Name: Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Scopri come coltivare enteroidi umani da tessuto neonatale per studiare l'enterocolite necrotizzante. Questo modello tridimensionale supera i limiti dei sistemi animali e permette ricerche etiche su potenziali terapie.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto di salute Istituto nazionale di diabete e digestivo e rene malattia Grant (K08DK106450) e il premio Jay Grosfeld associazione chirurgica pediatrica americana-C.J.H.

L'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ottenuta (IRB #2013-15152) per la raccolta di campioni di tessuto da pazienti sottoposti a resezione delle viscere all'ospedale Ann e Robert H. Lurie bambini di Chicago, Chicago, IL. Tutti i protocolli sono stati eseguiti in conformità alle linee guida istituzionali e nazionali e dei regolamenti per il benessere umano. Consenso informato dei genitori è stato richiesto e ottenuto prima della raccolta del campione in tutti i casi.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Prepara la soluzione di riserva di terreni di coltura per intero tessuto collection: 1 L di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), 110 mL di siero bovino fetale (FBS), 11 mL di penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%) e 1,1 mL di insulina filtro-sterilizzato (concentrazione finale 0.1%.) Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare chelante Buffer #1: 30 mL di terreni di coltura (come descritto in 1.1), 600 µ l di 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione finale di 10 mM), 300 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l di anfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare il tampone di chelante #2: 30 mL di terreni di coltura (come descritto in 1.1), 300 µ l di EDTA 0.5 M (concentrazione finale di 5mM), 300 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l di anfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare il supporto di Minigut umana: 41,4 mL di DMEM/F-12, 5 mL di FBS (finale 10%), 500 µ l di penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%), 500 µ l di L-Glutammina (concentrazione finale 1%), 500 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%), 100 µ l di amfotericina B (finale concentrazione 0,2%), 500 µ l di 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane dell'acido solfonico (HEPES) (concentrazione finale di 10 mM), 500 µ l di 100 x N-2 supplemento e 1 mL di 50 x B-27 supplemento meno vitamina A per un volume totale di 50 mL. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare umano Minigut Media Complete: 10 mL di umana Minigut Media (preparati a 1.4), 10 µ l di 100 µ g/mL Wnt3a (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 µ l di 100 µ g/mL Noggin (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 µ l di 1 mg/mL R-Spondin (concentrazione finale di 1 µ g/mL) , 10 µ l di 500 µ g/mL Epidermal Growth Factor (EGF) (concentrazione finale di 50 ng/mL), 10 µ l di 1 M N-acetilcisteina (concentrazione finale di 1 mM), 10 µ l di 10 mM Y-27632 (concentrazione finale di 10 µM), 10 µ l di 500 µM A-83 (concentrazione finale 500 nM), 10 µ l di 10 mM SB202190 (finale concentrazione di 10 µM), 100 µ l di 1 M nicotinammide (concentrazione finale di 10 mM) e 1 µ l di 100 µM [leu] 15-gastrin 1 (concentrazione finale di 10 nM). Volume totale 10 mL. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C. Nota: Soluzioni devono essere utilizzate entro 48h.</li>
</ol>2. cripta isolamento e placcatura dall'intero tessuto
<ol><li>
Al momento della raccolta nella suite operativa, posizionare il campione di tessuto intestinale piccolo umano in di freddo Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). Lavare il campione in DPBS freddo fino al chiaro delle feci e sangue. Conservare campione a 4 ° C in Medium RPMI 1640 fino al momento per l'isolamento di cripta. Nota: Tessuto non può essere memorizzato più di 24 h.<ol>
<li>Assicurarsi che il campione sia chiaro delle feci e sangue. Utilizzando le forbici per dissezione delicate, rimuovere qualsiasi eccesso grassi o chirurgici clip/graffette ecc. Pesare il campione. Nota: Scopo per un pezzo circa 0,75-2,5 g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Il campione tagliato a pezzi di 0,5 cm e posto in 30 mL di tampone di chelanti n. 1 (come preparato al punto 1.2).
	<ol>
<li>Agitare a bassa velocità per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Filtro tessuto con colino di cella 100 µm e scartare flusso attraverso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aggiungere il tessuto a 30 mL di tampone di chelatazione #2 (come preparata al punto 1.3).
	<ol>
<li>Agitare a bassa velocità per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Filtro tessuto attraverso un colino di cella di 100 µm e scartare flusso attraverso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scongelare i 500 mL di matrice della membrana basale su ghiaccio per uso nel punto 2.8.</li>
	<li>
Aggiungere tessuto a 10 mL di DMEM freddo in una provetta conica da 50 mL e agitare vigorosamente per 10 s.
	<ol>
<li>Filtrare attraverso un colino di cella di 100 µm e raccogliere flusso attraverso (etichetta n. 1). Tenere il tubo #1 sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere del tessuto a un'altra 10 mL di DMEM freddo in una provetta conica separato 50 mL e agitare vigorosamente per 10 s.</li>
