagio al follow-up di 1 mese. Otto su quindici (53%) nel gruppo continentale hanno riferito che la funzione erettile era sufficiente per il rapporto sessuale a 12 mesi. Il gruppo di 6 uomini incontinenti non ha mostrato alcun miglioramento della funzione erettile.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Continente</td>
			<td>Incontinente</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pazienti inclusi</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Effetto significativo</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: La tabella mostra le differenze nell'effetto significativo del trattamento tra pazienti continentali e incontinenti.

La divulgazione precisa di metodi e protocolli è fondamentale per l'adozione su larga scala delle terapie con cellule staminali. Qui, presentiamo un protocollo per isolare le cellule rigenerative di derivazione adiposa, utilizzate per una singola iniezione intracavernosa come trattamento della disfunzione erettile (DE) a seguito di prostatectomia radicale (RP).

Isolamento di cellule rigenerative di derivazione adiposa per il trattamento della disfunzione erettile a seguito di prostatectomia radicale

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

Questa tecnica di isolamento può essere utilizzata per esplorare se le cellule staminali adipose possono aiutare i pazienti a rigenerare la funzione erettile dopo la prostatectomia radicale. Questo metodo non è limitato per una malattia specifica. Potrebbe essere utilizzato in tutte le aree della ricerca sulle cellule staminali adipose.Le cellule staminali isolate sono usate per trattare la disfunzione erettile, ma la tecnica di isolamento è una procedura generale e le cellule staminali possono essere utili in altre aree all'interno della ricerca sulle cellule staminali. Inizia disinfettando la pelle dell'addome e dello scroto con lo 0,5% di clorexidina. Utilizzare un marcatore chirurgico per disegnare le aree sull'addome in cui verrà eseguita la liposuzione, di solito l'area tra la sintesi e l'ombelico.Fai due incisioni larghe sei millimetri nella pelle dell'addome con un bisturi numero 11. Posizionare le incisioni simmetricamente e lateralmente dall'area disegnata verso l'alto della liposuzione. Posizionare un po 'di lubrificante sulle incisioni per assicurarsi che la cannula di infiltrazione scivoli dentro e fuori dalle incisioni facilmente durante la liposuzione.Quindi introdurre una cannula di infiltrazione di calibro 14 attraverso le incisioni nella pelle. Iniettare la soluzione di Klein modificata per via sottocutanea nelle aree contrassegnate parallelamente alla superficie cutanea fino a quando il tessuto bersaglio diventa gonfio e sodo o tumescente. Iniettare un volume di soluzione di Klein modificata in un rapporto uno-a-uno al tessuto adiposo.Attendere 10 minuti per massimizzare gli effetti dell'adrenalina e ridurre la quantità di sangue nel tessuto adiposo raccolto. Eseguire una liposuzione standard per infusione a getto per raccogliere da 200 a 300 millimetri di tessuto adiposo. Utilizzare cannule smussate che sono cave con un tubo di infusione integrato e un ugello.Collegare la cannula a un dispositivo di aspirazione per la liposuzione. Introdurre una siringa da tre millimetri con una punta smussata attraverso le incisioni sull'addome e raccogliere il tessuto adiposo nel Lipo Collector per preservare il lipoaspirato in un ambiente sterile. Il lipoaspirato inizierà a separarsi dalla fase acquosa.Utilizzare siringhe sterili da 50 millilitri per aspirare il lipoaspirato dal LipoCollector, riducendo al minimo il volume di acqua aspirata nelle siringhe. Avvitare un tappo sulla punta delle siringhe per mantenere sterile il tessuto adiposo. Posizionare le siringhe con la punta verso il basso in un sacchetto di plastica sterile per iniziare la separazione del lipoaspirato dalla fase acquosa.Quindi posizionare il sacchetto in un contenitore sterile. Coprire il contenitore con un drappo sterile per fissare l'ambiente sterile durante il trasporto. Chiudere le incisioni cutanee con il materiale di sutura preferito dal chirurgo.Posizionare un indumento compressivo intorno all'addome per ridurre l'edema postoperatorio. Per fare un blocco del pene, iniettare la bupivacaina in due siti, uno posto ventralmente e l'altro dorsalmente. Introdurre l'intero ago nel tessuto sottocutaneo, puntandolo lateralmente a destra, e iniettare l'anestesia mentre l'ago viene retratto.Ripetere l'iniezione, puntando l'ago a sinistra. Posizionare tutti i materiali di consumo e gli enzimi in modo asettico sul tavolo coperto da un asciugamano chirurgico monouso sterile. Pulire il dispositivo con etanolo e caricare il set di materiali di consumo.Quindi collegare un sacchetto di suonerie lattate al sistema. Eseguire la serie di test semiautomatici prima di aggiungere il lipoaspirato. Mentre