Name: Misure automatizzate di sonno e di attività locomotrice in caverna messicano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Scopri come misurare automaticamente sonno e attività locomotoria nel pesce cavernicolo messicano. Questo protocollo applicabile ad altre specie ittiche permette di studiare il comportamento in contesti sociali.

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Nota: Impostare sistemi per il monitoraggio del comportamento in larve e adulti.
1. costruzione di un sistema di sonno per le larve
Nota: Il sistema di monitoraggio per il rilevamento larvale attraverso i pesci giovani di età compresa tra 4 giorni post fertilizzazione (dpf) attraverso 30 dpf a. mexicanus richiede più pezzi di attrezzature tra cui illuminazione a infrarossi (IR), diffusori di luce acrilico IR, automatizzato luce controlli (timer), computer, macchine fotografiche e materiali secondari come cablaggio e regolatori di potenza (Figura 1A). Le seguenti istruzioni verranno informerà come costruire un sistema per monitorare con precisione il comportamento motorio per studiare il sonno e ritmi circadiani in larvale a. mexicanus.
<ol><li>Costruire un sistema di illuminazione costituito da IR e luce bianca diodi luminescenti (LED): posizionare tre luci a infrarossi in un triangolo circa 7,62 cm gli uni dagli altri su un dissipatore di calore in metallo sottile piattaforma 30,5 x 30,5 cm. Luci in serie del legare con filo elettrico e connettersi a una fonte di alimentazione.</li>
	<li>Posizionare un singolo LED a luce bianca al centro delle tre luci IR e allegarli alla fonte di alimentazione.</li>
	<li>Collegare la sorgente di alimentazione per i LED per un luce timer impostato su un tempo circadiano standard.</li>
	<li>Costruire una piattaforma per il sistema di rilevamento larvale. Utilizzare acrilico di spessore segno bianco 0,33 cm per tutti i componenti della piattaforma.</li>
	<li>Posizionare la piattaforma di registrazione sopra il dissipatore quadrato illuminato su cui arenas contenenti pesce risiederà durante il tracciamento comportamentale.</li>
	<li>
Posto un acrilico secondo dentro la scatola tra le luci e gli animali per diffondere l'IR per l'illuminazione ottimale e contrasto. Nota: le dimensioni per la scatola chiara larvale è come segue: due 18 x 8,5 cm e due 17 cm x 8,5 cm LED che sono chimicamente legati insieme per formare un 18 cm x 18 cm quadrato che è 8,5 cm di altezza. Inoltre, acrilico può essere facilmente tagliato o forato utilizzando gli strumenti adeguati per il dimensionamento personalizzato.<ol>
<li>Posizionare la fase larvale intera di rilevamento e l'installazione di illuminazione all'interno di un tunnel di plastica chiuso e quindi posizionare la fotocamera sulla parte superiore del tubo. Nota: È importante mantenere le riflessioni di illuminazione di apparire sul video, il rilevamento come questo potrebbe compromettere la precisione di rilevamento. Il posizionamento delle telecamere sulla cima di un tubo che circonda piattaforma migliora illuminazione e nitidezza per le telecamere che sono utilizzati per questi esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manipolare una webcam (Vedi Tabella materiali) per la registrazione basata su IR. Rimuovere l'obiettivo del produttore utilizzando un utensile rotante (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Rimuovere le viti argentate piccole sul lato posteriore della fotocamera per smontare la scatola interna.</li>
	<li>Rimuovere le piccole viti nere all'interno del corpo della fotocamera per allentare il resto della lente. Utilizzare un piccolo cacciavite per rimuovere parti di alloggiamento dell'obiettivo che rimane dopo il taglio della lente.</li>
	<li>Rimuovi il LED blu sulla parte superiore di carica accoppiata alloggiamento device (CCD).</li>
	<li>Mettere insieme la fotocamera posteriore posizionando l'alloggiamento interno al suo orientamento originale e avvitando le due viti d'argento nella loro posizione originale.</li>
	<li>Itinerario all'interno della fotocamera utilizzando una piccola sega per adattarsi con un bit di routing di plastica arrotondati. Liscio giù la plastica supplementare fino a quando non si può andare bene un adattatore per obiettivo.</li>
	<li>Installare un filtro passa-IR all'interno della fotocamera più vicino il CCD possibile senza fare contatto diretto con la fotocamera. Nota: Fare attenzione a non per danneggiare il chip CCD all'interno dell'alloggiamento della macchina fotografica. Essere sicuri di mantenere il taglio più orizzontale possibile. Sigillare qualsiasi spazio aperto tra l'esterno del filtro IR e il corpo della fotocamera per mantenere la luce di raggiungere il CCD senza essere filtrato.</li>
	<li>Collegare la fotocamera a un obiettivo 35mm fissata (Vedi Tabella materiali) avvitando l'adattatore nella parte anteriore della fotocamera nella parte posteriore della lente.</li>
	<li>Posizionare la fotocamera e la lente nel foro trapanato il coperchio sulla parte superiore del tubo che ospita il palco e le luci e collegare il cavo USB al computer da che gli animali saranno registrati. Nota: Mettere il pesce in una camera di comportamento che è separata da dove sono ospitati pesci di riserva per garantire minime interruzioni durante le registrazioni del comportamento. Fare attenzione a ridurre al minimo le fluttuazioni in temperatura e ventilazione che può confondere gli esperimenti comportamentali.</li>