		<li>Filtrare attraverso un colino di cella di 100 µm e raccogliere flusso attraverso (etichetta #2).</li>
		<li>Ripetere due volte fino a quando ci sono quattro provette coniche con flusso attraverso (provette di #1-4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Filtro tubo #1 soluzione attraverso un 100 µm cella colino e trasferimento flusso attraverso in provetta conica da 15 mL (etichetta n. 1). Ripetere per #2-4.
	<ol>
<li>Centrifugare le provette da 15 mL #1-4 a 200 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nella cappa a flusso laminare, rimuovere il supernatante da tubi #1-4 e scartare. Evitare di perturbare la nube del tessuto immediatamente di sopra del pellet, anche se questo significa lasciando alcuni surnatante.
	<ol>
<li>Pipettando lentamente, mescolate insieme il pellet con le rimanenze surnatante in tubi #1-4.</li>
		<li>Trasferire il composto da tubi #1-4 in una provetta conica da mL 2 singole.</li>
		<li>Centrifugare la provetta conica a 200 x g per 20 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di matrice della membrana basale. Nota: tenere la matrice della membrana basale su ghiaccio in ogni momento e lavorare velocemente per i passaggi successivi. Questo prodotto si polimerizza molto rapidamente a temperatura ambiente.<ol>
<li>Applicare 50 µ l di campione/seminterrato membrana matrice sospensione al centro di un pozzo in una piastra a 24 pozzetti. Questo dovrebbe apparire a forma di cupola. Nota: Uso di puntali refrigerati per aiuti in più agevole trasferimento della sospensione, riducendo al minimo polimerizzazione.</li>
		<li>Ripetere 9 volte per riempire 10 pozzi totale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO2 incubatrice per 30 min consentire di polimerizzazione.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di umana Minigut Media completa (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto. Sostituire ogni 2 giorni.</li>
	<li>Raccogliere enteroids dopo 5-10 giorni, quando è visualizzato in erba. Vedere i passaggi 4 e 5 per istruzioni per la raccolta.</li>
</ol>3. induzione di NEC sperimentale
<ol><li>Aggiungere 10 µ l di 5 mg/mL di lipopolisaccaride (LPS) a 500 µ l di umana Minigut Media completa (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto il giorno 0. Sostituire ogni 2 giorni fino alla raccolta.</li>
</ol>4. preparazione per inclusione in paraffina
<ol><li>
Rimuovere delicatamente il supporto.
	<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di PBS e pipettare delicatamente su e giù per dissolvere la matrice della membrana basale con cura non per lisare il enteroids.</li>
		<li>Centrifugare la miscela di PBS/enteroid a < x 300 g per 5 min per pellet e rimuovere PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 4% paraformaldeide per fissare a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>
Centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet e quindi rimuovere PBS.
	<ol>
<li>Lavare delicatamente con 1 mL di PBS e centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet e quindi rimuovere PBS.</li>
		<li>Ripetere il punto 4.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sciogliere un volume sufficiente del tessuto lavorazione gel (circa 300 µ l) posizionando la quantità desiderata in una provetta conica e riscaldandola in un'incubatrice di bagno secco a 65 ° C per 3-10 min fino a liquido.
	<ol>
<li>Aggiungere il gel al pellet di lavorazione del tessuto e mescolare delicatamente.</li>
		<li>Su un vetrino coprioggetti, posizionare un piccolo anello di clonazione.</li>
		<li>Dispensare il tessuto di miscela di gel ed enteroid di elaborazione in un anello di clonazione montato su un vetrino coprioggetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Consentire il miscela di gel ed enteroid a solidificare a 4 ° C per 1 h di lavorazione del tessuto.
	<ol>
<li>Immergere l'anello di clonazione con miscela solidificata in etanolo al 70% in preparazione per inclusione in paraffina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Enteroid collezione per estrazione di proteine e RNA
<ol><li>Rimuovere delicatamente umana Minigut Media completa da ogni pozzetto.</li>
	<li>
Aggiungere 1 mL di PBS e pipettare delicatamente su e giù per dissolvere la matrice della membrana basale. Fare attenzione a non dissociare la enteroids.
	<ol>
<li>Mettere PBS/enteroid composto in una provetta conica sterile mL 2.</li>
		<li>Centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet.</li>
		<li>Rimuovere delicatamente il PBS, facendo attenzione a non per rimuovere il enteroids.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere i passaggio serie 5.2 altre due volte.</li>
	<li>Congelare a-80 ° C fino al momento per proteine e/o estrazione del RNA.</li>
	<li>Eseguire l'isolamento di espressione e proteina di gene di enteroids utilizzando ben consolidata qRT-PCR e tecniche di Western Blotting.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
<li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids%3A+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo romanzo ex vivo enteroid intestinale umano modello serve come un metodo utile per lo studio della disfunzione della barriera intestinale in enterocolite necrotizzante (NEC). I metodi di elaborazione di enteroid qui presentati sono stati adattati dal precedente lavoro della d. ssa Misty Good, Michael Helmrath e Jason Wertheim10,11,12.
Dettagli che circondano l'intera collezione dei tessuti e la ...

