Name: Un dispositivo di posizionamento per il posizionamento dei topi durante la consegna del siRNA intranasale al sistema nervoso centrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Scopri il protocollo per la somministrazione intranasale di siRNA al sistema nervoso centrale dei topi utilizzando un dispositivo di posizionamento. Questo metodo migliora l'efficienza e la riproducibilità del silenziamento genico.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Salute & Welfare della Corea (HI17C1046) a S.K.L.

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati nel rispetto delle linee guida e dei protocolli approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Hanyang. In questo protocollo, sono stati utilizzati topi di balb/c di 6 settimane del peso di 20-25 g (n - 3 per gruppo). Gli animali sono stati alloggiati in una struttura senza agenti patogeni con 12 h cicli di luce / buio a una temperatura controllata e livello di umidità con libero accesso all'acqua e al cibo.
1. Assemblaggio del dispositivo
<ol><li>Assemblare le singole parti del dispositivo di posizionamento come illustrato nella Figura 1A. NOTA: Il dispositivo è fornito in singole parti che possono essere facilmente assemblate e smontate.</li>
</ol>2. Impostazione del materiale
NOTA: La somministrazione IN di farmaci liquefatti richiede le seguenti fasi di pretrattamento.
<ol><li>Preparare i materiali necessari, tra cui il dispositivo di posizionamento, una micropipetta da 10,L, punte di micropipette 10,luna, una soluzione di trattamento (ad esempio, complesso RVG9R-siRNA), un orologio timer e il 70% di etanolo (fare riferimento alla Figura 2A).</li>
	<li>Collegare il codice di alimentazione per accendere il sistema di riscaldamento del dispositivo almeno 15-20 min prima dell'esperimento. La temperatura ottimale per gli esperimenti sugli animali viene mantenuta automaticamente a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare l'anestesia ketamina:xylazina:salina tamponata da fosfato (PBS) a un rapporto di 1:0.5:8.5 e anestesizzare ogni topo con una singola iniezione intraperitoneale (i.p.) in un volume finale di 200 . NOTA: Si prega di notare che qualsiasi farmaco ottimizzato per garantire la condizione di anestesia per un periodo di 30-45 min può essere utilizzato.</li>
</ol>3. Posizionamento del mouse
<ol><li>Valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale (pizzico dell'aldino) per mantenere il piano chirurgico.</li>
	<li>Posizionare il dispositivo di posizionamento a una distanza e un'altezza appropriate in modo da garantire un comodo accesso a tutti i reagenti necessari.</li>
	<li>Una volta che i topi sono adeguatamente anestesizzati, sollevare delicatamente ogni mouse dalla mischia del collo con il pollice e il dito del puntatore e posizionarlo sulla sedia designata.</li>
	<li>Il corretto posizionamento del mouse sulla sedia è molto importante in questa fase. Posare la schiena del mouse parallelamente al supporto posteriore della sedia, e a 90 gradi sul sedile della sedia. Sollevare le mani dal mouse e lasciare che l'animale si trovi naturalmente nella posizione della testa verso il basso e in avanti, senza premere o premendo, come mostrato nella Figura 2B. Assicurati che gli arti anteriori del mouse forniscano un supporto naturale mentre l'animale si trova in questa posizione rilassata, senza alcun disagio per il mouse.</li>
	<li>Una volta che i topi sono posizionati correttamente, allacciare i topi con la cintura della sedia e avviare immediatamente l'inoculazione dell'IN.</li>
</ol>4. Consegna intranasale