</ol>2. sistema di sonno per adulti
<ol><li>Costruire un sistema di illuminazione IR per il monitoraggio di pesci adulti dal taglio di IR strisce a intervalli di circa 46 cm. Una striscia di 46 cm è sufficiente per ogni 10 litri di comportamento.</li>
	<li>Ogni striscia insieme in una serie, ogni striscia di filo elettrico DC di saldatura a filo e collegare a una fonte di alimentazione 9 V.</li>
	<li>Fissare ogni striscia di IR per un pezzo di 51 cm x 5,1 cm di alluminio che fungerà da un dissipatore di calore.</li>
	<li>Collocare un 46 cm x 5 cm, 0,32 cm spessore 9% luce-pass segno bianco acrilico foglio direttamente di fronte a ogni striscia di luce IR per diffondere il IR luce.</li>
	<li>Posizionare tutti i carri armati su una cremagliera che supporta l'illuminazione di IR montato posteriormente.</li>
	<li>Utilizzare divisori in plastica opache in carri armati di vetro 10 L per creare singoli arene. Nota: La dimensione di arena può essere variata in base il numero di divisori utilizzato e la dimensione del serbatoio. Dimensione Arena influisce su attività locomotrice e dormire in grotta e superficie pesce23.</li>
	<li>Montare telecamere circa 4-6 metri di distanza serbatoi. Ogni telecamera può registrare in genere da 3 serbatoi in un momento di fornire una risoluzione sufficiente per l'inseguimento. Nota: Registrazioni del comportamento adulte generalmente non richiedono un sistema di illuminazione bianca separata per controllare i cambiamenti di giorno-notte. Semplicemente utilizzando standard plafoniere in una stanza del comportamento collegato ad un timer è probabile che sia sufficiente.</li>
</ol>3. registrazione attività locomotrice
Nota: Tutte le registrazioni comportamentali sono realizzate utilizzando un computer portatile standard o il desktop con una fonte di batteria di backup. A causa delle dimensioni di file di grandi dimensioni di una 24 ore di registrazione (60-100 GB), è possibile salvare tutte le registrazioni su dischi rigidi esterni.
<ol><li>Acclimatare pesci dpf di età 4-30 per 18-24 h prima di iniziare le registrazioni. Mangiare pesci larvale con Artemia dal vivo quando in primo luogo inserito nella camera di registrazione e 1 h prima di iniziare la registrazione. Acclimatare pesci adulti 4-5 giorni prima registrazione comportamento e nutrire una volta al giorno con mangime in fiocchi o dal vivo si. Nota: Assicuratevi di posizionare larvale pesci in acqua dolce prima della registrazione, come avanzi di Artemia causerà problemi di rilevamento durante le analisi successive. Co-coltura con rotiferi fornisce un'opzione alternativa, come le loro piccole dimensioni non interferiscano con il rilevamento.</li>
	<li>Posto pesce di età compresa tra 4-6 dpf in piastre di coltura del tessuto 24 pozzetti. Pesce di casa di età compresa tra 20-30 dpf in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti per la registrazione.</li>
	<li>Adulti record in 10 L serbatoi in forma con divisori per ospitare cinque pesci alloggiati individualmente, o senza divisori per registrare sonno e di attività in un contesto sociale. Nota: Fare attenzione a mettere a fuoco la fotocamera prima di iniziare la registrazione al fine di massimizzare la precisione di rilevamento. Non aprire il diaframma dell'obiettivo della fotocamera troppo lontano, come questo ridurrà drasticamente la nitidezza dell'immagine. C'è un equilibrio, tuttavia; Se il diaframma è chiuso troppo lontano, il frame rate del video scenderà sotto fps 15,00. È essenziale per un'analisi successiva che il frame rate rimane 15,00 fotogrammi al s per l'uso con alcuni sonno personalizzato scritto script23,24.</li>
	<li>Impostare luminosità e illuminazione Illuminazioni di sfondo.</li>
	<li>Ottimizzare l'illuminazione prima dell'inizio della registrazione. Sempre mantenere il contrasto al livello più alto possibile e utilizzare la luminosità e l'Illuminazione di sfondo per regolare la luminosità fino a quando gli animali sono più chiari.</li>
	<li>Pesce record per 24 o 48 ore. Nota: Emergenza backup battery pack che alimentano tutti gli illuminazione, computer e macchine fotografiche devono essere acquistati in caso di interruzioni dell'alimentazione. Tutti i pacchi batteria anche dovrebbero essere collegati a prese di alimentazione d'emergenza, se possibile. Pacchi batteria saranno generalmente non alimentare l'apparecchiatura per più di pochi minuti a un'ora al massimo e servire da ponte tra la perdita di alimentazione principale e trasferimento al sistema di alimentazione di emergenza.</li>
</ol>4. analisi dell'attività locomotrice in singolarmente ospitato pesce utilizzando Automated Software di monitoraggio
<ol><li>Per iniziare l'analisi del comportamento, aprire il software di monitoraggio, selezionare Nuovo esperimento da modello, quindi selezionare applica un modello di tasti.</li>
	<li>Come il programma ora vi chiederà quale specie per tenere traccia, selezionare il pesce. Utilizzare la casella a discesa per selezionare entrambi Zebrafish larve di Zebrafish adulto secondo il paradigma sperimentale.</li>
	<li>Impostare le arene in cui ogni animale sarà tenuta traccia. Per le larve, selezionare ben piatto, rotondo bene e Nessun modello di zona. Per gli adulti, utilizzare campo aperto, Piazza con Nessun modello di zona. Quindi determinare il numero corretto di arenas, uno per ciascun animale monitorata nel video.</li>