Enteroids umana sono un ex vivo sistema di coltura 3-dimensionale generato da cellule staminali isolate da cripte intestinali dei campioni di tessuto intestinale umano. Questo modello innovativo è stato introdotto da Hans Clevers et nel 2007 in seguito alla scoperta di Lgr5 + cellule staminali presso le cripte di piccolo intestino in topi1. Loro lavoro gettato le basi per l'istituzione di un ex vivo cultura epiteliale intestinale di più tipi di cellule che potrebbero essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici2. Dopo questa scoperta, enteroids sono stati utilizzati come un nuovo modello per studiare la normale fisiologia digestiva e fisiopatologia delle malattie intestinali come la malattia di viscere infiammatoria, interazioni ospite-patogeno e medicina rigenerativa2.
L'uso di enteroids come un ex vivo modello per lo studio della fisiopatologia intestinale ha diversi vantaggi rispetto a tecniche alternative. Per i parecchi decenni passati, modelli animali e linee cellulari derivate da cancro intestinale immortalate sono state utilizzate per studiare la fisiologia intestinale3,4,5. Cella singola culture non rappresentano la diversità dei tipi di cellule presenti nell'epitelio intestinale normale, quindi mancano le celle cross-talk e segmento-specificità nell'espressione della proteina, segnalazione e malattia indotta da agente patogeno6. Cellule staminali in enteroids differenziarsi nei principali tipi di cellule epiteliali quali enterociti, cellule di Paneth, cellule caliciformi, cellule enteroendocrine e altre3. Polarità per mostre, svolgono funzioni di trasporto epiteliale e consentire per segmento intestinale specificità6. Poiché enteroids può ricapitolare i più tipi di cellule dell'epitelio intestinale umano, sono in grado di superare questa limitazione riconosciuta di sistemi basati su cellule di cancro. Nel corso del tempo, derivati di linee cellulari sono subcloned ed evolvono per presentano una maggiore diversità di espressione e la localizzazione della proteina3. Al contrario, enteroids possono essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici2. Sebbene esistano numerosi modelli animali per NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. A causa di queste limitazioni, terapie derivate da modelli animali non riuscire il 90% del tempo quando provati nelle prove umane a causa di differenze nella tossicità o l'efficacia3. Enteroids servire come modelli pre-clinici promettenti che possono colmare queste lacune, che conduce ad una migliore comprensione della patofisiologia intestinale complesso e quindi più redditizia e di successo innovazioni terapeutiche. C'è anche la prova recente che l'età del tessuto che un enteroid viene generato da rimane biologicamente importante7. Questo è un dettaglio particolarmente importante per il nostro modello poiché enteroids vengono generati dal tessuto neonatale, mantenendo quindi rilevanza fisiologica ai pazienti con NEC.
L'utilità di enteroids come modelli di malattie umane continua ad espandersi, nella speranza di trovare cure per le condizioni gravi e pervasive. Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante intestinale dei neonati caratterizzata da necrosi intestinale e frequentemente conduce alla perforazione della parete delle viscere, setticemia e morte8. A causa di patofisiologia complessa e multifattoriale di NEC, il meccanismo esatto della malattia non è ancora stato completamente delucidato; Tuttavia, la permeabilità intestinale aumentata è stata chiaramente implicata nella malattia processo8. Dato che lo studio del NEC e potenziali agenti terapeutici è eticamente impegnativo nei soggetti umani, soprattutto bambini, è altamente auspicabile per utilizzare un modello di enteroid biologicamente rilevanti del NEC utilizzando tessuto umano neonatale. Finora, enteroids hanno un ruolo limitato nello studio del NEC. Questo protocollo descrive l'uso di enteroids derivati da campioni di tessuto intestinale umano come un romanzo ex vivo modello per lo studio di enterocolite necrotizzantesi.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R& D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>integratore di B-27 meno vitamina A</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata media (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX ( L-glutammina)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-gastrina 1</td><td>Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 integratore</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano acido solfonico (HEPES)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>gel per la lavorazione dei tessuti (Histogel)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& D Systems INC</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