NOTA: Questo protocollo descrive la consegna IN dei complessi RVG9R:siRNA utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse. Utilizzando questo protocollo, un massimo di 20-30 l di soluzione può essere facilmente somministrato a ogni mouse in 2 gocce l. Questo volume è inferiore a quello della cavità nasale del topo, che è 0,032 cm3, quindi la procedura non si traduce in un'ostruzione letale della narice o asfissia. Questo protocollo consente l'inoculazione simultanea di almeno quattro topi e un massimo di otto topi per dispositivo, con conseguente ottimizzazione del tempo e variabilità ridotta.
<ol><li>Prendere la micropipetta 10 L e regolarla a 2.</li>
	<li>Caricare la micropipetta con 2-L di RVG9R:siRNA complexed con 270 g di RVG9R complesso con 104 g di RVG9R per l'esperimento di erogazione e 13,5 g di siSOD1 complesso con 270 g di RVG9R per l'esperimento di silenziamento, in un volume finale di 25L di PBS 5% di glucosio.</li>
	<li>Tenendo la pipetta nella mano dominante, regolare la posizione posizionando un gomito sul piano della panca. Sostenere la mano tenendo la pipetta con l'altra mano per evitare movimenti incontrollati durante la somministrazione.</li>
	<li>Posizionare una goccia di 2 dollari molto vicino a una narice in modo che il mouse possa inalare direttamente la goccia (fare riferimento alla figura 2B). Se una piccola goccia non è facilmente formata, quindi sostituire la punta pipetta con una nuova e ripetere l'operazione. Utilizzare il cronometro per verificare l'intervallo di tempo tra le vaccinazioni.</li>
	<li>Questo dispositivo consente il trattamento di almeno quattro topi alla volta. Se è necessario un altro gruppo di topi per ripetere il passaggio 4.4, impostare un'altra barra con quattro sedie sopra o sotto la prima battuta con quattro sedie per ospitare fino a otto mouse alla volta sul dispositivo.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.4 con l'altra narice dopo 3-4 min dalla prima inoculazione. Questo intervallo di tempo è sufficiente per il mouse per completare l'inalazione della prima dose e ripristinare la respirazione normale. Se una goccia della soluzione inalata viene slogata a causa di sbuffi accidentali dal naris del mouse, reinoculare altri 2 - L.</li>
	<li>Ripetere l'intero processo con narici alternate fino a quando la dose di 20-30 gradi è terminata. Ci vorranno 30-45 minuti per completare l'intera procedura di inoculazione.</li>
	<li>Mettere unguento bagnato sugli occhi dei topi prima di riportare i topi alle loro gabbie designate. NOTA: Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente consapevolezza per mantenere la recumbenza sternale.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
<ol><li>Per confermare la deposizione cerebrale di RVG9R con etichetta fluor, anestesizzare i topi (come descritto al punto 2.3) e isolare il cervello, così come altri organi periferici, come polmone, fegato, milza e rene. Posiziona ogni organo su ImageStation e visualizza la fluorescenza usando ImageStation.</li>
	<li>Per visualizzare la fluorescenza dovuta all'etichetta Cy5, preparare criosezioni spesse 20 m, coindate con Hoechst 33342, ed eseguire la scansione a tutto il cervello con un microscopio confocale.</li>
	<li>Per valutare il silenziamento genico, estrarre RNA da varie regioni del cervello, come il bulbo olfattivo, la corteccia, l'ippocampo, il talamo, l'ipotalamo, il cervelletto e il tronco encefalico, con un kit di purificazione dell'RNA, inversi in cDNA utilizzando un cDNA kit di sintesi ed eseguire qPCR con coppie di primer come descritto in precedenza15.</li>
</ol>