	<li>Selezionare il modello per il rilevamento ottima, fare clic su traccia centro-punto, ed essere sicuri che il colore degli animali sia selezionato per essere più scuro rispetto allo sfondo. Applicare il frame rate in cui è stato acquisito il video. Il software di monitoraggio dovrebbe rilevare automaticamente questo.</li>
	<li>Disegnare una scala per calibrare la distanza reale di un oggetto per determinare con precisione il comportamento motorio del pesce utilizzando Impostazioni di Arena.</li>
	<li>Modificare le arene per assicurarsi che l'intera area che i pesci sono in verrà monitorata; in caso contrario i campioni saranno persi durante l'acquisizione. Nota: Prestare attenzione durante l'impostazione di aree. Larvale pesce soprattutto sono sensibili agli errori di rilevamento, se le arene sono troppo grandi o piccole. Cattiva illuminazione nell'esperimento può anche creare ombre sulle pareti delle piastre a pozzetti, che il programma potrebbe pensare è un animale, creando un falso positivo.</li>
	<li>Fare clic su Avanzate. In Metodo nell'Impostazione di rilevamento, selezionare Dynamic sottrazione, poi fai clic sullo sfondo e selezionare Start Learning. Regolare il rapporto di segnale/rumore di contrasto scuro finché gli animali vengono monitorati bene, e lo sfondo non è causa di rilevamento saltare. Nota: Qualità video può variare tra esperimenti, quindi potrebbe essere necessario utilizzare impostazioni diverse, di conseguenza ogni prova. Utilizzando le funzionalità di Contorno del soggetto e Dimensioni del soggetto può migliorare significativamente i risultati della ricerca.</li>
	<li>Selezionare elenco Trial e caricare i parametri corretti prima di iniziare a registrare i dati nel programma.</li>
	<li>Fare clic nella scheda di acquisizione , selezionare Traccia tutte le prove in programma e fare clic sul pulsante di registrazione.</li>
	<li>Sotto il Profilo di analisi, assicurarsi che siano selezionate distanza, tempo e movimento . Nota: In ordine per un'analisi successiva di sonno, è fondamentale che queste impostazioni siano corrette, come la perla file deve leggere questi dati nell'ordine corretto per calcolare il sonno.</li>
	<li>In Esporta, selezionare Dati grezzi, esportare i dati come testo Unicode.</li>
</ol>5. tracking ospitato socialmente pesce
<ol><li>Seguire i passaggi 4.1-4.4 impostare l'esperimento nel software di monitoraggio.</li>
	<li>Nel menu a discesa, selezionare il numero di animali per tenere traccia per l'esperimento.</li>
	<li>Nelle impostazioni di Arena , disegnare la scala corretta per calibrare la distanza reale.</li>
	<li>In impostazioni di rilevamento , utilizzare Dynamic sottrazionee regolare il contrasto scuro per monitorare meglio l'animale.</li>
	<li>Regolare le dimensioni del soggetto sotto le impostazioni di rilevamento, in modo che solo una porzione molto piccola dell'animale viene tenuta traccia. Nota: Registrando solo una piccola parte dell'animale, questo ridurrà la quantità di commutazione tra animali quando essi si incrociano durante l'acquisizione.</li>
	<li>Una volta acquisite le tracce, è possibile utilizzare il Track Editor per correggere manualmente volte dove i pesci possono attraversare percorsi.</li>
</ol>6. estrazione dei dati di sonno da attività locomotrice
Nota: La definizione del comportamento di sonno in sia larvale e adulto a. mexicanus è 1 minuto o più di quiescenza. Questa definizione è stata determinata utilizzando esperimenti di soglia di eccitazione, dove un maggiore stimolo sensoriale è necessaria per avviare una risposta comportamentale in uno stato dormiente (> 60 s) rispetto al risveglio14,17. Per tenere conto di piccoli movimenti e alla deriva comune a pescare specie, ci sono soglie di velocità applicate per separare il movimento reale da rumore o deriva. Queste soglie sono informaticamente derivato confrontando le correlazioni tra distanza e durata del sonno per trovare il più alto R-squared valori; quindi determinare la velocità più precisa per il movimento e il sonno. Per pesce larvale, i limiti superiori e inferiori sono entrambe 12 mm/s come c'è poco da nessuna deriva. Per gli adulti il limite inferiore è 2 cm/s con un limite superiore di 4 cm/s per tenere conto di drift.
<ol><li>Installare Cygwin per l'analisi del computer per effettuare l'esecuzione degli script personalizzati scritti per estrarre locomotore e comportamento di dormire.</li>
	<li>Creare una nuova cartella di esperimento all'interno della directory home di Cygwin.</li>
	<li>Importare i dati Unicode non elaborati dal software di monitoraggio ed eseguire il file. sh in Cygwin per convertire la codifica da UTF-16 in UTF-8.</li>
	<li>Eseguire il file della perla in Cygwin per estrarre i dati di sonno.</li>
	<li>Aprire il file di macro e seguire le istruzioni all'interno del foglio di calcolo per finalizzare l'analisi dei dati come desiderato. Nota: Un livello base di codifica della riga di comando sarà necessario effettuare questa porzione di analisi. General Linux comandi saranno sufficiente. Se ci sono problemi con i programmi che leggono i dati correttamente, controllare i dati dal software in qualsiasi editor di testo liberamente disponibile di monitoraggio per essere sicuri che la codifica e ordine sia corretto per i file eseguibili di scrivere correttamente.</li>
</ol>

