Isolando il maligno e le cellule di B Non-maligna da lck:eGFP Zebrafish

Recentemente abbiamo scoperto che molte cellule B nel pesce zebra LCK GFP esprimono bassi livelli di GFP. Questo rende questa linea uno strumento utile per studiare le cellule B e le cellule T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ora possiamo studiare cellule B e cellule T dal pesce zebra LCK GFP o possiamo studiare cellule B-ALL e T-ALL da pesci con cancro.

Questi metodi consentono lo sviluppo di cellule B e studi B-ALL sul pesce zebra. Che sono rilevanti per comprendere il sistema immunitario adattivo e le loro neoplasie maligne comuni nel cancro pediatrico. Se non hai mai fatto queste dissezioni prima potresti voler perfezionare la tua tecnica alcune volte fino a quando non puoi ottenere buoni campioni di timo e midollo.

La dimostrazione visiva aiuterà gli spettatori a riconoscere il fluoro e il B-ALL nei pesci e a selezionare le impostazioni corrette per discriminare le cellule B e T per il loro isolamento. Dopo l'anestesia con 0,02%Tricaina nell'acqua del sistema ittico utilizzare il filtro GFP su un microscopio a epifluorescenza per esaminare il pesce zebra di due o sei mesi per il timo fluorescente all'aspetto mediale dorsale della cavità branchiale. Dopo aver individuato il timo, mettere il pesce eutanasiato in una piastra di Petri e utilizzare il microscopio fluorescente per rimuovere il timo positivo della GFP.

E impostazioni di microscopia a campo brillante per raccogliere il midollo renale e la milza. Posizionare ogni organo raccolto in un tubo da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di mezzo di cernita a freddo e utilizzare un omogeneizzatore di microtubi pestello per omogeneizzare i tessuti sul ghiaccio. Quindi, filtrare il tessuto omogeneizzato attraverso un filtro a rete da 35 micrometri per generare una singola sospensione cellulare e posizionare le cellule sul ghiaccio.

A partire da due o quattro mesi utilizzare un microscopio fluorescente per schermare il pesce EGFP a doppia transgenica rag2:hMYC LCK utilizzando impostazioni a bassa esposizione per identificare la leucemia linfoblastica acuta delle cellule T luminose o T-ALL e impostazioni di esposizione elevata per identificare gli animali B-ALL fiochi. Il controllo del tipo selvaggio e il pesce pre-leucemico hanno la GFP localizzata solo nel timo. Categorizzare il pesce in base all'estensione della fluorescenza GFP utilizzando un semplice sistema a tre categorie.

I pesci di primo livello dimostrano un segnale fluorescente come un tumore timico con una diffusione locale limitata. I pesci di livello due dimostrano un segnale fluorescente oltre il timo che coinvolge meno del 50% del corpo. E i pesci di livello tre dimostrano un segnale fluorescente che si estende oltre il 50% del corpo.

Separare il pesce con ALL da quelli senza cancro. E monitorare il pesce pre-leucemico senza tumori positivi alla GFP una volta al mese per lo sviluppo di nuovi ALL. Per l'isolamento cellulare T o B-ALL utilizzare una lama di rasoio per rimuovere la testa e la regione timica di un pesce di livello tre eutanasiato e posizionare il corpo in una piastra di Petri.

Utilizzare una pipetta P-1000 per lavare la cavità peritoneale del pesce con 500 microlitri di mezzo di cernita a freddo, raccogliendo le cellule e il mezzo in un tubo da cinque millilitri. Utilizzando una punta di pipetta fresca iniettare da due a tre volumi aggiuntivi da 200 a 300 microlitri di mezzo di cernita a freddo nella cavità corporea e utilizzare la punta della pipetta per applicare una leggera pressione sul corpo del pesce per estrudere le cellule dalla cavità corporea nel tubo a cinque millilitri. Quindi, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a rete da 35 microliter.

E posizionare le cellule sul ghiaccio fino alla loro analisi per citometria del flusso. Per l'omogeneizzazione di tutto il corpo utilizzare un omogeneizzatore di microtubi pestello per omogeneizzare il corpo del pesce e aggiungere altri 300 microlitri di mezzo di cernita a freddo al tubo. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a rete da 35 micrometri, lavando il filtro con un mezzo di smistamento aggiuntivo se necessario fino a quando sul filtro rimangono solo detriti tissutali.

Quindi, posizionare le cellule sul ghiaccio fino alla loro analisi. Per l'analisi citometrica del flusso delle celle isolate impostare i parametri del citometro di flusso secondo le linee guida del produttore. E acquisire da 10.000 a 50.000 eventi per impostare i parametri di dispersione e dispersione laterale in avanti per definire le porte cellulari dei linfociti e dei progenitori ed escludere i detriti cellulari.

Escludere i farsettali cellulari e utilizzare i cancelli linfoidi e/o precursori per determinare il numero e la percentuale delle cellule positive della GFP. L'uso della ficoertrarina e le intensità della GFP definiscono le porte per le cellule negative della GFP rispetto alle cellule basse della GFP rispetto alle cellule alte della GFP. Imparare dove posizionare i cancelli per isolare le cellule basse e alte del GFP è fondamentale per ottenere popolazioni di cellule B e T pure.

Due distinte popolazioni positive della GFP, cellule GFP basse B e cellule GFP ad alto T possono essere ottenute dal timo. Le cellule B residenti nel midollo renale di zebrafish di tre mesi esprimono bassi livelli di GFP. Le cellule alte della GFP sono scarse, tuttavia, il che indica che solo una piccola percentuale di linfociti T è presente nel midollo a tre mesi di età.

Allo stesso modo, i campioni splenici mostrano percentuali più elevate di GFP basse rispetto alle cellule alte della GFP. Nei pesci a doppia transgenica che non hanno ancora sviluppato leucemia linfoblastica acuta, l'espressione della GFP nel timo, nel midollo e nella milza è simile a quella osservata nei pesci LCK EGFP monotrasgenici. Tuttavia, il numero di linfociti per organo è aumentato.

Presumibilmente, a causa dell'espansione guidata dal MYC delle popolazioni di cellule B e T immature in cui il promotore rag2 è attivo. Nei pesci a doppia transgenica con B e o T-ALL che hanno sviluppato tumori fluorescenti di sei mesi B-ALL sono malati di tumori fluorescenti contenenti principalmente cellule basse GFP. Al contrario, i pesci fluorescenti possono ospitare popolazioni isolate di T-ALL o miste di cellule T-ALL basse e GFP basse di GFP.

Infatti, come valutato dall'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi, le cellule basse GFP esprimono livelli più elevati di trascrizioni di cellule B. E le cellule alte della GFP esprimono livelli più elevati di geni cellulari T, LCK e il marcatore GFP. È fondamentale imparare a riconoscere il pesce con B-ALL per microscopia.

E come definire correttamente le porte di citometria del flusso per separare le popolazioni basse e gfp alte. Seguendo questa procedura, è possibile isolare DNA, RNA o proteine da cellule basse gfp e gfp alte per PCR, sequenziamento, ciò che c'è nel sangue o esperimenti di trapianto in vivo. Una volta appreso che i pesci LCK GFB hanno cellule B fluorescenti oltre alle cellule T, potremmo studiare entrambi i tipi di cellule dello stesso animale per valutare B e T-ALL.