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</ol>

P.K. e S.K.L. sono co-fondatori di Signet Biotech. P.K. è coinventor del brevetto PCT/US07/12,152, che include in parte reclami relativi a RVG9R. I.U., K.C., P.K., e S.K.L. sono elencati come coinventori di un brevetto inviato (PCT/KR2016/014220), che include indicazioni relative a un dispositivo di posizionamento del mouse.

Abbiamo sviluppato un dispositivo di posizionamento del mouse per posizionare in modo ottimale i topi per la somministrazione da naso a cervello delle terapie. Il dispositivo è dotato di diverse funzionalità, garantendo la facile manipolazione simultanea degli animali. È inoltre dotato di cuscinetti riscaldanti per il mantenimento delle temperature fisiologiche del corpo degli animali durante la sperimentazione. I topi anestesizzati possono essere mantenuti nella posizione della testa verso il basso e in avanti per mezzo di sedie appositamente progettate, con il minimo disagio per gli animali. L'altezza delle sedie di posizionamento può essere regolata in modo tale da poter visualizzare le narici animali durante la somministrazione di farmaci.
In la somministrazione cerebrale ha diverse limitazioni intrinseche, tra cui la piccola superficie delle narici (che consente volumi massimi di 20-30 L per somministrazione), irritazione nasale, danni all'epitelio e assorbimento limitato attraverso l'epitelio nasale18. La somministrazione di farmaci ai topi posizionati nella posizione supina è stata utilizzata per la somministrazione del cervello facendo cadere farmaci liquidi nelle nare alternative degli animali tramite pipetta o tubi in poliuretano (24 G x 19 mm) collegati a siringhe microliter19, 20.Sebbene l'uso di sistemi di tubazione per rilasciare farmaci vicino all'epitelio olfattivo sia un approccio potenzialmente adatto, provoca irritazione o infiammazione nasale dopo la somministrazione ripetitiva. Inoltre, le piccole dimensioni della cavità nasale limitano questo approccio, soprattutto nei topi che possono essere superati ripetendo, così come dalle formulazioni farmacologiche che persistono nella mucosa nasale. Un'altra opzione è la somministrazione di terapie ai topi svegli10. Tuttavia, questo approccio richiede procedure qualificate per la movimentazione degli animali durante l'inoculazione dell'INoculazione. Inoltre, provoca stress animale e, quindi, non è ideale per i modelli di malattia, in particolare i modelli di malattia infettiva. Inoltre, il dosso incoerente può facilmente derivare dal drenaggio della droga nei polmoni o nello stomaco a causa di impugnatura animale imperfetta. L'approccio qui presentato consente agli scienziati di superare queste barriere tecniche. La posizione della testa verso il basso e in avanti riduce la possibilità di fuoriuscita di farmaci dal naso ai polmoni durante l'inalazione, favorendo la consegna diretta e selettiva del siRNA al cervello. IN consegna utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse non richiede alcuna tecnica specializzata per la manipolazione o afferrare gli animali durante l'inoculazione. Quattro animali alla volta possono essere trattati per un periodo di almeno 30-45 min. La procedura può essere scalata includendo una barra a quattro sedie supplementare, consentendo una facile gestione di un massimo di otto topi nella stessa sessione sperimentale. Pertanto, seguendo questo metodo, un singolo operatore può indurre la somministrazione di farmaci al cervello di grandi gruppi di animali per lunghi periodi di tempo.
La struttura anatomica della cavità nasale influenza fortemente la consegna naso-cervello (come recensito da Merkus et al.11 e Ruigrok e de Lange21). La superficie relativa della cavità nasale nei topi è 15 volte più grande di quella degli esseri umani e la superficie relativa dell'epitelio olfattivo è 6 volte più grande. Anche se ci sono differenze significative nell'anatomia della cavità nasale negli esseri umani ai roditori, ci sono circa 45 studi clinici in corso utilizzando l'approccio IN per il trattamento di diversi disturbi cerebrali (www.clinicaltrials.gov). Lo studio qui presentato indica che quando si utilizza la consegna IN di terapie, gli scienziati dovrebbero prendere in considerazione diversi fattori, come la posizione della testa, dormire, e agenti di consegna adeguati.
Abbiamo mostrato la deposizione efficiente e specifica di siRNA fluorescente al cervello del topo. Inoltre, la diminuzione significativa nell'espressione genica di SOD1 osservata dopo che la somministrazione di SIRNA ha confermato gli effetti funzionali. In precedenza abbiamo dimostrato in modo coerente che la somministrazione DI complessi RVG9R-siRNA mirati all'RNA del virus del Nilo Occidentale (WNV) esercita un forte effetto terapeutico sull'encefalite WNV15. In particolare, la somministrazione di siRNA da naso a cervello richiedeva un ligando mirante alle cellule (RVG) e una molecola carica positivamente (9R) a siRNA complessi. In assenza di questi elementi, le molecole sono state sgomberate attraverso il circuito sistemico e i vasi linfatici 48 h dopo il trattamento (Figura 3A)15. Pertanto, nella configurazione sperimentale descritta qui, abbiamo esaminato la localizzazione di peptidi/siRNA 48 h dopo l'inoculazione per l'immagine solo i livelli mantenuti specificamente nel cervello. Questo approccio potrebbe essere facilmente implementato per la consegna di altre molecole, come proteine, peptidi e nanoparticelle, o altre terapie, per il trattamento di una serie di disturbi correlati al cervello.