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<li>Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+is+required+to+promote+wakefulness+and+for+hypocretin-induced+arousal+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish.</a> eLife. 4 (September), (2015).</li>
<li>Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+shift+from+fighting+to+foraging+in+blind+cavefish+through+changes+in+the+serotonin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network.</a> Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+evolutionary+biology+of+the+threespine+stickleback%22">The evolutionary biology of the threespine stickleback</a>. 584, Oxford University Press. Available from:
 <a target="_blank" href="http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1">http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1</a> (1994).</li>
<li>Seehausen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((African+cichlid+fish%3A+a+model+system+in+adaptive+radiation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biological+Sciences%2FThe+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research.</a> Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).</li>
<li>Basolo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+preference+predates+the+evolution+of+the+sword+in+swordtail+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish.</a> Science. 250, 808-810 (1990).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non hanno nessun interessi concorrenti.

Questo protocollo descrive un sistema personalizzato per quantificare il sonno e l'attività locomotrice in caverna larvale e adulto. Caverna è emersi come un modello di punta per studiare l'evoluzione del sonno che può essere utilizzato per studiare la base genetica e neurale di sonno regolamento1. I passaggi critici nel presente protocollo comprendono l'ottimizzazione dell'illuminazione e qualità video al fine di assicurare il monitoraggio accurato che è necessario quantificare il sonno. Il siste...

