Name: Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Scopri il protocollo di screening monoibrido lievito avanzato per identificare i fattori di trascrizione che si legano a sequenze di DNA umano. Questo metodo consente di analizzare oltre 1.000 fattori di trascrizione in un singolo esperimento.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [R35-GM128625 a J.I.F.B.].

1. preparati
<ol><li>
Piastre di SC −U −H (150mm di Petri) Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la coltivazione i ceppi di lievito DNA-esca.<ol>
<li>Sciogliere il drop-out mix, lievito azoto base (YNB), adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 920 mL di acqua e pH 5.9 con 5 M NaOH (circa 1 mL per litro di media; si veda tabella 2 per la composizione). Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.</li>
		<li>In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 950 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).</li>
		<li>Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.</li>
		<li>Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta. Aggiungere il glucosio, mescolare bene su un piatto di mescolare e raffreddare a 55 ° C in un bagno d'acqua.</li>
		<li>Aggiungere la leucina ed il triptofano ai media. Mescolare bene su un piatto di mescolare e versare in Petri sterili 150 mm (~ 80 mL per ogni piatto). Secco per 3 – 5 giorni a temperatura ambiente, avvolgere in sacchetti di plastica e conservare a temperatura ambiente fino a 6 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lastre rettangolari YAPD Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la coltivazione di prato per il ceppo di DNA-esca e per l'accoppiamento con la raccolta di matrice TF.<ol>
<li>Dissolvere polveri (Vedi tabella 3 per composizione), ad eccezione di agar, in 950 mL di acqua in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.</li>
		<li>In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 950 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).</li>
		<li>Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.</li>
		<li>Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta.</li>
		<li>Aggiungere il glucosio, mix bene su una piastra di mescolare e lasciare raffreddare a 55 ° C. Versare le piastre rettangolari di media (Vedi Tabella materiali; ~ 70 mL per piastra) utilizzando una pompa peristaltica (5 mL/sec) e un tubo di 6 mm. Secco per 1 giorno a temperatura ambiente, avvolgere in sacchetti di plastica e riporre in camera fredda per fino a 6 mesi. Nota: Anche se il volume dei supporti suggeriti è 70 mL per piastra, 50 – 80 mL per piastra può essere utilizzato. I tre punti critici da considerare quando versando le piastre sono 1) che sono livellate in modo che i media di agar ha lo stesso spessore in tutta la piastra (utilizzare livellato tavolo o una superficie per il versamento della piastra e non versare in pacchi da più di sette) 2) per garantire l'assenza di bolle nell'agar media (bolle dovrebbero essere spuntate con un ago sterile) e 3) le piastre di secchezza per un solo giorno e le piastre d'imballaggio in sacchetti di plastica per evitare rotture in aggiunta di lievito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −Trp e Sc −U −Trp piastre rettangolari Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la raccolta di matrice TF (Sc −Trp) in crescita e per selezionare diploide lievito dopo l'accoppiamento (Sc −U −Trp).<ol>
<li>Sciogliere il mix di abbandono, YNB, adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 920 mL di acqua e pH 5.9 con NaOH 5M (circa 1 mL per litro di media) (Vedi tabella 4 per composizione). Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.</li>
		<li>In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 950 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).</li>
		<li>Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.</li>
		<li>Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta. Aggiungere il glucosio, mescolare bene su un piatto di mescolare e raffreddare fino a 55 ° C.</li>
		<li>Aggiungere la leucina, l'istidina e l'uracile (omettere l'uracile per le piastre di −Trp −U Sc).</li>
		<li>Mescolare bene su un piatto di mescolare e versare in lastre rettangolari (~ 70 mL per piastra) utilizzando una pompa peristaltica (5 mL/sec) e tubi di 6 mm. Asciugare per 1 giorno a temperatura ambiente, avvolgere le piastre in sacchetti di plastica e conservare in camera fredda fino a 3 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −U −H −Trp + 3AT + piastre rettangolari X-gal Nota: queste piastre verranno utilizzate come piastre di lettura per le analisi di eY1H.<ol>
<li>Sciogliere il mix di abbandono, YNB, adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 850 mL di acqua (vedere tabella 5 per composizione). Fare non pH. Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.</li>
		<li>In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 850 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).</li>
		<li>Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.</li>
		<li>Preparare 10 x BU sali (1L) combinando 900 mL di acqua, 70 g di Na2HPO4∙7H2O e 34,5 g di NaH2PO4∙H2O. Mix utilizzando un ancoretta dissolvere polveri e regolare il pH a 7.0 utilizzando 5 M NaOH. Aggiungere acqua per portare a 1 L e autoclave.</li>
		<li>Preparare la soluzione X-gal aggiungendo un tubo di plastica da 50 mL contenente 42,5 mL di dimetilformammide 3,5 g di polvere di X-gal. Aggiungere polvere di X-gal a dimetil formammide per sciogliere più facilmente (tempo di percorrenza 30 min). Mantenere la soluzione stock al buio (l'uso del tubo opaco 50 ml o copertina in carta stagnola). Conservare a-20 ° C.</li>
		<li>Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta. Aggiungere il glucosio e le 10 x BU sali (vedere tabella 5 per composizione), mescolare bene su un piatto di mescolare e raffreddare fino a 55 ° C.</li>
		<li>Aggiungere la leucina, 3AT e il X-gal (vedere tabella 5 per composizione).</li>
		<li>Mescolare bene su un piatto di mescolare e versare nei piatti rettangolari (~ 70 mL per piastra) utilizzando una pompa peristaltica (5 mL/sec) e un tubo di 6 mm. Secco per 1 giorno a temperatura ambiente, avvolgere in sacchetti di plastica e riporre nella stanza fredda rivestita in lamina di alluminio (3AT e X-gal sono sensibili alla luce) per fino a 1 mese.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spotting una matrice TF
<ol><li>
La matrice di TF-preda di scioglimento
	<ol>
<li>Scongelare le piastre stock di glicerolo di lievito con la matrice di TF-preda sul ghiaccio. Nota: TF-preda matrici possono essere generate come precedentemente pubblicati10,12,13,18.</li>
		<li>Risospendere il lievito usando una pipetta di 12 canali entro 1 – 3 min prima del passaggio successivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spotting il lievito in Sc −Trp lastre rettangolari