Il BBB impedisce alle molecole somministrate sistemicamente di >400-600 Da di entrare nel cervello, ponendo una sfida significativa per la consegna di biomolecole terapeutiche per malattie che colpiscono il SNC e il cervello1. La somministrazione diretta di farmaci al cervello può essere ottenuta mediante iniezione stereotassica; tuttavia, questo richiede esperienza chirurgica ed è altamente limitato nella consegna ad aree prossimali al sito di iniezione, rendendolo inadatto per l'uso clinico di routine2. IN consegna al cervello può anche provocare la consegna diretta del cervello bypassando il BBB, consentendo il trasferimento diretto e rapido di una varietà di sostanze al cervello3,4. Questo trasferimento è pensato per avvenire dai meccanismi di trasporto attraverso i nervi olfattivi e trigeminici che collegano il passaggio nasale al cervello, il liquido cerebrospinale e i sistemi linfatici5. Poiché il percorso diretto naso-cervello non coinvolge organi e tessuti periferici, riduce sostanzialmente gli effetti collaterali sistemici e migliora la potenza. La somministrazione in sede è una promettente alternativa non invasiva alle vie locali e sistemiche per la fornitura di agenti terapeutici e può rappresentare un potente approccio per combattere i disturbi neurologici, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e cancro al cervello, ed è in fase di esplorazione in diversi studi clinici6,7,8.
Diversi fattori sperimentali, come il volume e il metodo di inoculazione, così come il pH di formulazione, influenzano fortemente la somministrazione di farmaci al SNC attraverso il percorso naso-cervello9. Negli studi con i topi, il successo della somministrazione di farmaci IN dipende fortemente dal corretto posizionamento della testa, che è fondamentale per una deposizione efficiente del cervello ed evitare il drenaggio dei farmaci nell'ambiente esterno o nelle vie aeree. In particolare, la maggior parte degli studi sui roditori impiegano una posizione di testa-indietro (supina) con un'inclinazione di 70-90 gradi per la somministrazione di farmaci all'epitelio olfattivo, anche se il posizionamento della testa a 0 o può favorire il drenaggio nella trachea9. Nella somministrazione di farmaci nei topi che sono svegli si traduce in una deposizione cerebrale ridotta rispetto a qualsiasi applicazione nella posizione supina, principalmente a causa dell'incapacità degli scienziati di tenere i topi nella posizione desiderata per lunghi periodi di tempo. Inoltre, la posizione capovolta richiesta dal metodo di impugnatura cutanea impiegato per i topi svegli provoca una deposizione di farmaci prevalentemente nel nervo trigemino e nel bulbo olfattivo, nonché negli organi periferici, come reni e polmoni, entro 30 min postinoculazione10. La posizione del corpo più appropriata per la somministrazione di terapie attraverso i nervi olfattivi o trigemini in animali più grandi come i primati non umani negli studi clinici sembra essere la posizione di testa in basso e in avanti (cioè, la cosiddetta "preghiera alla Mecca posizione")11. Tuttavia, questa posizione non è stata ben studiata nel modello del mouse, e la posizione supina è più ampiamente utilizzata negli studi sui roditori.
In precedenza, abbiamo dimostrato che il RVG9R, un peptide progettato sulla base del dominio di legame recettore minimo del virus della rabbia, mostra il tropismo alle cellule che esprimono sottounità di recettori dell'acetilcolina nicotinica come neuroni e macrofagi e media consegna intracellulare di siRNA mediante un meccanismo che coinvolge l'impegno del recettore e la delocalizzazione temporanea della membrana plasmatica nel sito dell'aggregazione del recettore12,13. È importante sottolineare che la somministrazione endovenosa sistemica dei complessi RVG9R-siRNA consente la somministrazione transvascolare di siRNA nel CNS14. Tuttavia, la rotta sistemica diluisce la quantità di siRNA consegnata al SNC, e dati recenti dimostrano che la gestione IN dei complessi RVG9R:siRNA ai topi posizionati nella posizione della testa verso il basso e in avanti suscita un knockdown genico bersaglio diffuso più regioni del cervello15. È importante sottolineare che questo livello di knockdown è stato raggiunto con appena 13,5 g di siRNA somministrati su un regime di quattro dosi, 2 giorni mentre il percorso IV richiede una dose 5 volte superiore per iniezione per ottenere un knockdown comparabile. L'unico difetto dell'approccio IN è che si tratta di una procedura ardua, che richiede l'uso di entrambe le mani durante la somministrazione della soluzione, mentre afferra continuamente i topi in alternativa nella testa verso il basso e in avanti e in posizioni rilassate tra inalazione per un periodo di trattamento prolungato (una procedura di 30-45 min per l'effettiva assunzione di un volume da 20 a 30 dollari per topo). L'utilizzo del dispositivo di posizionamento del mouse qui presentato consente il corretto posizionamento dei topi con poca costrizione fisica agli animali e al personale che esegue il protocollo, nonché il trattamento di più coorti di topi entro un periodo di tempo ragionevole, consentendo uno studio approfondito sull'utilizzo dei siRNA come terapia per l'encefalite del Nilo occidentale nei topi nelle fasi tardive della malattia15.