un nuovo modello enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante degli infanti neonati. Esso è caratterizzato dalle alterazioni patofisiologiche multiple nell'epitelio intestinale umano, che porta ad aumento della permeabilità intestinale, alterato restituzione ed ha aumentato la morte delle cellule. Anche se ci sono numerosi modelli animali di NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. Inoltre, è eticamente impegnativo per studiare la fisiopatologia della malattia o nuovi agenti terapeutici direttamente nei soggetti umani, soprattutto bambini. Di conseguenza, è altamente desiderabile per sviluppare un nuovo modello di NEC utilizzando tessuto umano. Enteroids sono 3-dimensionale organoids derivato dalle cellule epiteliali intestinali. Sono ideali per lo studio delle complesse interazioni fisiologiche, segnalazione delle cellule e della difesa ospite-patogeno. In questo manoscritto Descriviamo un protocollo che culture umane enteroids dopo aver isolato cellule staminali intestinali da pazienti sottoposti a resezione delle viscere. Le cellule della cripta sono coltivate in media che contengono fattori di crescita che favoriscono la differenziazione nel vari nativo di tipi delle cellule dell'epitelio intestinale umano. Queste cellule sono coltivate in un mix sintetico, collageno delle proteine che fungono da un'impalcatura, che imita l'extra-cellulare della membrana dello scantinato. Di conseguenza, enteroids sviluppare apicale basolaterale polarità. La somministrazione concomitante di lipopolisaccaride (LPS) in media provoca una risposta infiammatoria nel enteroids, che portano a istologica, genetica e le alterazioni di espressione della proteina simili a quelli osservati in NEC umano. Un modello sperimentale di NEC utilizzando tessuto umano può fornire una piattaforma più accurata per droga e del trattamento di prova prima della sperimentazione umana, come ci sforziamo di identificare una cura per questa malattia.

Immediatamente dopo il placcaggio, cripte intestinali appena isolate vengono visualizzati come barre di forma allungate. Poche ore, il enteroid avrà un aspetto rotondo (Figura 1a). Nei prossimi giorni, il enteroids inizierà a formare sfere come visto in Figura 1b. In erba dovrebbe verificarsi tra 5-10 giorni (Figura 1c) ed enteroid collezione dovrebb...

Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.

Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Gli enteroidi sono organoidi tridimensionali derivati da cellule epiteliali intestinali. Sono ideali per lo studio di interazioni fisiologiche complesse, segnalazione cellulare e difesa dell'agente patogeno ospite. Il nostro protocollo descrive come coltura degli enteroidi umani dopo aver isolato le cellule staminali intestinali da pazienti sottoposti a resezione intestinale.La co-somministrazione di lipopolysaccharide nei nostri mezzi di coltura provoca una risposta infiammatoria negli enteroidi che porta ad alterazioni dell'espressione istologica, genetica e proteica simili a quelle osservate nell'enterocolite necrotizzante umana. Dato che lo studio dell'enterocolite necrotizzante e dei potenziali agenti terapeutici è eticamente impegnativo nei soggetti umani, in particolare nei bambini, è altamente auspicabile utilizzare questo nuovo modello enteroide biologicamente rilevante di enterocolite necrotizzante utilizzando tessuto neonatale umano. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli enteroidi sono in grado di ricapitolare i tipi di cellule multiple dell'epitelio intestinale umano e sono in grado di superare i limiti riconosciuti dei modelli animali e dei sistemi cellulari.A dimostrare la procedura ci saranno Christie Buonpane, una residente chirurgica, e Carrie Yuan, un tecnico di laboratorio del nostro laboratorio. Al momento della raccolta nella suite operativa, posizionare il piccolo campione di tessuto intestinale umano in DPBS freddo. Lavare il campione nel freddo DPBS fino a quando non è libero da sangue e feci.Conservare il campione in mezzo RPMI 1640 a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'isolamento della cripta. Quando sei pronto a procedere, controlla di nuovo che il campione sia libero da feci e sangue. L'uso di delicate forbici sezionanti rimuove qualsiasi grasso in eccesso o clip chirurgiche e graffette.Pesare il campione e puntare a un pezzo che è di circa 0,75 a 2,5 grammi. Quindi, tagliare il tessuto in pezzi di 0,5 centimetri e metterli in un tubo contenente 30 millilitri di tampone chelatante numero uno. Agitare a bassa velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi, filtrare il tessuto attraverso un colino cellulare di 100 micrometri e scartare il flusso attraverso. Aggiungere il tessuto filtrato a un tubo contenente 30 millilitri di tampone chelating numero due. Agitare a bassa velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Filtrare il tessuto attraverso un filtro da 100 micrometri e scartare il flusso. Successivamente, scongelare 500 microlitri di matrice di membrana basale sul ghiaccio per un uso successivo. Aggiungere un po 'di tessuto a 10 millilitri di DMEM freddo in un tubo conico da 50 millilitri e agitare vigorosamente a mano per 10 secondi.Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri e raccogliere il flusso attraverso. Tieni questo tubo sul ghiaccio. Aggiungere un po 'di tessuto ad altri 10 millilitri di DMEM freddo in un tubo conico separato da 50 millilitri e agitare vigorosamente a mano per 10 secondi.Filtrare questa sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere il processo due volte in più fino a quando non ci sono quattro tubi conici contenenti flusso attraverso etichettato da uno a quattro. Quindi, filtrare la soluzione nel tubo numero uno attraverso un filtro a celle da 100 micrometri e trasferire il flusso attraverso un tubo conico da 15 millilitri etichettato anche come numero uno.Ripetere questo processo per i tubi da due a quattro. Centrifuga i tubi da 15 millilitri a 200 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Nella cappa di flusso laminare, rimuovere il supernatante da ogni tubo e scartarlo.Evitare di interrompere la nube di tessuto immediatamente sopra il pellet, anche se ciò significa lasciare un po 'di supernatante alle spalle. In ogni tubo, pipettare su e giù lentamente per mescolare il pellet con il supernatante rimasto. Trasferire la miscela da ogni tubo in un singolo tubo conico a due millilitri e centrifugare a 200 volte G e a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Successivamente, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 500 microlitri di matrice di membrana basale pre-scongelata. Utilizzare una punta di pipetta refrigerata per applicare 50 microlitri di questa sospensione al centro di un pozzo in una piastra da 24 potte. Questo campione dovrebbe apparire a forma di cupola.Ripeti questo processo di applicazione nove volte per riempire 