	<ol>
<li>Nel robot HDA (Vedi Tabella materiali), selezionare Multi-96 pozzetti come fonte, 96 piastre di agar come destinazione e lungo 96 pin pad. Nota: Rilievi di pin non sono riutilizzabili e dovrebbero essere scartati.</li>
		<li>Selezionare il programma Replicare molti di fare due copie a piastra a 96 pozzetti. Non utilizzare il riciclo o rivisitare opzioni per evitare la contaminazione posteriore delle scorte congelate.</li>
		<li>Selezionare l'opzione a girare su e giù nell'origine di mescolare il lievito.</li>
		<li>Borsa la matrice maculata e incubare agar lato fino a 30 ° C per 2 – 3 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generazione di 384 matrici di Colonia in lastre rettangolari di Sc −Trp
	<ol>
<li>Nel robot, selezionare 96 piastre di agar come fonte, 384 piastra di agar come destinazione e 96 breve pin pad.</li>
		<li>Selezionare il programma matrice 1:4 . In questo modo, piastre quattro 96 Colonia (ognuno dei quali contiene un diverso TF) saranno consolidate nella piastra una 384 Colonia. Non utilizzare il riciclo o rivisitare opzioni per evitare la contaminazione tra diversi piatti.</li>
		<li>Le piastre del sacchetto e incubare lato agar maculato 384-Colonia matrice fino a 30 ° C per 2 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generazione di 1.536 matrici di Colonia in lastre rettangolari di Sc −Trp Nota: Questo si tradurrà in matrici che contengono quattro colonie per ogni TF-preda.<ol>
<li>Nel robot, selezionare 384 piastre di agar come origine, le piastre di 1.536 agar come destinazione e 384 breve pin pad.</li>
		<li>Selezionare il programma di singola origine di analisi 1:4. L'obiettivo è quello di copiare ogni colonia in quattro colonie di ottenere quadruplicato. Utilizzare il riciclo e rivisitare opzioni come comporta la copia quattro volte ogni Colonia.</li>
		<li>Le piastre del sacchetto e incubare lato agar maculato 1536-Colonia matrice fino a 30 ° C per 3 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificando la matrice di 1.536 Colonia in lastre rettangolari di Sc −Trp
	<ol>
<li>Nel robot, selezionare 1.536 piastre di agar come fonte, 1.536 piastre di agar come destinazione e 1.536 breve pin pad.</li>
		<li>Selezionare il programma Replicare molti per replicare copie di 3 – 4. Utilizzare il riciclo e rivisitare opzione, ma buttare fuori il pad quando si passa a un piatto diverso della matrice per evitare la contaminazione incrociata.</li>
		<li>Le piastre del sacchetto e incubare lato agar maculato 1536-Colonia matrice fino a 30 ° C per 3 giorni per utilizzare per gli accoppiamenti passaggi (Vedi sotto). Dopo di che, è necessario tenere le piastre a temperatura ambiente e copiare nuovamente dopo 7 giorni per un nuovo round di screening.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H schermo
<ol><li>
Preparazione del DNA-esca ceppo prati per accoppiamento
	<ol>
<li>Individuare il lievito DNA-esca ceppi su un piatto −H Sc −U e crescere per 3 giorni a 30 ° C.</li>
		<li>Striscia il lievito in un 15 cm Sc −U −H piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile, affinché ogni piatto si adatta 12 – 16 diversi ceppi. Incubare un giorno a 30 ° C.</li>
		<li>Striscia il lievito in un 15 cm Sc −U −H piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile, affinché ogni piatto si adatta 4 diversi ceppi. Incubare per un giorno a 30 ° C.</li>
		<li>Raschiare il lievito utilizzando uno stuzzicadenti sterile, facendo attenzione a non rimuovere qualsiasi agar e aggiungerla in una provetta da 1,5 con 500 µ l di acqua sterile.</li>
		<li>Aggiungere 10 – 15 perline di vetro sterile su una piastra rettangolare di YAPD. Aggiungere la sospensione di lievito sulla piastra ed agitare accuratamente in tutte le direzioni per 1 min affinché che il lievito si sviluppa attraverso tutto il piatto.</li>
		<li>Capovolgere la piastra immediatamente e toccare in modo che le perline andare al coperchio. Rimuovere e riciclare le perline.</li>
		<li>Le piastre del sacchetto e incubare agar-lato giù per 1 – 2 giorni a 30 ° C. Quindi procedere al passaggio degli amori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Accoppiamento di lievito DNA-esca e TF matrice ceppi
	<ol>
<li>Trasferire la matrice TF in un piatto rettangolare YAPD con il robot. Selezionare la piastra di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di Replicare molti . Ogni piastra di matrice TF può essere utilizzato per trasferire a piastre YAPD 3 – 4 (a seconda del numero di piastre della matrice). Le piastre di matrice TF utilizzate per l'accoppiamento devono essere vecchio di 2 – 3 giorni, ma non più come accoppiamento potrebbe essere inefficiente.</li>
		<li>Trasferire il prato di un ceppo di DNA-esca per le piastre YAPD già contenente la matrice TF con il robot. Selezionare la piastra di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di Replicare molti . Utilizzare un offset casuale nell'origine con un raggio di ~0.6 mm per evitare l'assunzione di lievito dal punto stesso e mescolare il bersaglio per facilitare il contatto tra ceppi di lievito. Utilizzare il prato contenente i ceppi di DNA-esca (sezione 3.1) come fonte e le piastre YAPD che contiene la matrice TF ha notato al punto 3.2.1 come destinazione.</li>
		<li>Le piastre del sacchetto e incubare agar lato fino a 30 ° C per 1 giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezione di lievito diploide
	<ol>
<li>Trasferire il lievito accoppiato dalle piastre YAPD per piastre di Sc −U −Trp con il robot. Selezionare la piastra di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di replicare . Mescolare sull'origine e sulla destinazione.</li>
		<li>Le piastre del sacchetto e incubare agar lato fino a 30 ° C per 2 – 3 giorni (incubazione più lungo porta ad attività del reporter di alta priorità bassa).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasferimento a piastre della lettura
	<ol>
<li>Trasferire il lievito diploide dalle piastre −Trp Sc −U a lettura lastre rettangolari Sc −U −H −Trp + 5mm 3AT + 0,4 mM X-gal utilizzando il robot. Selezionare le piastre di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di replicare .</li>
		<li>Le piastre del sacchetto e incubare agar lato fino a 30 ° C fino a 7 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imaging delle piastre della lettura
	<ol>
<li>Per i ceppi di DNA-esca con attività del reporter di alta priorità bassa, è possibile scattare foto nei giorni 2, 3 e 4. In caso contrario, è possibile scattare foto ai giorni 4 e 7. Interazioni positive sono identificati dal colore blu e la crescita delle colonie di lievito e possono essere determinate manualmente, o può essere determinato utilizzando software di analisi di immagine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