<table><tbody><tr><td>Comercial assays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript kit di sintesi del cDNA</td><td>BioRad</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>RNAiso plus</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# 9108</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq</td><td>TaKaRa Bio</td><td>Cat# RR420A</td><td></td></tr><tr><td>Dyes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# A30052</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo di topo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>Orient Bio</td><td>N/A</td><td>6-8 settimane, 20-30g</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi e primer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human CD4</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>Senso: 5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3'</td></tr><tr><td>siSOD1</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>Senso: 5'-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'</td></tr><tr><td>Primer GAPDH</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>F: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3' R: 5'-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3'</td></tr><tr><td>Primer SOD1</td><td>ST Pharm</td><td>N/A</td><td>F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'</td></tr><tr><td>Peptides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RVG9R</td><td>Peptron</td><td>N/A</td><td>YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR</td></tr><tr><td>RVM9R</td><td>Peptron</td><td>N/A</td><td>MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRRRR</td></tr><tr><td>Software, algoritmi e dispositivi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software 4.3</td><td>FlowJO, LLC</td><td>N/A</td><td>http://docs.flowjo.com/vx/</td></tr> <tr><td>Dispositivo di posizionamento del mouse</td><td>Signet Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software prismatico</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td></tr> <tr><td>Software prisma</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/</td></tr></tbody></table>

un dispositivo di posizionamento per il posizionamento dei topi durante la consegna del sirna intranasale al sistema nervoso centrale

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

La somministrazione di farmaci intranasali (IN) al cervello è emersa come un metodo promettente per aggirare la barriera emato-encefalica (BBB) per la somministrazione di farmaci nel sistema nervoso centrale (SNC). Recenti studi dimostrano l'uso di un peptide, RVG9R, incorporando il dominio minimo di legame recettore della glicoproteina del virus rabies, nell'insorgere la consegna di siRNA nei neuroni nel cervello. In questo protocollo, la formulazione del peptide-siRNA viene consegnata intranasalmente con una pipetta nella mano dominante, mentre il topo anestetica viene trattenuto dalla mischia con la mano non dominante in una "testa in basso e in avanti" per evitare il drenaggio nel polmone e stomaco dopo l'inalazione. Questa presa precisa di topi può essere appresa, ma non è facile e richiede pratica e abilità per portare a un efficace assorbimento del SNC. Inoltre, il processo è a lungo disegnato, richiedendo circa 45 min per l'amministrazione di un volume totale di 20-30 dollari l di soluzione in 1-2 volumi di gocciolina per inalazione, con 3-4 min di periodi di riposo tra ogni inalazione. L'obiettivo di questo studio è quello di rivelare un dispositivo di posizionamento del mouse che consente il posizionamento appropriato dei topi per una somministrazione efficiente della formulazione di peptide-siRNA. Molteplici caratteristiche sono incorporate nel design del dispositivo, come quattro o otto sedie di posizionamento con altezza e inclinazione regolabili per frenare i topi anestesizzati nella posizione della testa verso il basso e in avanti, consentendo una facile visualizzazione delle noci dei topi e cuscinetto di riscaldamento integrato per mantenere le temperature corporee dei topi durante la procedura. È importante sottolineare che la capacità di trattare quattro o otto topi contemporaneamente con complessi RVG9R-siRNA in questo modo consente studi su una scala temporale molto più veloce, per la sperimentazione di un approccio siRNA terapeutico IN. In conclusione, questo dispositivo consente un posizionamento appropriato e controllato della testa del topo per l'applicazione IN del siRNA RVG9R e di altre molecole terapeutiche, come nanoparticelle o anticorpi, per la somministrazione del SNC.