10 pozzi totali. Trasferire la piastra del pozzo 24 in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire la polimerizzazione. Quindi, aggiungi 500 microlitri di mezzi minigut umani completi a ciascun pozzo.Continuare a incubare nelle stesse condizioni, assicurandosi di sostituire questo supporto ogni due giorni. In primo luogo, aggiungere 10 microlitri di LPS a una concentrazione di cinque milligrammi per millilitro ai 500 microlitri di mezzi minigut umani completi in ogni pozzo della piastra il giorno zero. Continuare a incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e sostituire i supporti integrati ogni due giorni fino alla raccolta.Per prepararsi all'incorporamento della paraffina, rimuovere prima delicatamente il supporto, aggiungere un millilitro di PBS e pipettare delicatamente su e giù per sciogliere la matrice della membrana basale facendo attenzione a non lisciviare gli enteroidi. Centrifugare a una velocità inferiore a 300 volte G per cinque minuti per pellet e quindi rimuovere il PBS. Aggiungere il 4% di paraformaldeide e mettere da parte il tubo per un'ora da fissare a temperatura ambiente.Centrifugare a una velocità inferiore a 300 volte G per cinque minuti per il pellet e quindi rimuovere la paraformaldeide. Lavare delicatamente con un millilitro di PBS e centrifugare a una velocità inferiore a 300 volte G per cinque minuti. Quindi rimuovere il PBS.Ripetere questo processo di lavaggio con PBS una volta. Posizionare la quantità desiderata del gel per la lavorazione dei tessuti in un tubo conico e scaldarlo in un incubatore di bagni asciutti a 65 gradi Celsius per tre o 10 minuti fino a quando non è liquido. Successivamente, aggiungere il gel di lavorazione dei tessuti fusi al pellet e mescolare delicatamente.Posizionare un piccolo anello di clonazione in un coverslip. Pipettare il gel di lavorazione dei tessuti e la miscela enteroide nell'anello di clonazione montato su un copripazzo. Lasciare che il gel di lavorazione dei tessuti e la miscela enteroide si solidifichino a quattro gradi Celsius per un'ora.Quindi, immergere l'anello di clonazione con la miscela solidificata in 70%etanolo per prepararsi all'incorporamento di paraffina. Immediatamente dopo la placcatura, le cripte intestinali appena isolanti appaiono come aste allungate. Nel giro di poche ore gli enteroidi avranno un aspetto rotondo.Nei prossimi giorni gli enteroidi inizieranno a formare sfere. Lo sbiadimento dovrebbe avvenire tra i cinque e i 10 giorni, o quando dovrebbe verificarsi la raccolta enteroide. Gli enteroidi in crescita mostrano anche polarità, contenente un lume centralizzato, un bordo apicale e un dominio basilaterale.Gli enteroidi mostrano anche integrità strutturale rappresentata da un robusto citoscheletro actina. Dopo diversi giorni di coltura, gli enteroidi trattati con LBS sperimentano più apoptosi e hanno una resa inferiore rispetto al gruppo di controllo. Come si vede nei NEC umani nei modelli murini del NEC, una maggiore espressione di pedaggio come il recettore quattro si trova negli enteroidi trattati con LPS rispetto ai controlli.Gli enteroidi possono anche essere raccolti per l'estrazione di RNA e proteine utilizzando tecniche di blotting qRT-PCR ben consolidate e possono essere eseguite l'espressione genica e l'isolamento proteico.

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra lo sviluppo della malattia da enterocolite necrotizzante in un modello enteroide neonatale di derivazione umana indotto dal trattamento con lipopolisaccaridi. Questo modello aiuta a studiare la fisiopatologia intestinale.

Induzione dell'enterocolite necrotizzante in un modello enteroide epiteliale umano

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In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.

Test della permeabilità epiteliale negli enteroidi derivati dal tessuto fetale

Questo protocollo descrive un modello in vitro di enterocolite necrotizzante (NEC), che può essere utilizzato per studi meccanicistici sulla patogenesi della malattia. È dotato di un chip microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati dall'intestino neonatale umano, dalle cellule endoteliali e dal microbioma intestinale di un neonato con NEC grave.

Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

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Un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante e isolamento della lamina propria per la profilazione delle cellule immunitarie

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