L'approccio di screening degli amori robotici eY1H descritto qui notevolmente aumenta il throughput per identificare l'insieme di TFs che si legano ad una regione di DNA di interesse, rispetto al precedente screening libreria o screening allinearono approcci basati sulla trasformazione. Inoltre, le interazioni di TF-DNA rilevate da eY1H le analisi sono altamente riproducibili come il 90% delle interazioni rilevate sono testati positivi per tutte le quattro colonie in TF e 90% delle interazioni verificare nuovamente in un...

Un problema centrale in campo biomedico consiste nel determinare i meccanismi con cui viene regolato ogni gene umano. Trascrizione è il primo passo nel controllo dei livelli di espressione genica, ed è regolato da un insieme di fattori di trascrizione (TFs) che sono unici per ogni gene. Dato che gli esseri umani codificano per > 1.500 TFs1,2, identificando il set completo di TFs che controllano l'espressione di ogni gene rimane una sfida aperta.
Due tipi di metodi possono essere utilizzati per mappare le interazioni TF-DNA: Metodi TF-centrato e DNA-centrato3 (Figura 1A). Nei metodi TF-centrato, è sondato un TF di interesse per l'associazione a regioni del DNA genomiche o per determinare la specificità di legame del DNA. Questi metodi includono l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da sequenziamento ad alta produttività, microarrays della proteina vincolante e SELEX4,5,6. Nei metodi del DNA-centrato, una sequenza di DNA di interesse è sondata per determinare l'insieme di TFs che si legano alla sequenza di DNA. Il più ampiamente applicata di tali metodi è saggi di lievito monoibrido (Y1H), nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell'ambito del nucleo di lievito utilizzando reporter geni7,8,9.
Y1H saggi riguardano due componenti: una 'DNA-bait' (ad es., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una 'TF-preda,' che possa essere sottoposti a screening per reporter gene attivazione9,10 (Figura 1B). Il DNA-esca è clonato a Monte di due reporter geni (LacZ e HIS3) e due costrutti di DNA-bait::reporter sono integrati nel genoma del lievito per generare cromatinici 'DNA-esca ceppi.' La TF-preda, codificata in un plasmide che esprime un TF fuso per il dominio di attivazione (AD) del lievito Gal4 TF, è stato introdotto nel ceppo di DNA-esca per i pesci per le interazioni di TF-DNA. Se la TF-preda si lega alla sequenza di DNA-esca, quindi l'annuncio presente nella TF-preda porterà all'attivazione di entrambi i geni reporter. Di conseguenza, cellule con un'interazione positiva possono essere selezionate per la crescita sulle piastre carente istidina, come pure di superare un inibitore competitivo, 3-ammino-1,2,4-triazolo (3-AT) e visualizzate come colonie blu in presenza di X-gal. Perché il potente lievito Gal4 è utilizzato AD, saggi di Y1H in grado di rilevare le interazioni che coinvolgono attivatori trascrizionali come repressori. Inoltre, dato che TF-prede sono espressi da un promotore forte lievito (ADH1), interazioni possono essere rilevati anche per TFs che hanno livelli di bassa espressione endogena, che sono difficili da rilevare da ChIP11,12.
Più i protocolli pubblicati per eseguire dosaggi Y1H si basano sull'introduzione di TF-prede nei ceppi di lievito DNA-esca trasformando in pool librerie di TF-preda seguite da selezione, Colonia raccogliendo e sequenziamento per identificare il TF interagenti, o da trasformazione di singoli cloni8,9. Si tratta di protocolli che richiede tempo, limitando il numero di sequenze di DNA che può essere testato per ricercatore. Un recente miglioramento delle analisi Y1H, chiamato enhanced Y1H (eY1H), ha aumentato drammaticamente il throughput screening utilizzando una piattaforma robotica di matrice (HDA) ad alta densità di accoppiarsi ceppi di lievito DNA-esca con una collezione di ceppi di lievito ognuno esprimendo un diverso TF-preda10,13 (Figura 1). Questi schermi utilizzano un formato di 1.536 Colonia che permette di testare più umano TFs in quadruplice copia utilizzando solo tre piastre. Inoltre, dato che interazioni TF-DNA sono testati in maniera pairwise, questo approccio consente per confrontare le interazioni tra DNA-esche (ad esempio, due varianti non codificanti singolo nucleotide) e tra diversi TFs o TF varianti11,12 ,14.
Facendo uso delle analisi di eY1H, abbiamo delineato l'umano più grande e Caenorhabditis elegans TF-DNA DNA-centrato interazioni reti a-data. In particolare, abbiamo identificato 2.230 interazioni tra 246 rinforzatori inerente allo sviluppo umani e 283 TFs12. Ulteriormente, abbiamo impiegato le analisi eY1H per scoprire associazione TF alterata a 109 varianti non codificante di singolo nucleotide associate a malattie genetiche come la malformazione inerente allo sviluppo, il cancro e disturbi neurologici. Più recentemente, abbiamo usato eY1H per delineare una rete formata da 21.714 interazioni tra 2.576 promotori di geni di c. elegans e 366 TFs11. Questa rete è stato determinante per scoprire il ruolo funzionale di decine di c. elegans TFs.
I protocolli per generare macchie di DNA-esca e valutare i livelli di attività del reporter di sfondo sono state segnalate altrove15,16,17. Qui, descriviamo una pipeline di eY1H che può essere utilizzata per qualsiasi regione di DNA genomico umano contro una matrice di 1.086 TFs umano a schermo. Una volta che viene generato un DNA-esca ceppo di lievito e una matrice di TF-preda è macchiata sulle piastre corrispondente, l'intero protocollo può essere eseguita in due settimane (tabella 1). Ancora più importante, il protocollo può essere parallelizzato in modo che un singolo ricercatore può schermo 60 sequenze di DNA-esca simultaneamente. Per illustrare il protocollo, abbiamo proiettato i promotori di due geni di citochine CCL15 e IL17F. Inoltre, mostreremo risultati dalla fallita schermate per illustrare i tipi di problemi che possono sorgere durante l'esecuzione di analisi di eY1H e come risolverli.