Sonno è altamente conservata in tutto il Regno animale ai livelli fisiologici, funzionali e comportamentali1,2,3. Mentre il sonno in animali da laboratorio dei mammiferi in genere è valutato utilizzando gli elettroencefalogrammi, registrazioni elettrofisiologiche sono meno pratiche sistemi di piccolo modello geneticamente suscettibili e così sonno in genere viene misurata in base il comportamento3 , 4. caratteristiche comportamentali associate con il sonno sono altamente conservate in tutto il Regno animale e comprendono la soglia di risveglio aumentato, reversibilità con stimolazione e prolungata quiescenza comportamentale5. Queste misure possono essere utilizzate per caratterizzare il sonno negli animali che vanno dal worm del nematode c. elegans, attraverso gli esseri umani6.
L'uso di quiescenza comportamentale per la caratterizzazione di sonno richiede il software di rilevamento automatizzato. Con software di monitoraggio, periodi di immobilità e di attività sono determinati su un numero di giorni, e lunghi periodi di inattività sono classificati come dormire7,8. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati molteplici sistemi di monitoraggio per l'acquisizione di dati relativi all'attività tra una diversità di sistemi piccolo modello geneticamente suscettibili; tra cui vermi, moscerini della frutta e pesce9,10,11. Questi programmi sono accompagnati da software che consente il rilevamento automatizzato del comportamento animale, tra cui sia opensource freeware e software disponibili in commercio7,12,13,14 . Questi sistemi si differenziano per la loro flessibilità e consentono lo screening efficiente e caratterizzazione dei fenotipi di sonno nei numerosi modelli geneticamente modificabili.
Indagine genetica di sonno in zebrafish, Danio rerio, ha portato all'identificazione di numerosi geni e circuiti neurali che regolano il sonno15,16. Mentre questo ha fornito un potente sistema per indagare le basi neurali di sonno in un animale di laboratorio vertebrati, tanto meno è conosciuto circa come si evolve il sonno e come naturale variazione contribuisce a dormire regolamento. La caverna messicano, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), si sono evolute le differenze drammatiche nel sonno, attività locomotrice e ritmi circadiani17,18. Questi pesci esistano come popolazioni intorno alla regione della Sierra Del Abra del Messico nord-orientale19,20,21di eyed fish superficiale che abitano i fiumi del Messico e Texas meridionale e almeno 29 cave. Sorprendentemente, molte differenze comportamentali, tra cui la perdita di sonno, sembrano sono emerse in modo indipendente in più caverna popolazioni14,22. Di conseguenza, caverna fornisce un modello per studiare l'evoluzione convergente di sonno, circadiano e i comportamenti sociali.
Questo protocollo descrive un sistema per misurare il sonno e il comportamento motorio nell'A. mexicanus larve e adulti. Un sistema di registrazione su misura basati su infrarossi permette per la registrazione video di animali in condizioni di luce e buio. Software disponibile in commercio può essere utilizzato per misurare l'attività e le macro personalizzate vengono utilizzate per quantificare i diversi aspetti di inattività e determinare i periodi di sonno. Questo protocollo descrive anche le modifiche sperimentali per la verifica dell'attività di più animali all'interno di un serbatoio, con la possibilità di esaminare le interazioni tra il sonno e i comportamenti sociali. Questi sistemi possono essere applicati a misura sonno, comportamento circadiano e attività locomotrice in specie ittiche aggiuntive tra cui zebrafish e Spinarelli.