Posizione di testa durante la somministrazione IN è una grande influenza sull'efficienza della somministrazione di droga al cervello. Qui abbiamo descritto la posizione testa verso il basso e in avanti utilizzando un dispositivo di posizionamento del mouse per la somministrazione IN di una formulazione peptide-siRNA mirata al cervello per la consegna della miscela al SNC del topo. Per verificare la consegna attraverso il percorso IN, abbiamo usato il peptide RVG9R, precedentemente indicato per legarsi in modo efficiente alle cellule neuronali sia in vitro che in vivo14,16.
Abbiamo prima testato la consegna naso a cervello del peptide RVG9R etichettato con Alexa Fluor 488 (RVG9R-A488) utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse descritto qui. A 48 h postinoculazione, vari organi, tra cui il cervello, il seno, polmoni, il fegato, la milza, e reni sono stati ascisi per misurare tessuto associato A488 fluorescenza. Un488 da solo, o un peptide di controllo (RVM9R-A488)14 che non lega nAchR, sono stati utilizzati come controlli negativi. Come previsto, né A488 né RVM9R-A488 sono stati rilevati in uno qualsiasi degli organi a postinoculation 48 h (Figura3A, a sinistra). D'altra parte, un forte segnale fluorescente A488 è stato rilevato esclusivamente nel cervello del gruppo rinoculato RVG9R. Inoltre, abbiamo confrontato questa posizione di posizionamento del mouse con il metodo di posizione supina che è stato utilizzato in precedenza17, così come al metodo di risveglio, per l'efficacia. Abbiamo inoculato una quantità fissa di RVG9R-A488 (100 g) e abbiamo esaminato la biodistribuzione a 48 h di postinoculation. I risultati hanno indicato che il posizionamento dei topi a testa in giù e in avanti ha migliorato la penetrazione e la deposizione di RVG9R-A488 in tutto il tessuto cerebrale (Figura 3A, a destra). Al contrario, gli animali inoculati in una posizione supina hanno portato alla consegna di RVG9R-A488 al cervello, ma non così forti come si vede con il metodo del dispositivo di posizionamento. Per confermare ulteriormente la distribuzione del siRNA al cervello, abbiamo eseguito la scansione a tutto il cervello dopo una singola somministrazione IN di RVG9R complessa a 400 pmol (5,2 g) di siRNA con etichetta Cy5. A differenza di PBS o RVM9R, il complesso con RVG9R ha provocato un forte accumulo di siRNA nelle principali regioni cerebrali, tra cui il bulbo olfattivo, la corteccia, l'ippocampo, il talamo, l'ipotalamo, il cervello e il cervelletto (Figura3B ).
Infine, abbiamo impiegato l'analisi RT-qPCR per verificare la consegna intracellulare di siRNA funzionale mirato al gene dismutasi-1 superossido (SOD1). I topi sono stati inoculati intranasalmente per 3 volte in giorni consecutivi con RVG9R:siSOD1 (13,2 g di siRNA), e l'espressione dell'mRNA SOD1 è stata analizzata 24 h dopo l'ultima inoculazione. La somministrazione di RVG9R:siSOD1 ha comportato una sostanziale riduzione dell'espressione SOD1 nel bulbo olfattivo (63%), nella corteccia (47%), nell'ippocampo (61%), nel talamo (53%), nell'ipotalamo (55%), nel cervello medio (39%) e nel cervelletto (30%) (Figura 4). In conclusione, l'uso di un dispositivo di posizionamento consente una facile inoculazione del siRNA con complessità RVG9R nei topi, con conseguente erogazione di siRNA specifica del cervello che induce il silenziamento funzionale