<table><tbody><tr><td>3-ammino-1,2,4-triazolo (3AT) ~95 % TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>Inibitore competitivo per i prodotti del gene HIS3</td></tr><tr><td>Adenina solfato (emisulfato), diidrato</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>Necessario per una corretta crescita del lievito</td></tr><tr><td>Agar Alta forza del gel - Grado batteriologico</td><td>American International Chemical</td><td>AGHGUP</td><td>Mezzi nutritivi per la crescita del lievito</td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Fonte di azoto in terreni di lievitazione sintetici</td></tr><tr><td>D+ Glucosio anidro</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Richiesto per la crescita del lievito</td></tr><tr><td>Drop-Out Mix meno His, Leu, Tryp e Uracil, ricco di adenina senza base azotata del lievito</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Terreno completo sintetico necessario per</td></tr><tr><td>il bordo di crescita del lievito PHmetro multiparametrico</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Per misurare il pH di mezzi selettivi</td></tr><tr><td>Stuzzicadenti piatti 750 ct</td><td>Diamante</td><td></td><td>Per striare lieviti su petridish</td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>Per spreak lievito durante la produzione di prati</td></tr><tr><td>Glicerolo &ge; 99%</td><td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Necessario per produrre scorte di lievito congelate</td></tr><tr><td>L-Istidina</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi</td></tr><tr><td>L-Triptofano</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi</td></tr><tr><td>N, N-dimetilformammide</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>Per fare la soluzione X-gal</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Per l'erogazione di volumi accurati di terreno nelle piastre Singer</td></tr><tr><td>Peptone, batteriologico</td><td>American International Chemical</td><td>PEBAUP</td><td>Fonte proteica necessaria per la crescita del lievito</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Per la coltivazione di esche di lievito per Singer</td></tr><tr><td></td><td>Instruments</td><td>PLU-003</td><td>Per realizzare piastre rettangolari per agar da utilizzare con Singer Robot</td></tr><tr><td>Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>Per incubare piastre di lievito a temperatura costante</td></tr><tr><td>RePads 1.536 corto</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>Per trasferire l'array di prede TF, accoppiare il lievito e trasferire il lievito alle piastre di selezione e lettura diploidi</td></tr><tr><td>RePads 384 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>Per trasferire l'array di prede TF da 384 a 1.536 formati di colonie</td></tr><tr><td>RePads 96 long Singer</td><td>Instruments</td><td>REP-001</td><td>Per trasferire l'array di prede TF dal ceppo di glicerolo alla piastra di agar</td></tr><tr><td>RePads 96 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>Per trasferire l'array TF-prey da 96 a 384 colonie</td></tr><tr><td>Singer HDA Robot RoToR</td><td>Strumenti Singer Per</td><td></td><td>il trasferimento di lieviti ad alta produttività</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (pellet/ACS certificato)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Per la regolazione del pH di terreni selettivi</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico eptaidrato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>Richiesto per l'attività del reporter LacZ su X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>Richiesto per l'attività del reporter LacZ su X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Per la selezione della crescita del lievito in terreni selettivi</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indossil-beta-Dgalattopiranoside)</td> <td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&beta;-galattosidasi trasforma in blu X-gal incolore per rilevare l'interazione proteina-DNA</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Terreno nutriente per la crescita e la propagazione del lievito</td></tr><tr><td>Lievito azoto base (polvere) senza AA, carboidrati e senza AS&nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Richiesto per una crescita vigorosa del lievito</td></tr></tbody></table>

schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di dna umano

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identificare i set di fattori di trascrizione (TFs) che regolano ogni gene umano è un compito arduo che richiede l'integrazione di numerosi approcci sperimentali e computazionali. Uno di questi metodi è il lievito monoibrido (Y1H) test, nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell'ambito del nucleo di lievito utilizzando geni reporter. Y1H saggi riguardano due componenti: una 'DNA-bait' (ad es.., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una 'TF-preda,' che possa essere sottoposti a screening per l'attivazione del gene reporter. Più i protocolli pubblicati per l'esecuzione di Y1H schermi si basano sulla trasformazione TF-preda librerie o matrici in ceppi di lievito DNA-esca. Qui, descriviamo una pipeline, chiamato Y1H avanzata (eY1H) assays, dove interazioni TF-DNA sono interrogati dall'accoppiamento del DNA-esca ceppi con una collezione di serie di TF-preda ceppi utilizzando una matrice ad alta densità piattaforma robotica (HDA) che permette la proiezione in un 1.536 formato di Colonia. Questo permette un notevole aumento della velocità effettiva (60 sequenze di DNA-esca contro > 1.000 TFs richiede due settimane per ricercatore) e riproducibilità. Illustriamo i diversi tipi di risultati attesi dalla prova sequenze promotore umano contro una matrice di 1.086 umano TFs, nonché esempi di problemi che possono sorgere durante gli schermi e come risolverli.

Tre fattori principali da considerare quando analizzando i risultati dalle analisi eY1H: l'attività del reporter sfondo del ceppo del DNA-esca, la forza dell'attività di giornalista corrispondente a interazioni TF-DNA e il numero di colonie positive. L'attività del reporter sfondo (cioè, autoactivity) del ceppo del DNA-esca si riferisce al colore delle colonie di lievito nella piastra di lettura, anche in assenza di un TF-preda e alla crescita complessiva. Idealmente, non autoactive ceppi mostrano un sfondo bianco o chia...

Qui, presentiamo un lievito avanzato monoibrido protocollo per identificare i fattori di trascrizione (TFs) che possono essere associato ad una regione di DNA umana di interesse di screening. Questo metodo utilizza una pipeline di screening ad alta resa che può interrogare il legame di > 1.000 TFs in un singolo esperimento.

