Un dispositivo di posizionamento per il posizionamento dei topi durante la consegna del siRNA intranasale al sistema nervoso centrale
15 agosto 2019
Qui, presentiamo un protocollo utilizzando un dispositivo di posizionamento del mouse che consente il posizionamento appropriato dei topi per la somministrazione intranasale di una formulazione di peptidi-siRNA mirata al cervello che consente un silenziamento genico efficace nel sistema nervoso centrale.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'uso di un dispositivo di posizionamento per la consegna intranasale di biomolecole al SNC del mouse. L'uso di questo dispositivo riduce significativamente la manipolazione dei topi e il tempo di trattamento con conseguente miglioramento dell'efficienza e della riproducibilità della tecnica. Per iniziare questa procedura, valutare il livello di anestesia dei topi per riflesso del pedale al fine di mantenere il piano chirurgico.
Quindi, posizionare il dispositivo di posizionamento a una distanza e un'altezza appropriate per consentire un comodo accesso a tutti i reagenti richiesti. Quindi, applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Allaccia un mouse con cinture per sedie, assicurandoti che gli arti anteriori del mouse forniscano un supporto naturale mentre è in una posizione rilassata senza alcun disagio.
Ripetere le procedure per i topi rimanenti. Posizionare delicatamente ogni mouse sulla sedia designata appoggiando lo schienale parallelo al supporto posteriore della sedia e a 90 gradi dal sedile della sedia. Lascia che l'animale giace naturalmente nella testa in posizione verso il basso e in avanti senza spingere o premere.
Una volta che tutti i topi sono legati, iniziare immediatamente l'inoculazione intranasale. Per eseguire l'erogazione intranasale, caricare la micropipetta con due microlitri di soluzione complessa di siRNA RVG9R. Tenere la pipetta nella mano dominante e sostenerla con l'altra mano per evitare movimenti incontrollati durante la somministrazione di siRNA.
Posizionare circa una goccia a due microliter molto vicino a una narice in modo che il mouse possa inalare direttamente. Se una piccola goccia non è facilmente formabile, sostituire la punta della pipetta con una nuova e ripetere l'operazione. Spingere delicatamente la testa del mouse verso il basso con l'indice per cinque secondi mentre inala e mantiene la posizione.
Per prevenire il drenaggio del farmaco nei polmoni è importante spingere sedatamente la testa del mouse verso il basso con l'indice per cinque secondi mentre il mouse sta inalando. Inizia un cronometro per cronometrare da tre a quattro minuti dopo questa inoculazione del tempo nel secondo rullante del primo mouse. Questo intervallo di tempo è necessario affinché il mouse completi l'inalazione della prima dose e ripristini la respirazione normale.
Nell'intervallo da tre a quattro minuti tra l'inoculazione di nari alternativi sul primo mouse, l'inoculazione intranasale completa di un rullante in ciascuno dei restanti tre topi posti sul dispositivo. Quando il cronometro suona, inoculare la seconda narice sul primo mouse e ripetere la procedura per gli altri topi come sopra. Ripetere la procedura fino a quando i 20-30 microlitri vengono consegnati per tutti e quattro i topi.
Ci ranno dai 30 ai 45 minuti per completare l'intera procedura di inoculazione. Riporta gli animali nelle loro gabbie designate. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno ripreso sufficiente coscienza per mantenere la reclinanza sternale.
Per valutare il silenziamento genico, estrarre l'RNA da varie regioni cerebrali con un kit di purificazione dell'RNA, invertire la trascrizione in cDNA usando un kit di sintesi cDNA ed eseguire qPCR con coppie di primer. La maggior parte della consegna cerebrale del peptide RVG9R etichettato con Alexa Fluor 488 è stata testata per la prima volta utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse descritto qui. A 48 ore dall'inoculazione, vari organi sono stati asportati per misurare la fluorescenza A488.