<table><tbody><tr><td>Adattatore di alimentazione 12 V</td><td>Luci ambientali</td><td>24 Watt Alimentatore</td><td></td>12 VDC</tr><tr><td>Divisori in acrilico (adulti)</td><td>TAP Plastica Ordina</td><td></td><td>fogli nelle dimensioni secondo necessità</td></tr><tr><td>Fonte di alimentazione a infrarossi per adulti</td><td>Luci ambientali 24 Watt Alimentatore</td><td></td><td></td>12 VDC</tr><tr><td>Pacco batteria</td><td>CyberPower</td><td>CP850PFCLCD</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo della fotocamera (adulto)</td><td>Navitar Zoom 7000</td><td>Zoom 7000</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo della fotocamera (larvale)</td><td>Fujian 35mm f/1.7</td><td>B01CHX7668</td><td>Acquista su Amazon</td></tr><tr><td>Adattatore per obiettivo della fotocamera</td><td>d</td><td>1524219</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per fotocamera</td><td>CowboyStudio Super Clamp</td><td>B002LV7X1K</td><td>Acquista su Amazon</td></tr><tr><td>Acquario</td><td>Deep Blue Professional</td><td>ADB11006</td><td></td></tr><tr><td>Dissipatore di calore (adulto)</td><td>M-D Prodotti per l'edilizia</td><td>SKU: 61085</td><td>Taglio per adattarsi Dissipatore</td></tr> di <tr><td>calore (larvale)</td><td>M-D Prodotti per l'edilizia</td><td>SKU: 57000</td><td>Taglio per adattarsi</td></tr><tr><td>Luci a infrarossi (adulti)</td><td>Luci ambientali Infrarossi 850 nm 5050 Striscia LED</td><td>irrf850-5050-60-reel</td><td>Taglio per adattarsi Luci</td></tr><tr><td>a infrarossi (larvali)</td><td>LED World</td><td>B00MO9H7H4</td><td>Acquista su Amazon</td></tr><tr><td>Acrilico diffondente</td><td>IR TAP Plastica</td><td></td><td>Ordina i fogli nelle dimensioni necessarie</td></tr><tr><td>Laptop/computer</td><td>N/A</td><td>N/A Qualsiasi</td><td>laptop funzionerà.</td></tr>Luce <tr><td>LED</td><td>Chanzon 10 Chip LED ad alta potenza 3W Bianco (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt)</td><td>B06XKTRSP7</td><td>Utilizzare con Chanzon 25 pz 1 W, 3 W, 5 W Dissipatore di calore LED (2 pin nero) Piastra di base in alluminio</td></tr><tr><td>Timer</td><td>luce pannello Century 24 ore Timer meccanico plug-in Montaggio</td> a parete in plastica con messa a terra <td></td><td></td></tr><tr><td>per IR</td><td>Everbilt Pannello forato in plastica</td><td>Modello # 17961</td><td></td></tr><tr><td>Cavo</td> <td>di alimentazioneBNTECHGO Filo in silicone calibro 22</td><td>B01K4RPE0Y</td><td></td></tr><tr><td>Fonte di alimentazione</td><td>Rapid LED</td><td>MOONLIGHT DRIVER (350MA)</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale</td><td>Fisherbrand</td><td>12 pozzetti (FB012928) 24 pozzetti (FB012929)</td><td></td></tr><tr><td>Treppiede Testa a sfera</td><td>Demon DB-44</td><td>B00TQ54CZO</td><td>Acquista su Amazon</td></tr><tr><td>USB Hardrive</td><td>Seagate 3TB di backup</td><td>STDT3000100</td><td></td></tr><tr><td>USB Webcam</td><td>Microsoft LifeCam</td><td>Q2F-00014</td><td>Acquista su Amazon</td></tr><tr><td>Supporto da parete per telecamera</td><td>LDR Industries 1/2" Tubo in acciaio</td><td>307 12X36</td><td>Montato a parete con flangia e gomito del tubo a 90 gradi. Potrebbe anche usare un treppiede per tenere la fotocamera.</td></tr></tbody></table>

misure automatizzate di sonno e di attività locomotrice in caverna messicano

Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish

Attraverso phyla, sonno è caratterizzata da altamente conservate caratteristiche comportamentali che includono la soglia di eccitazione elevata, rimbalzo dopo privazione di sonno e consolidato periodi di immobilità del comportamento. La caverna messicano, Astyanax mexicanus (a. mexicanus), è un modello per studiare l'evoluzione del tratto in risposta a perturbazioni ambientali. A. mexicanus esiste come in eyed superficie-abitazione forme e popolazioni di caverne ciechi multiple che sono robuste differenze morfologiche e comportamentali. Si è verificato la perdita di sonno in popolazioni multiple, caverna si è evoluta in modo indipendente. Questo protocollo descrive una metodologia per quantificare il sonno e attività locomotrice in grotta a. mexicanus e pesci di superficie. Un conveniente sistema di monitoraggio video consente per l'imaging del comportamento del pesce adulto o larvale individualmente-ospitato per periodi di una settimana o più. Il sistema può essere applicato a pescare invecchiato 4 giorni post fecondazione fino all'età adulta. L'approccio può essere adattato anche per misurare gli effetti delle interazioni sociali sul sonno registrando più pesce in una singola arena. A seguito del comportamento registrazioni, dati vengono analizzati utilizzando automated software di monitoraggio e analisi del sonno viene elaborata utilizzando script personalizzati che quantificare più variabili di sonno inclusi durata, lunghezza di bout e incontro. Questo sistema può essere applicato a misura sonno, comportamento circadiano e attività locomotrice in quasi ogni specie di pesci tra cui zebrafish e Spinarelli.

Età di larve 4-30 dpf può essere attendibilmente registrato nel sistema chiuso personalizzati descritto nella Figura 1. Il sistema comprende IR e illuminazione visibile per consentire le registrazioni in condizioni di luce e buia, sotto diverse condizioni di luce visibile (Figura 1A). I video sono poi analizzati utilizzando il software di monitoraggio (Figura 1BC) e post-elaborazione...

Questo protocollo dettaglia la metodologia per quantificare il comportamento motorio e sonno nella caverna messicano. Le analisi precedenti vengono estesi per misurare questi comportamenti socialmente Accasata pesce. Questo sistema può essere ampiamente applicato per lo studio di sonno e attività in altre specie di pesci.