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

L'obiettivo dei test uni ibridi del lievito potenziato è identificare l'insieme dei fattori di trascrizione che si legano a una sequenza di interesse del DNA. Il vantaggio di questa tecnica è che i test uni ibridi di lievito potenziati possono valutare più di 1000 fattori di trascrizione in un singolo esperimento. Al contrario, l'immunoprecipitazione della cromatina valuta un solo fattore di trascrizione alla volta.Questo metodo costituisce uno strumento chiave per la genomica funzionale per identificare il repertorio dei fattori di trascrizione che si legano ai promotori e agli esaltatori genico e per identificare il legame alterato del fattore di trascrizione con varianti non codificanti. A dimostrare la procedura sarà il Dottor Xing Liu un postdoc del mio laboratorio. Scongelare le piastre stock di glicerolo di lievito con l'array di prede TF sul ghiaccio.Resuspendare il lievito utilizzando una pipetta a 12 canali e procedere al passaggio successivo entro 1 o 3 minuti. Per individuare il lievito in piastre rettangolari Sc meno triptofano, utilizzare un robot array ad alta densità per selezionare più piastre 96 come sorgente, 96 piastre di agar come bersaglio e 96 cuscinetti lunghi perno. I pin pad non sono riutilizzabili e devono essere scartati.Selezionare il programma Spot Many per fare due copie per piastra di pozzo 96. Non utilizzare le opzioni di riciclo o rivisitazione per evitare la retrointaminazione delle scorte congelate. Inoltre, selezionare l'opzione per ruotare su e giù nella sorgente per mescolare il lievito.Seguire le istruzioni su dove e quando posizionare le piastre e consentire al robot di individuare il lievito in piastre rettangolari Sc meno triptofano. Insacca l'array maculato e incubalo lato agar a 30 gradi Celsius per 2-3 giorni. Per generare 384 array di colonie in placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 96 piastre di agar come fonte, 384 piastre di agar come bersaglio e 96 cuscinetti a spillo corti.Quindi selezionare il programma single source array 1:4. In questo modo, quattro 96 tavole di colonia saranno consolidate in una piastra di colonia 384. Non utilizzare le opzioni di riciclo o rivisitazione per evitare la contaminazione tra diverse piastre.Insacca le piastre e incuba il lato agar maculato a 384 colonie a 30 gradi Celsius per 2 giorni. Per generare 1536 array di colonie in placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 384 piastre di agar come fonte, le piastre di agar 1536 come bersaglio e 384 cuscinetti a spillo corti. Quindi selezionare il programma di origine singola del saggio 1:4.L'obiettivo è quello di copiare ogni colonia in quattro colonie per ottenere quadruplicati. Usa le opzioni di riciclo e rivisitazione in quanto ciò comporta la copia di ogni colonia 4 volte. Segui le istruzioni del robot e consenti al robot di individuare il lievito nelle piastre prima di insaccarlo e incubare il lato agar maculato di 1536 colonie a 30 gradi Celsius per 3 giorni.Per amplificare l'array di colonie del 1536 in Placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 1536 piastre di agar come fonte, 1536 piastre di agar come bersaglio e 1536 cuscinetti a spillo corti. Selezionare il programma Replica molti per replicare da 3 a 4 copie. Utilizzare l'opzione di riciclo e rivisitazione, ma gettare il pad quando si passa a una piastra diversa dell'array per evitare la contaminazione incrociata.Permettete al robot di amplificare l'array di colonie 1536 in Sc meno piastre rettangolari di triptofano. Infine, insacca le piastre e incuba il lato agar maculato di 1536 colonie a 30 gradi Celsius per 3 giorni da utilizzare per i passaggi di accoppiamento. Per preparare i prati del ceppo di esche di DNA per l'accoppiamento, individuare i ceppi di esche di lievito di DNA su un piatto sc meno uracile e istidina e crescere per 3 giorni a 30 gradi Celsius.Striare il lievito in una piastra di 15 centimetri Sc meno uracile e istidina utilizzando uno stuzzicadenti sterile in modo che ogni piastra si adatti a 12-16 ceppi diversi. Incubare il piatto un giorno a 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, striare il lievito in una piastra di 15 centimetri Sc meno uracile e istidina utilizzando uno stuzzicadenti sterile in modo che ogni piastra si adatti a 4 ceppi diversi.Incubare il piatto per un giorno a 30 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raschiare il lievito usando uno stuzzicadenti sterile, assicurandosi di non raschiare alcun agar. Aggiungere il lievito in un tubo da 1,5 millilitri con 500 microlitri di acqua sterile.Ora aggiungi da 10 a 15 perline di vetro sterili e la sospensione del lievito su una piastra rettangolare YAPD. Agitare accuratamente in tutte le direzioni per un minuto per assicurarsi che il lievito si diffonda in tutto il piatto. Invertire immediatamente