del gene bersaglio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig1.jpg"> Figura 1 : presentazione fotografica dell'assieme del dispositivo. Le sedie di posizionamento sono assemblate sul supporto all'altezza appropriata con viti. Dopo l'assemblaggio, il dispositivo è collegato a un alimentatore per il riscaldamento alla temperatura fisiologica durante l'inoculazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig2.jpg"> Figura 2 : presentazione fotografica della procedura di inoculazione utilizzando il dispositivo di posizionamento. (A) Attrezzature sperimentali necessarie per l'inoculazione. (B) Animali nella posizione di testa in basso e in avanti seduti sul dispositivo (a sinistra) e la deposizione di una goccia da 2 posti per l'inoculazione IN (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig3.jpg"> Figura 3 : Distribuzione di peptidi e siRNA fluorescenti dopo la somministrazione IN. (A) Biodistribuzione del peptide RVG9R inoculato intranasale a 48 h dopo una singola inoculazione di IN. Il cervello e altri organi periferici sono stati valutati per la presenza di fluorescenza nei topi inoculati con salina (PBS), A488, RVM-A488e RVG-A488 (sinistra). Imaging dei topi trattati come accennato sopra mentre sono svegli, in posizione supina e nel posizionamento del mouse concepito nella posizione della testa verso il basso e in avanti (a destra). (B) Biodistribuzione del complesso RVG9R:siRNA nel cervello (n - 3 per gruppo). La distribuzione del siRNA con etichetta tura Cy5 è stata visualizzata in criosezioni cerebrali complete con un microscopio laser confocale in animali inoculati con salina (PBS), siRNA complessi con peptide di controllo (RVM9R-siCy5) o peptide RVG9R (RVG9R-siCy5). La barra della scala rappresenta 1 mm. Abbreviazioni: o.b - lampadina olfattiva; ctx - corteccia; ippopotamo - ippocampo; ipo - ipotalamo; tha - talamo; m.b - midbrain; cerrivello - cervelletto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59201/59201fig4.jpg"> Figura 4 : In applicazione di RVG9R:siSOD1 induce il silenziamento genico bersaglio in più regioni del cervello. Analisi qPCR per murine SOD1 mRNA nelle regioni cerebrali indicate 24 h dopo l'ultima inoculazione IN di salina (PBS), RVG9R:siCD4 (siCD4), RVM9R:siSOD1 (RVM9R) e RVG9R:siSOD1 (RVG9R). Viene mostrato il silenziamento SOD1 relativo nel bulbo olfattivo, nella corteccia, nell'ippocampo (superiore), nel talamo, nell'ipotalamo, nel cervelletto (al centro) e nel midbrain (inferiore). I dati rappresentano la media : SD relativa a GAPDH dopo la normalizzazione con i dati corrispondenti di mouse trattati con salina (n - 3 per gruppo). Il cartone animato raffigura la percentuale di mRNA SOD1 nella regione del cervello indicata dopo l'inoculazione dell'IN è mostrata (in basso a destra). P &lt; 0,01, s&lt; 0,001. Abbreviazioni: o.b - lampadina olfattiva; ctx - corteccia; ippopotamo - ippocampo; ipo - ippocampo; tha - talamo; m.b - midbrain; cerrivello - cervelletto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59201/59201fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando un dispositivo di posizionamento del mouse che consente il posizionamento appropriato dei topi per la somministrazione intranasale di una formulazione di peptidi-siRNA mirata al cervello che consente un silenziamento genico efficace nel sistema nervoso centrale.