Misure automatizzate di sonno e di attività locomotrice in caverna messicano

Across phyla, sleep is characterized by highly conserved behavioral characteristics that include elevated arousal threshold, rebound following sleep ...

Questo protocollo può essere utilizzato per quantificare il sonno e l'attività in qualsiasi popolazione ittica e ha il potenziale per espandere il numero di sistemi modello utilizzati per studiare la regolazione del sonno. Il vantaggio di questa tecnica è la sua flessibilità. Ad esempio, i pesci possono essere monitorati in una varietà di dimensioni dell'arena o in esperimenti ospitati singolarmente o ospitati in gruppo.Un punto di forza nella misurazione del sonno in questo sistema è la misurabilità del metodo per il farmaco ad alta produttività o lo screening genetico. Abbiamo applicato questo metodo allo studio dell'evoluzione del sonno in due diverse popolazioni di pesci grotta che dimostrano fenotipi del sonno drammaticamente diversi. Sebbene possa essere difficile stabilire un sistema per l'imaging comportamentale, il nostro sistema fornisce un metodo conveniente per lo studio dei pesci larvali e adulti.Per costruire il sistema per tracciare con precisione il comportamento locomotore per lo studio del sonno e dei ritmi circadiani nel larvale A.mexicanus, usa l'acrilico del segno bianco spesso 0,33 centimetri per costruire una piattaforma per il sistema di tracciamento larvale. Posizionare la piattaforma di registrazione sopra il dissipatore di calore quadrato illuminato su cui risiederanno arene contenenti pesci durante gli esperimenti di tracciamento comportamentale e posizionare un secondo acrilico all'interno della scatola tra le luci nell'alloggiamento degli animali per diffondere l'infrarosso per un'illuminazione e un contrasto ottimali. Posizionare l'intera fase di tracciamento larvale e l'illuminazione impostata all'interno di un tubo di plastica chiuso.Utilizzare uno strumento rotativo per rimuovere l'obiettivo da una webcam adatta sperimentalmente. Rimuovere le piccole viti sul retro della fotocamera per rimuovere l'alloggiamento interno e rimuovere le piccole viti all'interno del corpo della fotocamera per allentare il resto dell'obiettivo. Utilizzare un piccolo cacciavite per rimuovere eventuali parti dell'alloggiamento dell'obiettivo lasciate dopo aver tagliato l'obiettivo.E rimuovere il diodo blu che emette luce sulla parte superiore del dispositivo accoppiato alla carica o dell'alloggiamento CCD. Quindi, riportare l'alloggiamento interno al suo orientamento originale prima di avvitare le due viti esterne nelle loro posizioni originali. Utilizzare una piccola sega per instradare l'interno della fotocamera per consentire alla fotocamera di essere dotata di un bit di instradamento di plastica arrotondato che leviga la plastica extra fino a quando non può accompagnare un adattatore per obiettivo.Installare un filtro passa infrarosso all'interno della fotocamera il più vicino possibile al CCD senza entrare in contatto diretto con la fotocamera e avvitare l'adattatore di un obiettivo fisso di 35 millimetri nella parte anteriore della fotocamera nella parte posteriore dell'obiettivo. Quindi posizionare la fotocamera e l'obiettivo nel foro praticato nel coperchio nella parte superiore del tubo che ospita il palco e le luci e collegare l'USB al computer su cui verranno registrati gli animali. Per costruire un sistema di sonno per pesci adulti, tagliare prima le strisce infrarosse a intervalli di circa 46 centimetri.E posizionare un foglio acrilico di segno bianco 46 per cinque per 0,32 centimetri e 9%leggero direttamente davanti a ogni striscia luminosa infrarossa per diffondere la luce infrarossa. Quindi posizionare tutti i serbatoi su un rack che supporta l'illuminazione a infrarossi montata sul retro e utilizzare divisori in plastica opachi e serbatoi di vetro da 10 litri per creare arene individuali. Per registrare l'attività locomotoria del tetra pesce messicano, posizionare il giorno da quattro a sei pesci post-fecondazione in singoli pozzi di una piastra tissutale da 24 pozzi e giorni da 20 a 30 post-fecondazione in singoli pozzi di una piastra tissutale a sei pozzi.Per registrare il sonno e l'attività tetra adulti in una casa di ambiente sociale fino a cinque adulti per serbatoio da 10 litri con o senza i divisori. In questo esperimento rappresentativo i pesci larvali di tre popolazioni indipendenti di pesci delle caverne hanno mostrato una significativa riduzione del sonno rispetto ai pesci di superficie. Questa produzione di sonno è coerente in tutte le età testate poiché il sonno è stato significativamente ridotto anche nei pesci delle caverne adulti Pachon, Molino e Tinaja rispetto ai pesci di superficie.In particolare, l'edilizia popolare riduceva notevolmente il sonno nei pesci di superficie senza influire sul sonno nei pesci delle caverne di Pacho probabilmente a causa di un effetto seminterrato nelle popolazioni di pesci delle caverne. Durante la registrazione del pesce si deve fare attenzione a garantire che l'illuminazione della fotocamera sia ottimale per migliorare il segnale del pesce rispetto allo sfondo. Per questo protocollo è necessaria una codifica della riga di comando di base che è completamente descritta nel testo e deve essere adattabile a qualsiasi impostazione del lab.Questo protocollo ha portato a numerose domande sull'evoluzione del sonno ed è attualmente utilizzato per schermi di farmaci, tenere traccia del comportamento del sonno e capire come il comportamento sociale influisce sul sonno.