la piastra e toccare in modo che le perline vadano al coperchio.Rimuovere e riciclare le perline. Insacca i piatti e incubali lato agar verso il basso per 1-2 giorni a 30 gradi Celsius. Quindi, procedere al passaggio di accoppiamento.Per accoppiare l'esca di DNA del lievito e i ceppi di array TF, trasferire l'array TF su una piastra rettangolare YAPD con il robot. Selezionare la piastra di agar 1536 come sorgente e il bersaglio e il pin pad corto 1536. Selezionare il programma Replica molti.Seleziona 4 piastre sorgente e le opzioni di riciclo e rivisitazione. Ogni piastra array TF può essere utilizzata per trasferire da 3 a 4 piastre YAPD. Le piastre array TF utilizzate per l'accoppiamento devono avere dai 2 ai 3 giorni, ma non più perché l'accoppiamento può essere inefficiente.Per trasferire il prato di un ceppo di esche di DNA alle piastre YAPD che già contengono l'array TF, selezionare la piastra di agar 1536 come fonte e il bersaglio e il cuscinetto a spillo corto 1536. Selezionare il programma Replica molti. Utilizzare un offset casuale nella sorgente con un raggio di circa 0,6 millimetri per evitare di prendere lievito dallo stesso punto e selezionare Mix on Target per facilitare il contatto tra ceppi di lievito.Usa il prato contenente i ceppi di esche di DNA come fonte e le piastre YAPD contenenti l'array TF maculato come bersaglio prima di insaccare le piastre e incubarle lato agar a 30 gradi Celsius per un giorno. Per la selezione del lievito diploide, selezionare la piastra di agar 1536 come fonte e il bersaglio e selezionare il pad a spillo corto 1536. Selezionare il programma Replica.Selezionare Mix on Source e su Target. Lasciare che il robot trasferisca il lievito accoppiato dalle piastre YAPD alle piastre Sc meno uracile e triptofano prima di insaccarle e incubarle lato agar a 30 gradi Celsius per 2-3 giorni. Ora, seleziona le piastre di agar 1536 come fonte e il bersaglio e il pad a spillo corto 1536.Selezionare il programma Replica. Trasferire il lievito diploide dalle piastre Sc meno uracile e triptofano alle piastre rettangolari rettangolari 3-AT e X-gal contenenti il robot. Insacca i piatti e incubali lato agar a 30 gradi Celsius per un massimo di 7 giorni.Per i ceppi di esche di DNA con attività di reporter di alto background, scatta foto nei giorni 2, 3 e 4. Altrimenti, scatta foto ai giorni 4 e 7. Mantenere le piastre array TF a temperatura ambiente e copiare di nuovo dopo 7 giorni per un nuovo ciclo di screening.Per illustrare il tipo di risultati che possono essere ottenuti utilizzando test uni ibridi di lievito potenziati, le regioni promotrici dei geni CCL15 e IL17F sono state schermate su una serie di 1086 TF umani. Il promotore CCL15 è un esempio di esca di DNA non autoattiva, dove le interazioni, anche deboli, possono essere facilmente rilevate. Il promotore IL17F è un esempio di esca di DNA autoattiva con attività irregolare del reporter di sfondo in cui è possibile rilevare alcune interazioni, mentre per diversi TF, non è chiaro se l'attività del reporter sia superiore allo sfondo.Ci sono diversi problemi che possono verificarsi quando si eseguono test uni ibridi di lievito migliorati. In questo caso, le colonie sono troppo piccole e non sono riuscite a trasferirsi. In genere, circa il 95% delle colonie di prede TF mostra una crescita normale.In questo esempio, non c'è crescita di lievito in una porzione del piatto. Questo problema è generalmente correlato a un guasto nella fase di accoppiamento se il cuscinetto a spillo 1536 non riesce a entrare in contatto con il lievito nel prato del ceppo di esche di DNA, nell'array TF o nella piastra di accoppiamento. In questi due esempi, non vengono rilevate interazioni.Questo problema è spesso correlato a mutazioni inattivanti involontarie nei geni reporter, in particolare la LacZ, o a un'autoattività troppo elevata che maschera le interazioni. In questo caso, la piastra presenta macchie blu casuali che sono spesso correlate alla contaminazione batterica. La cosa più importante da considerare è una corretta preparazione della piastra.Assicurarsi che tutti i componenti siano aggiunti e che l'altezza dell'agar sia uniforme poiché tutti i passaggi successivi dipendono da questo. Sebbene la maggior parte dei reagenti non sia pericolosa, è importante indossare i guanti in ogni momento per evitare la contaminazione dei campioni e delle piastre. Come per qualsiasi saggio di legame del DNA, è importante convalidare le interazioni identificate utilizzando saggi funzionali come test dei reporter, knockdown del fattore di trascrizione o knockout, seguiti dalla misurazione dell'espressione del gene bersaglio.Questo metodo ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione che regolano i geni coinvolti in particolari processi biologici e fattori di trascrizione con legame alternativo a varianti associate a malattie non codificanti.