Un dispositivo di posizionamento per il posizionamento dei topi durante la consegna del siRNA intranasale al sistema nervoso centrale

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

Questo protocollo descrive in dettaglio l'uso di un dispositivo di posizionamento per la consegna intranasale di biomolecole al SNC del mouse. L'uso di questo dispositivo riduce significativamente la manipolazione dei topi e il tempo di trattamento con conseguente miglioramento dell'efficienza e della riproducibilità della tecnica. Per iniziare questa procedura, valutare il livello di anestesia dei topi per riflesso del pedale al fine di mantenere il piano chirurgico.Quindi, posizionare il dispositivo di posizionamento a una distanza e un'altezza appropriate per consentire un comodo accesso a tutti i reagenti richiesti. Quindi, applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Allaccia un mouse con cinture per sedie, assicurandoti che gli arti anteriori del mouse forniscano un supporto naturale mentre è in una posizione rilassata senza alcun disagio.Ripetere le procedure per i topi rimanenti. Posizionare delicatamente ogni mouse sulla sedia designata appoggiando lo schienale parallelo al supporto posteriore della sedia e a 90 gradi dal sedile della sedia. Lascia che l'animale giace naturalmente nella testa in posizione verso il basso e in avanti senza spingere o premere.Una volta che tutti i topi sono legati, iniziare immediatamente l'inoculazione intranasale. Per eseguire l'erogazione intranasale, caricare la micropipetta con due microlitri di soluzione complessa di siRNA RVG9R. Tenere la pipetta nella mano dominante e sostenerla con l'altra mano per evitare movimenti incontrollati durante la somministrazione di siRNA.Posizionare circa una goccia a due microliter molto vicino a una narice in modo che il mouse possa inalare direttamente. Se una piccola goccia non è facilmente formabile, sostituire la punta della pipetta con una nuova e ripetere l'operazione. Spingere delicatamente la testa del mouse verso il basso con l'indice per cinque secondi mentre inala e mantiene la posizione.Per prevenire il drenaggio del farmaco nei polmoni è importante spingere sedatamente la testa del mouse verso il basso con l'indice per cinque secondi mentre il mouse sta inalando. Inizia un cronometro per cronometrare da tre a quattro minuti dopo questa inoculazione del tempo nel secondo rullante del primo mouse. Questo intervallo di tempo è necessario affinché il mouse completi l'inalazione della prima dose e ripristini la respirazione normale.Nell'intervallo da tre a quattro minuti tra l'inoculazione di nari alternativi sul primo mouse, l'inoculazione intranasale completa di un rullante in ciascuno dei restanti tre topi posti sul dispositivo. Quando il cronometro suona, inoculare la seconda narice sul primo mouse e ripetere la procedura per gli altri topi come sopra. Ripetere la procedura fino a quando i 20-30 microlitri vengono consegnati per tutti e quattro i topi.Ci ranno dai 30 ai 45 minuti per completare l'intera procedura di inoculazione. Riporta gli animali nelle loro gabbie designate. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno ripreso sufficiente coscienza per mantenere la reclinanza sternale.Per valutare il silenziamento genico, estrarre l'RNA da varie regioni cerebrali con un kit di purificazione dell'RNA, invertire la trascrizione in cDNA usando un kit di sintesi cDNA ed eseguire qPCR con coppie di primer. La maggior parte della consegna cerebrale del peptide RVG9R etichettato con Alexa Fluor 488 è stata testata per la prima volta utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse descritto qui. A 48 ore dall'inoculazione, vari organi sono stati asportati per misurare la fluorescenza A488.Nulla è stato rilevato in nessuno degli organi nei controlli negativi. D'altra parte, un forte segnale fluorescente A488 è stato rilevato esclusivamente nel cervello del gruppo inoculato RVG9R. Inoltre, la posizione di posizionamento del mouse è stata confrontata con il metodo di posizione supina e il metodo awake per l'efficacia.I risultati hanno indicato che il posizionamento dei topi a testa in giù e in avanti ha migliorato la penetranza e la deposizione di RVG9R A488 in tutto il tessuto cerebrale. Per confermare ulteriormente la consegna di siRNA al cervello, è stata eseguita una scansione cerebrale completa dopo una singola somministrazione intranasale di RVG9R complessa a SiRNA etichettato Cy5. In contrasto con PBS o RVM9R, la complessità con RVG9R ha portato a un forte accumulo di siRNA nelle principali regioni cerebrali tra cui il bulbo olfattivo, la corteccia, l'ippocampo, il talamo, l'ipotalamo, il cervello medio e il cervelletto.Il dispositivo di posizionamento può essere utilizzato per la consegna di farmaci o molecole al SNC del topo. Le applicazioni si estendono al test delle terapie e all'esame dei meccanismi cellulari nel SNC. Questo dispositivo di posizionamento è stato utilizzato dagli investigatori per dimostrare la potenza dei siRNA nel trattamento della malattia del virus del Nilo occidentale, nonché per esplorare terapie per altre malattie del SNC.

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Un dispositivo di posizionamento per il posizionamento dei topi durante la consegna del siRNA intranasale al sistema nervoso centrale (Video) | JoVE Journal

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