Nulla è stato rilevato in nessuno degli organi nei controlli negativi. D'altra parte, un forte segnale fluorescente A488 è stato rilevato esclusivamente nel cervello del gruppo inoculato RVG9R. Inoltre, la posizione di posizionamento del mouse è stata confrontata con il metodo di posizione supina e il metodo awake per l'efficacia.
I risultati hanno indicato che il posizionamento dei topi a testa in giù e in avanti ha migliorato la penetranza e la deposizione di RVG9R A488 in tutto il tessuto cerebrale. Per confermare ulteriormente la consegna di siRNA al cervello, è stata eseguita una scansione cerebrale completa dopo una singola somministrazione intranasale di RVG9R complessa a SiRNA etichettato Cy5. In contrasto con PBS o RVM9R, la complessità con RVG9R ha portato a un forte accumulo di siRNA nelle principali regioni cerebrali tra cui il bulbo olfattivo, la corteccia, l'ippocampo, il talamo, l'ipotalamo, il cervello medio e il cervelletto.
Il dispositivo di posizionamento può essere utilizzato per la consegna di farmaci o molecole al SNC del topo. Le applicazioni si estendono al test delle terapie e all'esame dei meccanismi cellulari nel SNC. Questo dispositivo di posizionamento è stato utilizzato dagli investigatori per dimostrare la potenza dei siRNA nel trattamento della malattia del virus del Nilo occidentale, nonché per esplorare terapie per altre malattie del SNC.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso di un dispositivo di posizionamento del mouse per la somministrazione intranasale di una formulazione peptidica-siRNA mirata al cervello, facilitando un efficace silenziamento genico nel sistema nervoso centrale. Il metodo migliora l'efficienza e la riproducibilità riducendo al minimo la manipolazione del mouse.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Terapia genica
- Consegna biomolecolare
Sfondo
- La somministrazione intranasale è una via promettente per terapie mirate al sistema nervoso centrale.
- Tecniche di somministrazione efficienti sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili.
- La posizione del topo può influenzare l'efficacia della somministrazione del farmaco.
- Il silenziamento genico mediante siRNA è uno strumento prezioso nella ricerca neuroscientifica.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo per la somministrazione intranasale efficace di siRNA al sistema nervoso centrale del topo.
- Valutare l'impatto della posizione del topo sull'efficienza della somministrazione del farmaco.
- Dimostrare l'utilità del dispositivo di posizionamento nelle applicazioni di terapia genica.
Metodi Utilizzati
- Valutazione del livello di anestesia nei topi prima del posizionamento.
- Utilizzo di un dispositivo di posizionamento per fissare i topi in una posizione rilassata.
- Inoculazione intranasale di soluzione complessata con siRNA.
- Estrazione dell'RNA e qPCR per valutare l'efficacia del silenziamento genico.
Risultati principali
- Silenziamento genico significativo osservato nelle regioni cerebrali dopo l'inoculazione.
- Consegna migliorata di siRNA mediante l'utilizzo del dispositivo di posizionamento rispetto ad altri metodi.
- Fortissima fluorescenza rilevata nei cervelli dei topi trattati, indicativa di una consegna avvenuta con successo.
- La posizione con la testa inclinata verso il basso ha migliorato la penetrazione e il deposito della formulazione di siRNA.
Conclusioni
- Il dispositivo di posizionamento del mouse è efficace per la somministrazione di farmaci al sistema nervoso centrale.
- Questo metodo può essere applicato a diversi contesti terapeutici e di ricerca.