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Abbiamo modificato il lievito tradizionale doppio ibrido di screening, un efficace strumento genetico per identificare interazioni proteiche. Questa modifica riduce notevolmente il processo, riduce il carico di lavoro e, soprattutto, riduce il numero di falsi positivi. Inoltre, questo approccio è riproducibile ed affidabile.

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In questo video, dimostriamo il test del lievito modificato one-hybrid, che rileva più proteine che interagiscono con il DNA bersaglio. Le cellule di lievito trasformate contengono la sequenza di DNA bersaglio a monte del gene reporter. Inoltre, esprimono proteine del fattore di trascrizione. Quando le proteine formano complessi e si legano al DNA bersaglio, il gene reporter viene espresso e può essere rilevato enzimaticamente.

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Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Il saggio di un ibrido di lievito modificato qui descritto è un'estensione del saggio classico del lievito un ibrido (Y1H) per studiare e convalidare l'interazione heteromera della proteina-complesso del DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio genomico funzionale.

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Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Sequenziamento profondo delle popolazioni di lieviti selezionati per le interazioni di lievito positivo 2-ibrido potenzialmente produce una ricchezza di informazioni su proteine partner interagenti. Qui, descriviamo il funzionamento di strumenti bioinformatici specifico e personalizzato aggiornato il software per analizzare i dati di sequenza da questi schermi.

Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

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Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

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