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JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Si descrivono le modalità per la registrazione quotidiana ritmi di attività...

Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila</em

La procedura è descritta per manipolare l'attività dei neuroni cerebrali corticali piramidali optogenetically mentre l'elettroencefalogramma, elettromiogramma, e cerebrale concentrazione di lattato sono monitorati. Registrazioni sperimentali vengono eseguite su cavo-frenati topi, mentre subiscono spontanee sonno / veglia cicli. Optogenetic apparecchiatura è assemblata nel nostro laboratorio, apparecchi registrazione è commercialmente disponibile.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Questo video mostra un protocollo per l'impianto di un elettroencefalogramma (EEG) e di un elettromiogramma (EMG) in un topo anestetizzato. Il processo prevede il fissaggio del topo su un telaio stereotassico, l'esecuzione di un'incisione della linea mediana nel cranio, la perforazione di fori per gli elettrodi e il fissaggio dell'unità elettrodo per la registrazione del segnale. Dopo il recupero, il comportamento sonno-veglia del topo viene analizzato utilizzando i segnali registrati.

Analisi del comportamento del sonno nei topi attraverso registrazioni di elettroencefalogramma ed elettromiogramma

Qui presentiamo procedure sperimentali e analitiche per descrivere le dinamiche temporali delle variabili neurali e cardiache del sonno non REM nei topi, che modulano la risposta al sonno agli stimoli acustici.

Quantificare la dinamica infrarosso del potere spettrale e della frequenza cardiaca nei topi addormentati

Descriviamo un metodo di alto-rendimento di misurazione sonno per mezzo di monitoraggio basato su attività di home-gabbia. Questo metodo offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali basati su EEG. E è convalidata anche per la determinazione della durata totale di sonno e può essere un potente strumento per monitorare il sonno nei modelli del roditore della malattia umana.

Determinazione non invasiva, High-throughput di durata di sonno in roditori

Questo articolo presenta un sistema di biomonitoraggio non invadente per la registrazione continua e l'analisi dell'attività cardiaca e locomotore gamberi. Questo sistema è costituito da un sensore ottico infrarosso, un modulo di rilevamento video e software per la valutazione di battiti cardiaci gamberi che riflette il suo stato fisiologico e caratterizza il comportamento di gamberi durante le fluttuazioni di battito cardiaco.

Continua la misurazione non invasiva dell'attività cardiaca e comportamentali di gamberi

In questo protocollo, dimostriamo come allevare gli adulti Astyanax mexicanus , sollevare le larve ed eseguire immunohistochemistry intero-monta il pesce post-larvale per confrontare i fenotipi della superficie e Grotta morfotipi.

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Qui, presentiamo i metodi per lo studio di alto-rendimento di una serie della caverna messicano comportamenti e colorazione vitale di un sistema che mechanosensory. Questi metodi utilizzano script software libero e su misura, che forniscono un metodo pratico ed economico per gli studi dei comportamenti.

Rilevamento comportamentale e formazione immagine di Neuromast della caverna messicano

Attività locomotoria (LMA) è una misura semplice e di facile esecuzione di comportamento nei topi. Accoppiamento di software di video tracking (VTS) e LMA permette il miglioramento della specificità e sensibilità, soprattutto se confrontato con il manuale, linea metodo di attraversamento LMA analisi. Inoltre VTS permette il monitoraggio a lungo termine di topo LMA.

Mouse a breve e lungo termine di attività locomotoria analizzati da Tracking Software Video

Scopri come misurare automaticamente sonno e attività locomotoria nel pesce cavernicolo messicano. Questo protocollo applicabile ad altre specie ittiche permette di studiare il comportamento in contesti sociali.

Misure automatizzate di sonno e di attività locomotrice in caverna messicano

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