- Ulteriori studi possono esplorarne l'uso nel trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'amministrazione intranasale efficiente di terapie mirate al sistema nervoso centrale rimane un collo di bottiglia fondamentale nello sviluppo preclinico delle neuroscienze e della terapia genica. Questo dispositivo di posizionamento consente un'amministrazione standardizzata e ad alta produttività di biomolecole come siRNA, peptidi o nanoparticelle al cervello del topo, migliorando la riproducibilità e riducendo la variabilità negli studi sull'interazione con il bersaglio. Sostenendo un posizionamento costante della testa in basso e in avanti, aumenta l'affidabilità predittiva dell'assorbimento nel sistema nervoso centrale e riduce i rischi associati allo sviluppo traslazionale di candidati terapeutici somministrati per via intranasale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette un'analisi precisa delle ipotesi terapeutiche assicurando un'erogazione riproducibile di composti attivi sul sistema nervoso centrale, come i complessi RVG9R-siRNA.
- Valore operativo: Riduce la variabilità dipendente dall'operatore nella somministrazione del dosaggio, favorendo valutazioni affidabili dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
- Conferma predittiva: Migliora la coerenza dei risultati dei biomarcatori, come il silenziamento genico o la riduzione proteica, tra i diversi gruppi di trattamento.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici standardizzati per analisi successive, garantendo una somministrazione uniforme del composto al sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità dei saggi attraverso un posizionamento controllato degli animali e una riduzione dello stress da manipolazione.
- Riutilizzo della piattaforma: Consente la valutazione di diverse modalità terapeutiche, inclusi siRNA, nanoparticelle e anticorpi, per la somministrazione al sistema nervoso centrale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia consentendo una somministrazione costante a regioni cerebrali chiave coinvolte nei modelli di neurodegenerazione o di infezione virale.
- Valore operativo: Permette un test rapido di candidati terapeutici attraverso l'elaborazione parallela di fino a otto topi per sessione.
- Avanzamento basato sulla valutazione del rischio: Supporta le decisioni di prosecuzione o interruzione dello sviluppo migliorando la fiducia nei dati relativi all'esposizione al sistema nervoso centrale e alla modulazione del bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il dispositivo si integra nel flusso di lavoro di scoperta, dalla validazione iniziale del target fino all'ottimizzazione del composto promettente, sostenendo valutazioni affidabili sulla somministrazione al sistema nervoso centrale prima degli studi abilitanti all'IND.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo una somministrazione costante di siRNA o terapie peptidiche per validare la modulazione del bersaglio in vivo.
- Screening: Migliora la prontezza e la riproducibilità dei saggi standardizzando il posizionamento degli animali durante la somministrazione intranasale di composti.
- Analisi: Permette il confronto quantitativo dell'assorbimento nel SNC mediante lettura di fluorescenza, qPCR o biomarcatori tra diversi gruppi di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica migliorando l'affidabilità delle metriche di somministrazione al SNC utilizzate negli studi di determinazione del dosaggio e di efficacia.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per valutare diverse modalità mirate al SNC in diversi progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nel rilascio al sistema nervoso centrale e nel legame al bersaglio riducendo la variabilità procedurale.
- Valore operativo: Migliora la produttività e la standardizzazione, riducendo il tempo di manipolazione diretta e la dipendenza dai tecnici.
- Valore strategico: Favorisce decisioni più accurate su prosegui/non prosegui migliorando la qualità dei dati e riducendo i falsi negativi nei saggi di somministrazione al sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati terapeutici intranasali adeguata al rischio, basata su dati riproducibili sull'assorbimento nel sistema nervoso centrale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una formazione nella valutazione dell'anestesia e nel corretto fissaggio dell'animale per garantire comfort e posizionamento adeguato.
- Presuppone l'accesso a strumenti per la somministrazione intranasale, come micropipette e punte sterili, per una formazione costante delle gocce.
- Necessita di standardizzazione tra i vari operatori per assicurare un posizionamento uniforme della testa in basso e in avanti, nonché tempi costanti tra le inoculazioni nelle narici.
- Deve essere adattato per diverse ceppi o dimensioni di topi, utilizzando regolazioni dell'altezza e dell'inclinazione della sedia.
- Limitato a procedure che richiedono una somministrazione intranasale precisa; non adatto a vie di somministrazione endovenosa o orale.