il dispositivo è in fase di preparazione, lasciare riposare il lipoaspirato in un tubo da 50 millilitri per consentire al grasso di separarsi dalla fase liquida.Prendere nota della quantità totale di tessuto adiposo e utilizzarla per garantire che la quantità totale di grasso caricato rientri nell'intervallo della capacità del dispositivo. Caricare il tessuto quando richiesto dal dispositivo. La macchina scaricherà il liquido in eccesso.Pesare la quantità di tessuto adiposo e lavarlo con suonerie lattate. Quando il tessuto è stato lavato e drenato, collegare una nuova sacca per infusione con suonerie lattate da 37 a 39 gradi Celsius. Ricostituire l'enzima disponibile in commercio contenente collagenasi e proteasi in cinque millilitri di suonerie allattate.Assicurarsi che il dispositivo visualizzi la quantità di enzima da iniettare nel contenitore con il tessuto adiposo. Una volta iniettata la digestione enzimatica durerà circa 20 minuti. Dopo la digestione dei tessuti, controllare che il contenuto sia separato in un lipide superiore contenente fase gialla e uno strato rosa inferiore che contiene le cellule rigenerative di derivazione adiposa o ADRC.Lasciare che lo strato rosa dreni nella camera di elaborazione cellulare del set di materiali di consumo, lasciando lo strato lipidico dietro. Consentire agli ARDC di concentrarsi nella camera di elaborazione cellulare durante più cicli di centrifugazione. Quindi aggiungere 10 millilitri di intrabase ricostituiti nelle suonerie lattate.La reazione enzimatica dura 10 minuti e gli ARDRC vengono lavati in seguito. Quando l'isolamento degli ADRC è completato, sospendere nuovamente le cellule in cinque millilitri di lattato di Ringer e aspirare la soluzione in una siringa da cinque millilitri. Montare un lucchetto femmina di stopcock a tre vie Luer lock sulla siringa e aspirare quattro millilitri di DRDC in un'altra siringa sterile da cinque millilitri.Trasferire l'ultimo millilitro di DRRC in una siringa da un millilitro. Utilizzare questa aliquota per le analisi di caratterizzazione ADRC, come la conta cellulare, la vitalità cellulare, l'analisi dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso e la capacità di differenziazione ADRC. Mettere un ago calibro 25 sulla siringa da cinque millilitri contenente i quattro millilitri di DRDC.Quindi imballarlo in un drappo sterile. Questa soluzione di ADRC verrà iniettata nel ricevente e dovrebbe contenere in media da 8,4 a 32,7 milioni di cellule. Assicurarsi che la soluzione di ADRC rimanga omogenea inclinando delicatamente la siringa fino a quando non viene iniettata nel corpo cavernoso.Posiziona un drappo di apertura sopra il pene. E un laccio emostatico alla radice del pene con un anello di vaso in silicone. Stringere il cappio e fissarlo con una pinza, rendendo il laccio emostatico abbastanza stretto da fermare il flusso di sangue dal pene.Utilizzare due tamponi antisettici per disinfettare la pelle del pene nel sito di iniezione. Quindi iniettare un millilitro della soluzione ADRC in un angolo diretto nel corpora cavernoso, sul lato destro in due punti diversi. Ripeti questo passaggio nel cavernoso dei corpora sinistro, iniettando un volume totale di quattro millilitri.Questo metodo è stato testato in uno studio clinico di fase uno in aperto su 21 uomini con un'età media di 60 anni e un'erezione normale e una vita sessuale attiva prima di una prostatectomia radicale. Sei degli uomini soffrivano anche di incontinenza. Tutti gli uomini hanno ricevuto una singola iniezione inter cavernosa di ADRC isolati e sono stati seguiti con quattro visite in ambulatorio a 1, 3, 6 e 12 mesi dopo l'iniezione.Non si sono verificati eventi gravi durante il periodo di osservazione. Otto uomini hanno riportato arrossamento transitorio e gonfiore nei siti di iniezione e tre hanno riportato reazioni nell'area del pene. Otto uomini hanno sperimentato eventi minori reversibili legati alla liposuzione, come leggero disagio addominale ed ematomi addominali minori.Nessun paziente ha riportato disagio al follow-up di un mese. La loro funzione sessuale è stata valutata con l'International Index of Erectile Function Five e l'Erection Hardness Score. Otto uomini su 15 nel gruppo continentale hanno riferito che la loro funzione erettile era sufficiente per il rapporto sessuale a 12 mesi.Il gruppo di sei uomini incontinenti non ha mostrato alcun miglioramento della funzione erettile Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che gli enzimi utilizzati durante la procedura di isolamento devono essere portati fuori dal congelatore o dal frigorifero due ore prima dell'inizio della procedura. I risultati di questa tecnica hanno spianato la strada a un RCT in cui gli effetti delle cellule staminali adipose sono esplorati su una scala più ampia.

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